肿瘤坏死因子对肿瘤细胞杀伤作用的观察
作者：丁守怡 许小幸 吴 荣 M.Stanley
单位：丁守怡 吴 荣(青岛医学院肿瘤研究室(青岛 266021)；许小幸(青岛医学院预防医学教研室；M.Stanley(英国剑桥大学病理系)
关键词：肿瘤坏死因子；干扰素；子宫肿瘤；细胞毒性试验
齐鲁医学杂志990102 【摘要】 ①目的 探讨肿瘤坏死因子(TNFα)对肿瘤细胞的杀伤作用，并观察重组人干扰素(IFNγ)对TNFα细胞毒性的协同作用。②方法 采用非同位素细胞毒试验，对3个子宫颈来源的细胞系进行传代培养，与TNFα接触后检测其杀伤细胞情况。③结果 TNFα对子宫颈良、恶性肿瘤细胞均呈微弱的细胞毒作用，而IFNγ与TNFα联用则对宫颈癌来源的细胞系具有明显杀伤作用(F=11.25,P<0.01),对源于正常、良性肿瘤的细胞系则无明显作用(F=1.15,1.23,P>0.05)。④结论 TNFα对肿瘤细胞具有杀伤作用，且IFNγ能促进这种杀伤作用。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 R73-35
CYTOTOXICITY OF TUMOR NECROSIS FACTOR ON TUMOR CELLS
Ding Shouyi, Xu Xiaoxing, Wu Rong, et al
Department of Pathology, Qingdao Medical College, Qingdao 266021
【ABSTRACT】 Objective To determine the cytotoxicity of tumor necrosis factor(TNFα) on tumor cell lines in vitro and the synergistic effect of interferon(IFNγ) and TNFα. Methods A non-isotopic cytotoxicity assay was used to detect the cytotoxic effect of TNFα on the three cervix-derived cell lines. Results TNFα had little cytolytic effect to all the cell lines used. However, with the synergistic effect of IFNγ, TNFα showed significant cytolytic effect to cervix carcinoma cells (F=11.25, P<0.01), but no significant effect to physiological cells and benign cervix tumor cells were observed (F=1.25, 1.23, P>0.05). Conclusion TNFα had cytolytic effect to tumor cells and the effect could be enhanced by IFNγ.
, 百拇医药
【KEY WORDS】 tumor necrosis factor; interferon; cervical tumor; cytotoxicity
肿瘤坏死因子(TNFα)对生物体具有极强的调节作用。在TNFα诸多生物学作用中最受关注的是其抗肿瘤作用。研究表明，TNFα体外对传代的肿瘤细胞系具有较强的细胞毒作用〔1〕。本文通过非同位素LDH释放细胞毒试验，观察TNFα对传代的人宫颈癌细胞系的杀伤作用，并观察重组人干扰素(IFNγ)对TNFα产生的细胞毒性的协同作用，以探讨影响TNFα体外抗肿瘤作用的因素。
1 材料与方法
1.1 细胞系
, http://www.100md.com 传代的人宫颈癌细胞系SiHa,宫颈湿疣来源的细胞系W12及正常人宫颈细胞系NCx〔2〕均由英国剑桥大学提供。
1.2 培养基及试剂
GMEM(SeraLabs Ltd)； 胎牛血清(FCS)(SeraLabs Ltd)； TNF(BrishBiottechnology Ltd)；IFNγ(Genzyme Ltd)；CytoTox 96Tm(Promega).
