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编号:10221855
噬菌体抗体库技术
http://www.100md.com 《福建医科大学学报》 1999年第1期
     作者:谢捷明 许建华

    单位:福建医科大学(福州 350004); 谢捷明 肿瘤研究室 许建华 临床药理研究所

    关键词:单链噬菌体;抗体,单克隆;组合抗体文库;噬菌体表面表达

    福建医科大学学报990144 1975年创立的B淋巴细胞杂交瘤技术[1],使第一代抗体-血清多克隆抗体发展到了第二代抗体-单克隆抗体(McAb),并在医学和生物学领域得到广泛应用。但鼠源 McAb对人体具有免疫原性,而杂交瘤技术制备人源McAb未获进展,这就极大地限制了McAb作为治疗制剂在人体内的应用。80年代中期以来产生和发展的第三代抗体-基因工程抗体,包括两部分内容:一是用DNA重组技术对已有的鼠McAb进行“人源化”和“小型化”的改造;二是用抗体库技术筛选、克隆新的McAb[2,3]

    噬菌体抗体是指在膜表面表达有单链抗体或抗体Fab段的单链噬菌体。用基因克隆技术将B细胞全套可变区基因克隆出来,组装到表达载体内并表达到噬菌体表面成为噬菌体抗体的群体,即为噬菌体抗体库;通过“吸附-洗脱-扩增”的富集过程,从中筛选特异性抗体的可变区基因。噬菌体抗体库技术使基因工程抗体得到突破性进展,可用来制备人源单抗,是一项极具潜力的生物技术。本文综述该技术的产生、发展和应用前景。
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    l 噬菌体抗体库技术的产生

    噬菌体抗体库技术的产生依赖以下三项实验技术的进展。第一是PCR技术的发展使人们可以用一组引物克隆出免疫球蛋白的全套可变区基因,特别是RT-PCR的应用,使克隆出具有转录活性的可变区基因变得简捷、有效。目前有多套扩增可变区基因的引物,如以FRl和FR4保守序列为基础的引物、以前导序列为5’端和J片段为3’端的引物、以FR1为5’端和CH1或J片段为3’端的引物等等。各引物的两端分别设有合适的酶切位点,以便于克隆。第二是从大肠杆菌分泌有结合功能的免疫球蛋白分子片段获得成功[4,5]。抗体分子的抗原结合部位是由轻链和重链组成,依赖于复杂的立体结构。在淋巴细胞内这一立体结构是在粗面内质网内形成的,而在原核生物-大肠杆菌细胞壁的质周腔可提供类似粗面内质网的环境。在免疫球蛋白的可变区基因5’端加入细菌蛋白的信号序列,则所表达的可变区分子在细菌信号肽的引导下可分泌到质周腔,并在那里进行立体折叠、二硫键形成和肽链的双体化,成为有抗原结合活性的抗体分子片段。这就使得在原核细胞中用抗体库筛选特异性抗体成为可能。第三是噬菌体表面表达技术的建立[6]:即将肽链通过与单链噬菌体外壳蛋白(蛋白Ⅲ或蛋白Ⅷ),融合表达在单链噬菌体的表面,利用其可以再扩增的特性将靶分子固相化,通过亲合吸附—洗脱—扩增,可筛选到靶分子的配体肽链。特别是噬菌体随机表面表达文库技术的建立和发展促使了噬菌体抗体库技术的产生。Winter和Lerner[7,8]二小组于1991年先后报道了噬菌体抗体库技术。
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    2 噬菌体抗体库的构建

    2.1 表达载体 较广泛使用的是以噬菌粒(phagemid)为基础的载体。噬菌粒是含有丝状噬菌体基因间隔区(intragenic region)的质粒载体,本身不含任何噬菌体蛋白的编码基因,在大肠杆菌内扩增时不产生子代噬菌体颗粒,其基因操作与质粒完全相同;但在辅助病毒(helper phage)超感染下,可将噬菌粒DNA以单链的形式包装在噬菌体外壳蛋白内,作为病毒颗粒释放出来。载体中有基因克隆区,含有组装可变区基因的限制性内切酶位点。Fab表达载体pCOMB3[7]中与抗体库构建有关的部分,是由重链表达单位和轻链表达单位组成(附图);它们均含有大肠杆菌半乳糖苷酶的启动子、细菌pectate lyase(Pel)基因的信号序列及组装相应基因(重链Fd段和轻链)的内切酶位点。在重链Fd段3’端克隆位点后接有单链噬菌体外壳蛋白基因Ⅲ,表达后蛋白Ⅲ与Fd段形成融合蛋白,使所产生的Fab段固定在单链噬菌体的外膜上。若用内切酶除去基因Ⅲ,表达的抗体则成为可溶性Fab段。
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    附图 噬菌体抗体表达载体pCOMB3(部分)

