深低温长期保存兔角膜内皮细胞体外培养的实验研究
作者：崔向东 王传富 于华英 王沛涛 付秀艳
单位：崔向东 于华英 王沛涛 付秀艳(青岛医学院附属医院(青岛 266003)低温医学研究室)；王传富青岛医学院附属医院(青岛 266003)眼科)
关键词：角膜；低温保存；细胞，培养的；兔
齐鲁医学杂志990103 【摘要】 ①目的 观察深低温保存后兔角膜内皮细胞的活性。②方法 将深低温保存兔角膜与新鲜兔角膜进行内皮细胞体外培养对比观察。③结果 在培养7d内，深低温保存的角膜内皮细胞较新鲜角膜内皮细胞滞后1～2d生长，14d以后二者逐渐趋于一致。④结论 经深低温长期保存的兔角膜内皮细胞仍保持良好的生长活性。
中国图书资料分类法分类号 R-33；R779.65
CELL CULTURE OF ENDOTHELIAL CELLS OF CRYOPRESERVED RABBIT CORNEA
, http://www.100md.com
Cui Xiangdong, Wang Chuanfu, Yu Huaying, et al
Department of Cryomedicine, The Affiliated Hospital of Qingdao Medical College, Qingdao 266003
【ABSTRACT】 Objective To determine the activities of endotheliocytes of cryopreserved rabbit cornea. Methods The endotheliocytes of both cryopreserved and fresh rabbit cornea were cultured. Results During first 7 days of cell culture, the growth of endotheliocytes of the cryopreserved cornea delayed 1-2 days compared with that of the fresh cornea. After 14 days of in vitro culture, both cryopreserved and fresh rabbit cornea growed similarly. Conclusion Endothelial cells of the long-term cryopreserved rabbit corneas maintained good activities.
, 百拇医药
【KEY WORDS】 cornea; cryopreservation; culture; rabbit
角膜细胞的体外培养技术是现代角膜病研究的重要方法之一。近年来已有关于人及动物新鲜角膜细胞体外培养的研究报道〔1～3〕。我们自1986年开始进行深低温简化二步法长期保存角膜，并行穿透性角膜移植获得成功〔4〕。为进一步客观地评价深低温长期保存角膜的内皮细胞活性，我们对深低温保存和新鲜兔角膜内皮细胞进行了体外培养的对比观察，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
分析纯琼酯为青岛分析试剂厂产品；24孔培养板为Corning公司产品；RPMI1640干粉为美国Life Technologic公司产品；体积分数为0.20无支原体小牛血清由杭州四季青生物工程材料研究所生产；Trypsin和EDTA均为国产分析纯；CO2培养箱为日本SANYO公司产品；WL-91型生物降温仪系军事医学科学院产品。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 培养板制备 取分析纯琼酯3g，加生理盐水100mL在烧杯内溶解，煮沸30min，于超净工作台内注入到进口24孔培养板中，每孔注入总深度的1/2，自发冷却后加盖备用。
1.2.2 细胞培养基制备 RPMI1640 10.4g，加1 000mL三蒸馏水溶解，加入NaHCO3 2g，微孔过滤除菌，4℃保存备用。用前加入体积分数为0.20无支原体小牛血清，青霉素1万单位，链霉素10mg，调整pH至7.2.Trypsin和EDTA分别用三蒸馏水溶解，每1～2mL分装为一个小包装，-30℃冷冻保存备用。
1.2.3 深低温长期保存兔角膜制备 取健康杂种家兔10只，雌雄不限，空气栓塞致死，立即取出眼球，用含庆大霉素的生理盐水冲洗，然后在无菌条件下沿角膜剪取带2mm巩膜环的角膜片，轻轻剥除虹膜组织，置含50g/L二甲基亚砜(DMSO)的人血清白蛋白溶液(Ⅰ号液)中，4℃冰箱冷平衡20min，再移至含100g/L DMSO的Ⅱ号液中，4℃再次冷平衡20min.标本瓶置入WL-91型生物降温仪，以每分钟1～2℃的降温速率降温至-30℃；再以每分钟8～10℃的速率降温至-80℃以下，然后移入液氮(-196℃)中长期保存备用，保存期为230～343d.
, 百拇医药
1.2.4 新鲜兔角膜制备 取家兔10只，雌雄皆有，空气栓塞致死，角膜片制备除不进行深低温保存外，其余步骤同1.2.3.
