反义C-myb寡核苷酸对脑胶质瘤细胞生长抑制作用的初步观察*
作者：游潮 徐学君 张尚福 汤国太
单位：游潮 徐学君 汤国太华西医科大学附属第一医院神经外科; 张尚福 汤国太 华西医科大学附属第一医院神经外科病理科
关键词：寡核苷酸；C-myb；胶质瘤；凋亡
华西医学990136 摘要：目的：研究原癌基因C-myb反义寡核苷酸在裸鼠体内诱导脑胶质瘤细胞凋亡及抑制生长的作用。方法：采用人工合成反义、正义二组硫代脱氧寡核酸(SON)，C6脑胶质瘤瘤体内直接注入法，用游标卡尺检测肿瘤的生长抑制率，HE染色方法检测细胞的凋亡状况。结果：C-myb反义SON组脑胶质瘤细胞的生长明显减慢，瘤细胞凋亡增加。结论：C-myb反义SON能够诱导C6脑胶质瘤细胞的凋亡，激发脑胶质瘤细胞的特异性免疫反应，同时能明显抑制肿瘤细胞的生长。
〔中图分类号〕R739.41
, http://www.100md.com
〔文献标识码〕B
Preliminaary Assessment of Suppressing Gliomas Cell
Growth with C-myb Antisense Oligodeoxy nucleo Tide
YOU Chao，XU Xue-jun，ZHANG Shanɡ-fu,et al
原癌基因C-myb是目前研究最广泛，最活跃的癌基因之一，其通过特异性DNA结合位点的作用来编码一种与细胞增殖调节有关的核酸磷蛋白。C-myb癌基因在多种肿瘤中的过表达促进了瘤细胞的增殖、分裂，并与肿瘤的恶性表型有关，脑胶质瘤中亦存在C-myb的高表达〔1～4〕。本实验采用反义C-myb硫代寡核苷酸进行裸鼠的体内试验，对反义寡核苷酸抑制C6胶质瘤细胞生长作用进行初步观察。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 合成硫代寡核苷酸：采用亚磷酰胺三酯法硫酸修饰合成硫代寡核苷酸(SON)。反义链和正义链各由24个硷基组成，分别与C-myb cDNA第2～9个密码子硷基序列一致与互补。
1.2 C6脑胶质瘤裸鼠动物模型的建立：10～12周龄雌雄性裸鼠共24只，其中雌性10只，雄性14只。将C6胶质瘤细胞株复苏后，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，在37℃，5%CO2条件下培养，每2～3天传代一次，使细胞数达5×107/ml。离心去上清液，用不含牛血清的培养液稀释，使细胞数达5×107/ml。于每只裸鼠右腋皮下接种0.1ml(含细胞数5×106)。常规裸鼠饲养观察。
1.3 反义寡核苷酸给药：当裸鼠接种C6胶质瘤细胞株后10天，肿瘤于皮下长至直径约10mm时，随机将动物分成正义治疗组，反义治疗组和对照组三组(每组8只)。用一次性皮试针(1ml)经皮下直接瘤体内注射药物或生理盐水0.1ml，首次剂量正义组和反义组均为66μg(用生理盐水稀释)，以后间日给药，剂量减为33μg/0.1ml。每四日处死动物2只，共分四次处死完。
, 百拇医药
1.4 肿瘤组织的大体观察：了解肿瘤的大小、形态及与周围组织的关系，用游标卡尺测算肿瘤的体积。注射SON后肿瘤生长抑制率计算公式为：抑制率＝(对照组肿瘤体积-注射SON后肿瘤体积)/对照组肿瘤体积×100%。
1.5 普通切片、HE染色：肿瘤组织用10%福尔马林液固定，常规行石蜡包埋切片。常规染色，在光镜下观察肿瘤细胞坏死、凋亡以及炎性反应情况。
1.6 统计学处理：采用方差分析、F检验、q检验。
2 结 果
2.1 反义SON对C6胶质瘤细胞系生长抑制作用的影响
在首次注药前，先别检测三组动物肿瘤组织的大小，测得其平均值为640mm3(P>0.05)。分别于给药后的第4、8、12、16天每组各处死两只动物，测得其肿瘤的平均值见表1。可见反义C-myb ODNS对C6胶质瘤细胞生长的抑制率分别为第四天66.7%，第八天71.4%，第十二天72%，第十六天78%。
, 百拇医药
表1. 天 数
体积(mm3)
反义治疗组
正义治疗组
对照组
第四天
792
2284.7
2376
第八天
959
3187
3356.5
, http://www.100md.com
第十二天
1808.8
6035
6460
第十六天
2282
10140
10374
反义组与对照组比p<0.05；反义组与正义组比p<0.05；正义组和对照组比p<0.05.