1.3 传代及细胞预处理
上述细胞系在GMEM/10胎牛血清(FCS)中传代培养，为使细胞以指数方式增长，每周传代2次〔2〕。使用前将细胞制成 1×104/L的细胞悬液。为观察胰蛋白酶对细胞毒作用的影响，以胰蛋白酶消化和刮棒刮取方式处理培养瓶中贴壁生长的细胞。
, 百拇医药
1.4 细胞毒试验
取50μL细胞悬液种于96孔培养板中，并按不同实验条件分别加入TNFα与IFNγ，使TNFα达到0, 50,100, 200, 500u/mL, IFNγ 1 000u/mL.在37℃体积分数为0.05的CO2孵箱中培养48h后，低速离心，取50μL上清液移入新板。将CytoTox 96Tm试剂盒中试剂依次加入。酶标检测仪(490nm)下检测吸光度，间接计算细胞毒百分比。
1.5 统计学处理方法
实验结果以
±s表示,组间比较先对数据进行平方根反正弦转换后，再进行方差分析。
2 结 果
, 百拇医药
2.1 胰蛋白酶消化对细胞毒性的影响
同一细胞系不同处理方法间的细胞毒性差别有显著性(F=3.45～9.53,P<0.05, 0.01)， TNFα组、酶+TNFα组与培养基组比较，差异均有显著意义(q=3.58～5.52,P<0.05, 0.01), TNFα组与酶+TNFα组比较，差异均无显著意义(q=0.62～1.31,P>0.05)。培养基对不同细胞系的细胞毒性差别无显著意义(F=0.16,P>0.05)；TNFα组及酶+TNFα组对不同细胞系的毒性差别均有显著意义(F=3.62,5.11,P<0.05)；TNFα组及酶+TNFα组对SiHa的细胞毒性较对W12及NCx细胞系的毒性大(q=3.11～5.32,P<0.05)，对W12及NCx的细胞毒性差别无显著意义(q=0.35,0.42,P>0.05)。见表1.
, http://www.100md.com
2.2 不同浓度TNFα介导的细胞毒性
同一细胞系内TNFα的细胞毒性作用随TNFα的浓度增加而增加，而且呈正相关关系(r=0.62～0.74)。0及50u/mL浓度组各细胞系的细胞毒性差别无显著性(F=1.23,1.45,P>0.05); 100,200,500u/mL浓度组对不同细胞系毒性作用差别均有显著性(F=4.24～5.72,P<0.05,0.01)。TNFα对SiHa细胞系毒性作用大于对W12及NCx细胞系毒性作用(q=3.45～ 5.21,P<0.05,0.01) ；而对W12及NCx细胞系间的毒性作用差别无显著性(q=0.32～1.23，P>0.05)。见表2.
2.3 IFNγ对TNFα介导的细胞毒性的协同作用
, http://www.100md.com
IFNγ, TNFα及IFNγ+TNFα对SiHa细胞系的细胞毒性不同，差别均有显著性(F=11.25,P<0.01)。IFNγ+TNFα组的细胞毒性明显高于IFNγ及TNFα组，差别有显著性(q=7.82, 8.57,P<0.01)。IFNγ与TNFα组的细胞毒性作用差别无显著性(q=2.11,P>0.05)。IFNγ,TNFα及IFNγ+TNFα对W12及NCx细胞系的细胞毒性作用差别无显著意义(F=1.15, 1.23, P>0.05)。 IFNγ，TNFα及IFNγ+TNFα对不同细胞系的细胞毒性作用不同， 差别有显著意义(F=3.85～12.32,P<0.05,0.01)；对SiHa细胞系的细胞毒性作用大于W12及NCx组(q=3.23～9.86,P<0.05,0.01),而对W12及NCx细胞系的细胞毒性作用相同(q=0～0.98,P均>0.05)。见表3.