1.2.5 角膜内皮细胞的培养 取新鲜和深低温保存复温〔5〕后角膜标本各1只，参照谢立信等〔2〕的方法进行培养，角膜内皮面朝上，使之上皮面紧贴琼脂凹面，滴入5g/L Trypsin和2g/L EDTA温合液15～20μL，37℃孵育2～5min，然后放入培养液使消化终止。将角膜十字交叉剪成4片，各片内皮面向下置入24孔琼脂培养板，加入1mL培养液，加盖后置入CO2培养箱中，温度调至37℃，CO2体积分数为0.05，空气体积分数为0.95，自动控时记录，培养48h.次日将角膜片移至相临孔内，弃去培养液，以Hank液轻轻冲洗1～2次，再加入新鲜培养液1～2mL.依次转移换孔4～5次，最后将角膜片丢弃。以后每周换液，隔日观察1次。倒置显微镜下观察。内皮细胞生长状态记录：(+)为贴壁生长；(++)为贴壁小片生长；(+++)为细胞连成大片生长。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 新鲜兔角膜内皮细胞的培养结果
内皮细胞贴壁生长比较容易，1～2d后即可见到贴壁生长。7d后可以见到小片生长的细胞，此时细胞无明显的细胞核。14d以后细胞连成大片，较密集排列，细胞逐渐出现明显的细胞核，且呈较典型的六角形状。
2.2 深低温长期保存兔角膜内皮细胞的培养结果
经深低温保存230～343d的角膜，内皮细胞生长较新鲜角膜滞后1～2d，于前7d时相差较明显。14d以后二者生长情况逐渐相似，细胞同样呈密集排列，逐渐表现为典型的六角形，与新鲜角膜内皮细胞不再有明显的差别。
3 讨 论
判定深低温长期保存角膜组织的活性，角膜细胞的体外培养是重要的客观指标之一。本实验对深低温保存和新鲜兔角膜进行了体外培养的对比观察，结果内皮细胞生长情况无明显差异。新鲜角膜内皮细胞1～2d贴壁后，7d内即可连成小片生长。经深低温保存的角膜内皮细胞，生长速度较新鲜角膜滞后1～2d，可能与冷冻-复温处理后细胞从“休眠状态”逐步复苏的过程有关。我们在以往研究中也曾观察到，深低温保存的角膜植片术后水肿消退和厚度恢复正常的时间较新鲜角膜植片相对延长〔4〕。经7～14d培养后，深低温保存与新鲜角膜内皮细胞的生长情况逐渐趋于相同。
, 百拇医药
一般认为，角膜内皮细胞较易原代培养，但很难贴附于比较光滑的聚乙烯培养板上生长。胶原组织、明胶等可用来作为角膜细胞的培养基质，细胞易贴附于其上。本法中我们采用国产的分析纯琼脂制成平板，也可获得较好的培养结果。琼脂用量为10～20g/L，冷却后其硬度有所差别，但从培养的结果来看，似乎对内皮细胞的生长状态影响不明显。另外，应用本法须注意消化时间，以5g/L和2g/L EDTA混合液对角膜内皮细胞进行消化，2～5min可使细胞间连接松动，培养过程中细胞逐渐脱落贴壁生长。消化时间超过5min易使角膜内皮细胞较大块脱落，经培养后呈“堆集状”生长，倒置显微镜下观察发现细胞呈非单层排列，而呈多个层次，不利于观察。
近年来我们用深低温长期保存的角膜组织，临床移植过程中检测角膜周边部内皮细胞活率均在70%以上，完全符合临床穿透性角膜移植的标准。本文采用体外培养对比研究的方法从另一角度证实，深低温长期保存的角膜内皮细胞仍保持较好功能，这为临床开展角膜移植工作提供了可靠的证据。另外，体外培养作为深低温保存后角膜内皮细胞活性的检测方法之一，值得推广和应用。
, http://www.100md.com
本文为山东省科委基金资助课题
参考文献
1 吴 萍，何玉兰，李源淑，等.兔角膜上皮的培养及形态学研究观察.眼科研究，1989，7：201
2 谢立信，董晓光，张德茹，等.人角膜细胞的原代培养实验研究.中华眼科杂志，1991，27：13
3 张 泺，赵小杭.角膜上皮体外培养中胶原基质的研究.中华眼科杂志，1991，27：16
4 Wang CF, Liu JG, Sun WR, et al. Evaluation of penetrating keratoplasties with long-term cryopreserved corneas using simplified method. Chinese Medical Journal, 1992,105:572
5 刘金刚，王传富，葛风英，等.深低温长期保存角膜技术的研究.青岛医学院学报，1988，24：87
(1998-09-15收稿 1999-01-15修回), 百拇医药
单位：崔向东 于华英 王沛涛 付秀艳(青岛医学院附属医院(青岛 266003)低温医学研究室)；王传富青岛医学院附属医院(青岛 266003)眼科)
关键词：角膜；低温保存；细胞，培养的；兔
齐鲁医学杂志990103 【摘要】 ①目的 观察深低温保存后兔角膜内皮细胞的活性。②方法 将深低温保存兔角膜与新鲜兔角膜进行内皮细胞体外培养对比观察。③结果 在培养7d内，深低温保存的角膜内皮细胞较新鲜角膜内皮细胞滞后1～2d生长，14d以后二者逐渐趋于一致。④结论 经深低温长期保存的兔角膜内皮细胞仍保持良好的生长活性。