    2.2 构建方法 提取B淋巴细胞(来自骨髓、外周血、病灶局部引流淋巴结、扁桃体或是经免疫的小鼠脾脏等)RNA,行RT-PCR扩增可变区基因;用两种内切酶分别对纯化的轻链PCR产物及表达载体(如pCOMB3)进行双酶切后分离纯化,按一定比例将两者进行连接,电击转化感受态细菌并扩大培养,提取质粒,即为轻链库;再分别对经纯化的重链PCR产物和轻链库进行双酶切,纯化回收后按一定比例连接,电击转化感受态细菌,加入辅助病毒进行培养,离心取上清,加入PEG沉淀噬菌体颗粒,即得噬菌体抗体库。表达单链抗体的噬菌体抗体库尚可通过重叠延伸拼接法(splicing by overlap extension,SOE),用PCR将轻链和重链可变区基因组合在一起,减少一次重组过程。将抗原固相化后对抗体库进行3~5轮“吸附—洗脱—扩增”,以富集特异性噬菌体抗体;将最后一次富集后的噬菌体抗体感染细菌铺盘,挑取部分集落制备抗体,并用ELISA对其进行鉴定,以筛选特异性的噬菌体抗体。若将获得的克隆载体切去基因Ⅲ或基因Ⅷ后自连,转化细菌并进行培养,即可获得可溶性抗体片段。
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    3 噬菌体抗体库技术的进展

    上述介绍的噬菌体抗体库技术虽在一定程度上较好地模拟了体内抗体生成的三个重要环节:(l)多样性的B细胞群体(B cell repertoire);(2)克隆选择;(3)亲和力成熟。但因受PCR引物的设计、细菌的转化率、噬菌体的滴度、构建载体时选用的限制性内切酶的种类以及体内外抗体生成机制不同等因素的影响,所构建抗体库的容量和多样性通常不够,筛选出不同抗体的能力仍然有限,所得抗体的亲和力也往往较低。因此目前的噬菌体抗体库技术仍需在这些方面进行改进。以下介绍的是几种尝试方法。

    3.1 容量 轻链库和重链库分别用不同的载体构建,一个用噬菌粒载体,另一个用单链噬菌体载体,先将噬菌粒库转化大肠杆菌,得到第一个链的细菌库,再将另一个单链噬菌体的库制备成有感染力的病毒颗粒库,感染第一个库,即可增加库容量;但这种方法得到的噬菌体抗体基因组中只有一条链的基因。 Waterhouse[9]采用噬菌体P1的lox-Cre定位重组系统,可使轻、重链载体之间发生定位重组,将轻、重链基因重组到同一载体上,便于筛选。此外,Soderlind[10]用伴侣蛋白GroE与噬菌体呈现载体pEXmide3共同表达,可提高被包装的噬菌体滴度近200倍;而新的载体polycos[11]噬菌体包装率高且无需电穿孔法转化,也大大增加了库容量。
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    3.2 多样性 只有足够的多样性,才能筛选出各种不同的抗体,增加多样性是噬菌体抗体库技术改进的基础。

    3.2.1 从初生的未经免疫的个体获取B细胞尤其是骨髓细胞,减少因抗原刺激所致的B细胞repertoire的变化,尽可能得到“天然”抗体库。

    3.2.2 互补决定区(CDR)合成的方法 一是人工随机合成全部或部分CDR取代已有抗体的相应部分,构建全合成或半合成抗体库,可筛选出新的特异性抗体。Barbas等[12]将人工随机合成的CDR3取代抗破伤风类毒素的Fab段内Fd段的CDR3,构建了半合成的噬菌体抗体库,并从库中筛选出抗荧光素的抗体。二是人工合成的CDR3与未经重排的基因组V基因组合成抗体库。V基因来自多个不同个体胚系[13]或是采用多组不同引物克隆出胚系的VH和VL基因[14]

    CDR合成的方法是增加抗体库多样性的主要方法。随着对CDR结构和功能的不断认识,人们对CDR的设计将更加合理,CDR的多样性将得到更有效的表达,最终构建出可包罗万象的总抗体库(master library)。
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    3.3 亲和力成熟 机体免疫反应的发展过程中,抗原刺激后抗体的亲和力是逐渐升高的,其中包括超突变导致抗体分子可变区(特别是CDR的氨基酸序列和构象)的改变以及亲和抗体的筛选。从免疫过的淋巴细胞中扩增的V基因构建的抗体库较易筛到亲和力高的抗体,而从未经免疫的淋巴细胞中扩增的V基因构建的“天然”抗体库,筛选到特异性抗体的数量少、亲和力低。多数情况下,特别是在制备人抗体时,获得经免疫的抗体库是不可能的。所以提高抗体的亲和力往往显得很重要。