, http://www.100md.com
3 讨 论
本文对TNFα在体外对宫颈来源的3个细胞系产生的杀伤作用进行了研究。结果表明, TNFα对宫颈良性和恶性来源的细胞系呈微弱细胞毒作用，但IFNγ与TNFα共同作用则能对宫颈癌来源的SiHa细胞系产生杀伤作用，而对正常、良性来源的NCx，W12细胞系均无显著杀伤作用。Carswell等〔3〕首次描述了TNFα对Meth-A肉瘤及L929细胞系的溶细胞作用后，相继有大量研究表明,TNFα对40%体外培养的肿瘤细胞系具杀伤作用，但敏感性差异很大，如鼠L929与WEHI164细胞系接触微量TNFα即被溶解，而人乳癌细胞系MCF-7则需10倍以上浓度的TNFα才能获得相应的杀伤效果〔4〕。
表1 胰蛋白酶消化对细胞毒性的影响(%,±s) 细胞系
, http://www.100md.com
n
培养基
TNFα
酶+TNFα
SiHa
10
0.57±0.18
2.64±0.24
2.35±0.25
W12
10
0.48±0.16
, http://www.100md.com
1.22±0.13
1.29±0.11
NCx
10
0.63±0.15
1.34±0.12
1.19±0.14
表2 不同浓度TNFα介导的细胞毒性作用(%,±s) 细胞系
n
TNFα浓度(c/u.mL-1)
, 百拇医药
0
50
100
200
500
SiHa
10
0.64±0.16
1.19±0.13
1.47±0.13
2.48±0.20
3.70±0.25
W12
, 百拇医药
10
0.52±0.14
1.07±0.19
1.11±0.12
1.35±0.14
1.72±0.16
NCx
10
0.58±0.15
0.99±0.18
1.05±0.10
1.37±0.12
, http://www.100md.com
1.54±0.13
表3 IFNγ对TNFα介导细胞毒性的协同作用(%,±s) 细胞系
n
IFNγ
TNFα
IFNγ +TNFα
SiHa
10
2.22±0.28
, 百拇医药
2.73±0.30
21.45±1.85
W12
10
1.27±0.12
1.47±0.15
1.42±0.20
NCx
10
1.25±0.10
1.38±0.12
1.42±0.22
, 百拇医药
Herzog等〔5〕报道，放射处理标本对TNFα介导的细胞溶解有协同作用。TNFα对5个人类宫颈癌来源的细胞系(ME-180，HT-3，MS751，SiHa，C-33A)的杀伤不敏感，但经放射处理后，TNFα使ME-180，HT-3，MS751等3个细胞系产生溶解作用，而对SiHa(放疗不敏感),C-33A(放疗敏感)则无显著效果。研究表明，IFNγ本身并不具有细胞毒作用，但能增加TNFα诱导的靶细胞溶解〔6〕。TNFα诱导细胞溶解的机制尚未得到确切证实。Dubois等〔7〕的研究显示，TNFα与IFNγ或高热产生协同作用。低剂量细胞因子对HeLa，KB，PLC/PRF/5等3个肿瘤细胞系有增敏效果，而对MRC5，F7000，FS4等3个正常细胞系无显著影响。一般认为，TNF受体(TNFR)增加与细胞毒作用增强有关〔8〕。IFNγ预处理可能增加某些肿瘤细胞表面的TNFR，可部分解释对TNFα的协同作用。
, 百拇医药
本文为中英友好奖学金及卫生部医学科研基金资助课题
参考文献
1 Rege AA, Aggarwal BB. Cytokine therapy: tumor necrosis factor.Cambridge University Press,1992.152
2 吴 荣,Coleman N,Stanley M. 干扰素在淋巴细胞介导的子宫颈角化上皮细胞毒中的作用.中华微生物和免疫学杂志,1994,14:253
3 Carswell EA,Old LJ,Kassel RL, et al.An endotoxin-induced serum factor that causes necrosis of tumors.Proc Natl Acad Sci USA,1975,72:3666
, 百拇医药
4 Goeddel DV,Aggarwal BB, Gray PW,et al. Tumor necrosis factors:gene structure and biological activities. Gold Spring Harbor Symptom Quant Boil,1986,51:597
5 Herzog TJ,Nelson PK ,Mutch DG,et al.Effects of radiation on TNFα-mediated cytolysis of cell lines derived from cervical carcinomas.Gynecol Oncol,1992,47:196
6 Dealtry GB,Naylor MS,Fflers W, et al. DNA fragmentation and cytotoxicity caused by tumor necrosis factors enhanced by interferon.Eur J Immunol, 1987，17:689