中国图书资料分类法分类号 R-33；R779.65
CELL CULTURE OF ENDOTHELIAL CELLS OF CRYOPRESERVED RABBIT CORNEA
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Cui Xiangdong, Wang Chuanfu, Yu Huaying, et al
Department of Cryomedicine, The Affiliated Hospital of Qingdao Medical College, Qingdao 266003
【ABSTRACT】 Objective To determine the activities of endotheliocytes of cryopreserved rabbit cornea. Methods The endotheliocytes of both cryopreserved and fresh rabbit cornea were cultured. Results During first 7 days of cell culture, the growth of endotheliocytes of the cryopreserved cornea delayed 1-2 days compared with that of the fresh cornea. After 14 days of in vitro culture, both cryopreserved and fresh rabbit cornea growed similarly. Conclusion Endothelial cells of the long-term cryopreserved rabbit corneas maintained good activities.
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【KEY WORDS】 cornea; cryopreservation; culture; rabbit
角膜细胞的体外培养技术是现代角膜病研究的重要方法之一。近年来已有关于人及动物新鲜角膜细胞体外培养的研究报道〔1～3〕。我们自1986年开始进行深低温简化二步法长期保存角膜，并行穿透性角膜移植获得成功〔4〕。为进一步客观地评价深低温长期保存角膜的内皮细胞活性，我们对深低温保存和新鲜兔角膜内皮细胞进行了体外培养的对比观察，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
分析纯琼酯为青岛分析试剂厂产品；24孔培养板为Corning公司产品；RPMI1640干粉为美国Life Technologic公司产品；体积分数为0.20无支原体小牛血清由杭州四季青生物工程材料研究所生产；Trypsin和EDTA均为国产分析纯；CO2培养箱为日本SANYO公司产品；WL-91型生物降温仪系军事医学科学院产品。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 培养板制备 取分析纯琼酯3g，加生理盐水100mL在烧杯内溶解，煮沸30min，于超净工作台内注入到进口24孔培养板中，每孔注入总深度的1/2，自发冷却后加盖备用。
1.2.2 细胞培养基制备 RPMI1640 10.4g，加1 000mL三蒸馏水溶解，加入NaHCO3 2g，微孔过滤除菌，4℃保存备用。用前加入体积分数为0.20无支原体小牛血清，青霉素1万单位，链霉素10mg，调整pH至7.2.Trypsin和EDTA分别用三蒸馏水溶解，每1～2mL分装为一个小包装，-30℃冷冻保存备用。
1.2.3 深低温长期保存兔角膜制备 取健康杂种家兔10只，雌雄不限，空气栓塞致死，立即取出眼球，用含庆大霉素的生理盐水冲洗，然后在无菌条件下沿角膜剪取带2mm巩膜环的角膜片，轻轻剥除虹膜组织，置含50g/L二甲基亚砜(DMSO)的人血清白蛋白溶液(Ⅰ号液)中，4℃冰箱冷平衡20min，再移至含100g/L DMSO的Ⅱ号液中，4℃再次冷平衡20min.标本瓶置入WL-91型生物降温仪，以每分钟1～2℃的降温速率降温至-30℃；再以每分钟8～10℃的速率降温至-80℃以下，然后移入液氮(-196℃)中长期保存备用，保存期为230～343d.
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1.2.4 新鲜兔角膜制备 取家兔10只，雌雄皆有，空气栓塞致死，角膜片制备除不进行深低温保存外，其余步骤同1.2.3.