    3.3.1 基因突变方法 针对可变区基因进行突变,模拟体内抗体亲和力的成熟过程,构建次级抗体库。有两种方式:一是可变区基因的随机突变,包括进行易错配的PCR扩增及利用致突变株大肠杆菌在体内进行突变;二是针对CDR的随机突变、半随机突变及寡核苷酸诱导的定点突变。

    3.3.2 链替换(Chain shuffling) 链替换技术是体外亲和力提高的特有方式。得到低亲和力的噬菌体抗体后,将其一条链(如轻链)与另一条链(如重链)的基因库组合,得到次级库,选择亲和力得到改善的克隆;再将重链固定,与轻链基因库组合建库,筛选高亲和力的克隆[15]。此外,链替换技术可将鼠源性抗体进行人源化[16]:将噬菌体鼠抗体的VH基因与人抗体VL基因库进行链替换,通过噬菌体表面表达技术,筛选出与抗原结合的人鼠杂合的抗体片段,再用所筛得的特异性人VL基因与人VH基因库进行链替换,以获得完全由人抗体可变区组成的特异性抗体片段。
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    4 噬菌体抗体库技术的应用前景

    噬菌体抗体库技术省去了传统单抗制备中的细胞融合,甚至可以不经免疫,直接利用抗原从库中筛选特异性抗体。该技术筛选容量大、筛选能力强,并可直接克隆到抗体基因,使单抗的制备变得简单易行、稳定有效。因此,人们预测噬菌体抗体库技术将取代传统的杂交瘤单克隆抗体技术,成为制备单抗的主要手段。噬菌体抗体库技术能较好地解决了人杂交瘤系低效的难题,使人单抗的制备有了突破,这是基因工程技术的重大进展。此外,噬菌体抗体是抗体片段,分子小、穿透力强、廓清快、异源性低,而且能在原核系统中表达易于生产,这些都展示出乐观的应用前景。目前应用噬菌体抗体库技术已制备了多种抗体,特别是从未经免疫的人源天然抗体库中筛选出了抗半抗原、蛋白质和病毒颗粒等抗体[17~23],其中抗病毒抗体已显示出良好的应用前景。Burton[19]从无艾兹病临床症状而有HIV抗体的人体骨髓内提取RNA,构建了第一个HIV的噬菌体抗体文库,并从该库中获得了一组抗gp120的人源噬菌体Fab单克隆抗体,这些抗体与HIV抗原有很高的亲和力,并具有阻断gp120分子与CD4结合及抑制HIV对敏感细胞的感染作用[24]。Barbas[20]用重组杆状病毒表达的呼吸道合胞病毒(RSV)F糖蛋白从已构建的噬菌体抗体库中筛到了抗RSV的噬菌体抗体,该抗体具有完全中和病毒增殖和预防再感染的作用。这两种噬菌体抗体都已进入了临床Ⅱ期试验,专家预测它们将是被最早用于临床的噬菌体抗体。噬菌体抗体库可望用于传染病的预防,相关疾病的影像学诊断、导向治疗、基因治疗以及利用抗体信息设计药物等方面。
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    当然,目前的抗体库技术仍有不尽人意的地方。首先,并非所有的抗体片段都能在大肠杆菌中进行分泌性表达;而且许多抗体基因在大肠杆菌中表达,常造成宿主菌生长缓慢甚至裂解,导致这些基因在文库中丢失,影响特异性抗体的获得。其次,宿主表达抗体的活性常常受到许多未知因素的影响,不同宿主菌表达结果也常常不同,表达的抗体量也很低。此外,噬菌体抗体库筛选出的抗体都是在大肠杆菌中表达的抗体片段(Fab 段或单链抗体),不是完整的抗体,在治疗应用时,许多生物学活性不如完整的抗体分子(含Fc段及双价Fab段)。因此,这些方面还有许多工作要做,今后的研究重点应在抗体的高效表达系统的研制和完整抗体分子的构建方面。

    人们正不断努力使抗体库技术得到发展和完善。相信随着基因工程技术的进步,抗体库技术的适用将更加广泛和有效,随意、定向改造和制备抗体的时代也必将到来。

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    (收稿:1998-11-12 修回:1998-12-18), 百拇医药