, 百拇医药
7 Dubois MF,Ferricu X,Lebon P.Synergistic cytolytic effects of recombinant human tumor necrosis factor, interferons and heat-stress.Cancer Reseach,1989,49:5618
8 Creasey AA, Yamamoto R, Vitt CR. A high molecular weight component of the human tumor necrosis factor receptor is associated with cytotoxicity.Proc Natl Acad Sci USA, 1987, 84:3293
(1998-03-05收稿 1998-12-16修回), 百拇医药
单位：丁守怡 吴 荣(青岛医学院肿瘤研究室(青岛 266021)；许小幸(青岛医学院预防医学教研室；M.Stanley(英国剑桥大学病理系)
关键词：肿瘤坏死因子；干扰素；子宫肿瘤；细胞毒性试验
齐鲁医学杂志990102 【摘要】 ①目的 探讨肿瘤坏死因子(TNFα)对肿瘤细胞的杀伤作用，并观察重组人干扰素(IFNγ)对TNFα细胞毒性的协同作用。②方法 采用非同位素细胞毒试验，对3个子宫颈来源的细胞系进行传代培养，与TNFα接触后检测其杀伤细胞情况。③结果 TNFα对子宫颈良、恶性肿瘤细胞均呈微弱的细胞毒作用，而IFNγ与TNFα联用则对宫颈癌来源的细胞系具有明显杀伤作用(F=11.25,P<0.01),对源于正常、良性肿瘤的细胞系则无明显作用(F=1.15,1.23,P>0.05)。④结论 TNFα对肿瘤细胞具有杀伤作用，且IFNγ能促进这种杀伤作用。
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中国图书资料分类法分类号 R73-35
CYTOTOXICITY OF TUMOR NECROSIS FACTOR ON TUMOR CELLS
Ding Shouyi, Xu Xiaoxing, Wu Rong, et al
Department of Pathology, Qingdao Medical College, Qingdao 266021
【ABSTRACT】 Objective To determine the cytotoxicity of tumor necrosis factor(TNFα) on tumor cell lines in vitro and the synergistic effect of interferon(IFNγ) and TNFα. Methods A non-isotopic cytotoxicity assay was used to detect the cytotoxic effect of TNFα on the three cervix-derived cell lines. Results TNFα had little cytolytic effect to all the cell lines used. However, with the synergistic effect of IFNγ, TNFα showed significant cytolytic effect to cervix carcinoma cells (F=11.25, P<0.01), but no significant effect to physiological cells and benign cervix tumor cells were observed (F=1.25, 1.23, P>0.05). Conclusion TNFα had cytolytic effect to tumor cells and the effect could be enhanced by IFNγ.
, 百拇医药
【KEY WORDS】 tumor necrosis factor; interferon; cervical tumor; cytotoxicity
肿瘤坏死因子(TNFα)对生物体具有极强的调节作用。在TNFα诸多生物学作用中最受关注的是其抗肿瘤作用。研究表明，TNFα体外对传代的肿瘤细胞系具有较强的细胞毒作用〔1〕。本文通过非同位素LDH释放细胞毒试验，观察TNFα对传代的人宫颈癌细胞系的杀伤作用，并观察重组人干扰素(IFNγ)对TNFα产生的细胞毒性的协同作用，以探讨影响TNFα体外抗肿瘤作用的因素。
1 材料与方法
1.1 细胞系
, http://www.100md.com 传代的人宫颈癌细胞系SiHa,宫颈湿疣来源的细胞系W12及正常人宫颈细胞系NCx〔2〕均由英国剑桥大学提供。
1.2 培养基及试剂
GMEM(SeraLabs Ltd)； 胎牛血清(FCS)(SeraLabs Ltd)； TNF(BrishBiottechnology Ltd)；IFNγ(Genzyme Ltd)；CytoTox 96Tm(Promega).