1.2.5 角膜内皮细胞的培养 取新鲜和深低温保存复温〔5〕后角膜标本各1只，参照谢立信等〔2〕的方法进行培养，角膜内皮面朝上，使之上皮面紧贴琼脂凹面，滴入5g/L Trypsin和2g/L EDTA温合液15～20μL，37℃孵育2～5min，然后放入培养液使消化终止。将角膜十字交叉剪成4片，各片内皮面向下置入24孔琼脂培养板，加入1mL培养液，加盖后置入CO2培养箱中，温度调至37℃，CO2体积分数为0.05，空气体积分数为0.95，自动控时记录，培养48h.次日将角膜片移至相临孔内，弃去培养液，以Hank液轻轻冲洗1～2次，再加入新鲜培养液1～2mL.依次转移换孔4～5次，最后将角膜片丢弃。以后每周换液，隔日观察1次。倒置显微镜下观察。内皮细胞生长状态记录：(+)为贴壁生长；(++)为贴壁小片生长；(+++)为细胞连成大片生长。
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2 结 果
2.1 新鲜兔角膜内皮细胞的培养结果
内皮细胞贴壁生长比较容易，1～2d后即可见到贴壁生长。7d后可以见到小片生长的细胞，此时细胞无明显的细胞核。14d以后细胞连成大片，较密集排列，细胞逐渐出现明显的细胞核，且呈较典型的六角形状。
2.2 深低温长期保存兔角膜内皮细胞的培养结果
经深低温保存230～343d的角膜，内皮细胞生长较新鲜角膜滞后1～2d，于前7d时相差较明显。14d以后二者生长情况逐渐相似，细胞同样呈密集排列，逐渐表现为典型的六角形，与新鲜角膜内皮细胞不再有明显的差别。
3 讨 论
判定深低温长期保存角膜组织的活性，角膜细胞的体外培养是重要的客观指标之一。本实验对深低温保存和新鲜兔角膜进行了体外培养的对比观察，结果内皮细胞生长情况无明显差异。新鲜角膜内皮细胞1～2d贴壁后，7d内即可连成小片生长。经深低温保存的角膜内皮细胞，生长速度较新鲜角膜滞后1～2d，可能与冷冻-复温处理后细胞从“休眠状态”逐步复苏的过程有关。我们在以往研究中也曾观察到，深低温保存的角膜植片术后水肿消退和厚度恢复正常的时间较新鲜角膜植片相对延长〔4〕。经7～14d培养后，深低温保存与新鲜角膜内皮细胞的生长情况逐渐趋于相同。
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一般认为，角膜内皮细胞较易原代培养，但很难贴附于比较光滑的聚乙烯培养板上生长。胶原组织、明胶等可用来作为角膜细胞的培养基质，细胞易贴附于其上。本法中我们采用国产的分析纯琼脂制成平板，也可获得较好的培养结果。琼脂用量为10～20g/L，冷却后其硬度有所差别，但从培养的结果来看，似乎对内皮细胞的生长状态影响不明显。另外，应用本法须注意消化时间，以5g/L和2g/L EDTA混合液对角膜内皮细胞进行消化，2～5min可使细胞间连接松动，培养过程中细胞逐渐脱落贴壁生长。消化时间超过5min易使角膜内皮细胞较大块脱落，经培养后呈“堆集状”生长，倒置显微镜下观察发现细胞呈非单层排列，而呈多个层次，不利于观察。
近年来我们用深低温长期保存的角膜组织，临床移植过程中检测角膜周边部内皮细胞活率均在70%以上，完全符合临床穿透性角膜移植的标准。本文采用体外培养对比研究的方法从另一角度证实，深低温长期保存的角膜内皮细胞仍保持较好功能，这为临床开展角膜移植工作提供了可靠的证据。另外，体外培养作为深低温保存后角膜内皮细胞活性的检测方法之一，值得推广和应用。
, http://www.100md.com
本文为山东省科委基金资助课题
参考文献
1 吴 萍，何玉兰，李源淑，等.兔角膜上皮的培养及形态学研究观察.眼科研究，1989，7：201
2 谢立信，董晓光，张德茹，等.人角膜细胞的原代培养实验研究.中华眼科杂志，1991，27：13
3 张 泺，赵小杭.角膜上皮体外培养中胶原基质的研究.中华眼科杂志，1991，27：16
4 Wang CF, Liu JG, Sun WR, et al. Evaluation of penetrating keratoplasties with long-term cryopreserved corneas using simplified method. Chinese Medical Journal, 1992,105:572
5 刘金刚，王传富，葛风英，等.深低温长期保存角膜技术的研究.青岛医学院学报，1988，24：87
(1998-09-15收稿 1999-01-15修回), 百拇医药