1.3 传代及细胞预处理
上述细胞系在GMEM/10胎牛血清(FCS)中传代培养，为使细胞以指数方式增长，每周传代2次〔2〕。使用前将细胞制成 1×104/L的细胞悬液。为观察胰蛋白酶对细胞毒作用的影响，以胰蛋白酶消化和刮棒刮取方式处理培养瓶中贴壁生长的细胞。
, 百拇医药
1.4 细胞毒试验
取50μL细胞悬液种于96孔培养板中，并按不同实验条件分别加入TNFα与IFNγ，使TNFα达到0, 50,100, 200, 500u/mL, IFNγ 1 000u/mL.在37℃体积分数为0.05的CO2孵箱中培养48h后，低速离心，取50μL上清液移入新板。将CytoTox 96Tm试剂盒中试剂依次加入。酶标检测仪(490nm)下检测吸光度，间接计算细胞毒百分比。
1.5 统计学处理方法
实验结果以
±s表示,组间比较先对数据进行平方根反正弦转换后，再进行方差分析。2 结 果
, 百拇医药
2.1 胰蛋白酶消化对细胞毒性的影响
同一细胞系不同处理方法间的细胞毒性差别有显著性(F=3.45～9.53,P<0.05, 0.01)， TNFα组、酶+TNFα组与培养基组比较，差异均有显著意义(q=3.58～5.52,P<0.05, 0.01), TNFα组与酶+TNFα组比较，差异均无显著意义(q=0.62～1.31,P>0.05)。培养基对不同细胞系的细胞毒性差别无显著意义(F=0.16,P>0.05)；TNFα组及酶+TNFα组对不同细胞系的毒性差别均有显著意义(F=3.62,5.11,P<0.05)；TNFα组及酶+TNFα组对SiHa的细胞毒性较对W12及NCx细胞系的毒性大(q=3.11～5.32,P<0.05)，对W12及NCx的细胞毒性差别无显著意义(q=0.35,0.42,P>0.05)。见表1.
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2.2 不同浓度TNFα介导的细胞毒性
同一细胞系内TNFα的细胞毒性作用随TNFα的浓度增加而增加，而且呈正相关关系(r=0.62～0.74)。0及50u/mL浓度组各细胞系的细胞毒性差别无显著性(F=1.23,1.45,P>0.05); 100,200,500u/mL浓度组对不同细胞系毒性作用差别均有显著性(F=4.24～5.72,P<0.05,0.01)。TNFα对SiHa细胞系毒性作用大于对W12及NCx细胞系毒性作用(q=3.45～ 5.21,P<0.05,0.01) ；而对W12及NCx细胞系间的毒性作用差别无显著性(q=0.32～1.23，P>0.05)。见表2.
2.3 IFNγ对TNFα介导的细胞毒性的协同作用
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IFNγ, TNFα及IFNγ+TNFα对SiHa细胞系的细胞毒性不同，差别均有显著性(F=11.25,P<0.01)。IFNγ+TNFα组的细胞毒性明显高于IFNγ及TNFα组，差别有显著性(q=7.82, 8.57,P<0.01)。IFNγ与TNFα组的细胞毒性作用差别无显著性(q=2.11,P>0.05)。IFNγ,TNFα及IFNγ+TNFα对W12及NCx细胞系的细胞毒性作用差别无显著意义(F=1.15, 1.23, P>0.05)。 IFNγ，TNFα及IFNγ+TNFα对不同细胞系的细胞毒性作用不同， 差别有显著意义(F=3.85～12.32,P<0.05,0.01)；对SiHa细胞系的细胞毒性作用大于W12及NCx组(q=3.23～9.86,P<0.05,0.01),而对W12及NCx细胞系的细胞毒性作用相同(q=0～0.98,P均>0.05)。见表3.
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3 讨 论
本文对TNFα在体外对宫颈来源的3个细胞系产生的杀伤作用进行了研究。结果表明, TNFα对宫颈良性和恶性来源的细胞系呈微弱细胞毒作用，但IFNγ与TNFα共同作用则能对宫颈癌来源的SiHa细胞系产生杀伤作用，而对正常、良性来源的NCx，W12细胞系均无显著杀伤作用。Carswell等〔3〕首次描述了TNFα对Meth-A肉瘤及L929细胞系的溶细胞作用后，相继有大量研究表明,TNFα对40%体外培养的肿瘤细胞系具杀伤作用，但敏感性差异很大，如鼠L929与WEHI164细胞系接触微量TNFα即被溶解，而人乳癌细胞系MCF-7则需10倍以上浓度的TNFα才能获得相应的杀伤效果〔4〕。
表1 胰蛋白酶消化对细胞毒性的影响(%,
±s) 细胞系, http://www.100md.com
n
培养基
TNFα
酶+TNFα
SiHa
10
0.57±0.18
2.64±0.24
2.35±0.25
W12
10
0.48±0.16
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1.22±0.13
1.29±0.11
NCx
10
0.63±0.15
1.34±0.12
1.19±0.14
表2 不同浓度TNFα介导的细胞毒性作用(%,
±s) 细胞系n
TNFα浓度(c/u.mL-1)
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0
50
100
200
500
SiHa
10
0.64±0.16
1.19±0.13
1.47±0.13
2.48±0.20
3.70±0.25
W12
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10
0.52±0.14
1.07±0.19
1.11±0.12
1.35±0.14
1.72±0.16
NCx
10
0.58±0.15
0.99±0.18
1.05±0.10
1.37±0.12
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1.54±0.13
表3 IFNγ对TNFα介导细胞毒性的协同作用(%,
±s) 细胞系n
IFNγ
TNFα
IFNγ +TNFα
SiHa
10
2.22±0.28
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2.73±0.30
21.45±1.85
W12
10
1.27±0.12
1.47±0.15
1.42±0.20
NCx
10
1.25±0.10
1.38±0.12
1.42±0.22
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Herzog等〔5〕报道，放射处理标本对TNFα介导的细胞溶解有协同作用。TNFα对5个人类宫颈癌来源的细胞系(ME-180，HT-3，MS751，SiHa，C-33A)的杀伤不敏感，但经放射处理后，TNFα使ME-180，HT-3，MS751等3个细胞系产生溶解作用，而对SiHa(放疗不敏感),C-33A(放疗敏感)则无显著效果。研究表明，IFNγ本身并不具有细胞毒作用，但能增加TNFα诱导的靶细胞溶解〔6〕。TNFα诱导细胞溶解的机制尚未得到确切证实。Dubois等〔7〕的研究显示，TNFα与IFNγ或高热产生协同作用。低剂量细胞因子对HeLa，KB，PLC/PRF/5等3个肿瘤细胞系有增敏效果，而对MRC5，F7000，FS4等3个正常细胞系无显著影响。一般认为，TNF受体(TNFR)增加与细胞毒作用增强有关〔8〕。IFNγ预处理可能增加某些肿瘤细胞表面的TNFR，可部分解释对TNFα的协同作用。
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本文为中英友好奖学金及卫生部医学科研基金资助课题
参考文献
1 Rege AA, Aggarwal BB. Cytokine therapy: tumor necrosis factor.Cambridge University Press,1992.152
2 吴 荣,Coleman N,Stanley M. 干扰素在淋巴细胞介导的子宫颈角化上皮细胞毒中的作用.中华微生物和免疫学杂志,1994,14:253
3 Carswell EA,Old LJ,Kassel RL, et al.An endotoxin-induced serum factor that causes necrosis of tumors.Proc Natl Acad Sci USA,1975,72:3666
, 百拇医药
4 Goeddel DV,Aggarwal BB, Gray PW,et al. Tumor necrosis factors:gene structure and biological activities. Gold Spring Harbor Symptom Quant Boil,1986,51:597
5 Herzog TJ,Nelson PK ,Mutch DG,et al.Effects of radiation on TNFα-mediated cytolysis of cell lines derived from cervical carcinomas.Gynecol Oncol,1992,47:196
6 Dealtry GB,Naylor MS,Fflers W, et al. DNA fragmentation and cytotoxicity caused by tumor necrosis factors enhanced by interferon.Eur J Immunol, 1987，17:689
, 百拇医药
7 Dubois MF,Ferricu X,Lebon P.Synergistic cytolytic effects of recombinant human tumor necrosis factor, interferons and heat-stress.Cancer Reseach,1989,49:5618
8 Creasey AA, Yamamoto R, Vitt CR. A high molecular weight component of the human tumor necrosis factor receptor is associated with cytotoxicity.Proc Natl Acad Sci USA, 1987, 84:3293
(1998-03-05收稿 1998-12-16修回), 百拇医药