2.2 大体观察：注射反义SON第四天，见肿瘤呈烂鱼肉样，较脆，与周围组织和皮肤易分离，血供不丰富，未见明显坏死和液化灶。第八天反义组2只动物坏死区呈斑片状，正义组和对照组肿瘤仅中心区可见点灶状坏死。第十二天，正义组和对照组各有1只动物肿瘤表面皮肤溃烂、脱落，肿瘤亦呈烂鱼肉样，中心区有坏死和液化区，尤以反义组明显。第十六天，反义组2只动物肿瘤中心坏死液化区已形成大小约4mm×5mm的空腔。
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2.3 HE染色：光镜下见对照组肿瘤中坏死灶呈点片状逐渐增大，最后形成大片坏死区，未见炎性细胞浸润和斑点状钙化，偶见凋亡细胞。正义治疗组所见与对照组基本相似。反义治疗组中见肿瘤细胞片状坏死，并可见较多凋亡细胞。
3 讨 论
近十年，随着分子生物学在肿瘤的发生发展等基础研究中取得的突破性进展，为临床目前难以解决的恶性脑肿瘤治疗带来了用分子靶基因特异性治疗的新方法。反义寡核苷酸为肿瘤的反义基因治疗提供了一个新的、高特异性的治疗手段〔5〕。为了使其在体内保持结构的稳定性，增加对核酸酶的抗性，我们采用对寡核苷酸的磷酸＝酯键骨架中磷原子硫代修饰〔6〕。在证明C6胶质瘤细胞有高水平的C-myb蛋白表达的基础上，采用瘤体内直接注射法，将24个碱基表达的反义寡核苷酸C-myb作用于C6胶质瘤细胞，结果显示其能特异性地抑制C6胶质瘤细胞增殖，并诱导细胞凋亡。其生长抑制具有序列特异性、剂量和时间相关性，与文献报道相同〔7〕。
, 百拇医药
HE染色光镜下见用反义C-myb硫代寡核苷酸治疗的C6胶质瘤内可见炎性细胞(中性粒细胞和网状细胞为主)浸润，以及斑点状钙化灶；且随用药时间的延长而逐渐增多。正义治疗组和对照组中却无上述表现。有学者认为，用反义寡核苷酸转染C6脑胶质瘤细胞后接种于鼠的皮下，不能形成肿瘤，其机制是由于免疫介导所致，因为免疫组织化学检测结果显示，许多胶质瘤细胞被大量的单核细胞浸润，而未被转染的亲代瘤细胞则无单核细胞的浸润，这说明亲代C6胶质瘤细胞避开了宿主的免疫反应。并且认为这些抗肿瘤作用是由于胶质瘤特异性的免疫反应，包括CD8+淋巴细胞介导所致〔8〕。这些免疫细胞侵入肿瘤组织支持了免疫介导的抗肿瘤反应这种观点，而不是病毒载体所携带的特异性硷基序列对恶性脑肿瘤治疗的旁效应。
我们的研究结果还表明，C6胶质瘤细胞直接注射两种SON治疗后，均可抑制细胞的生长和诱导细胞的凋亡，但反义SON对细胞的抑制作用和诱导凋亡作用明显高于正义SON。胶质瘤特异性的免疫反应可能是反义C-mybONDS抑制C6胶质瘤生长的机制之一。所以C-myb在胶质瘤的生长中具有重要地位，作为胶质瘤基因治疗的靶基因之一，有进一步深入研究的价值。
, http://www.100md.com
*卫生部基金资助课题。
*四川省卫生厅资助课题。
参考文献
1.Gewirtz AM et al:Science 1989;245:180.
2.Larocca RV et al:J Neuroscience Research 1989;24:97-106.
3.Welter C et al:Cancer Lett 1990;52:57-62.
4.Walter A et al:Neurosurgery 1996;38:376-383.
5.Stein CA et al:Science 1993;261:1004-1012.
6.Khan IM et al:Nucleic Acids Res 1993;21:2957-2958.
7.Nitta MD et al:Neurosurgery 1994;34:309-315.
8.Trojan J et al:Proc Natl Acad Sci.USA 1992;89:4874-4878.
(1998-10-25收稿), 百拇医药
单位：游潮 徐学君 汤国太华西医科大学附属第一医院神经外科; 张尚福 汤国太 华西医科大学附属第一医院神经外科病理科
关键词：寡核苷酸；C-myb；胶质瘤；凋亡
华西医学990136 摘要：目的：研究原癌基因C-myb反义寡核苷酸在裸鼠体内诱导脑胶质瘤细胞凋亡及抑制生长的作用。方法：采用人工合成反义、正义二组硫代脱氧寡核酸(SON)，C6脑胶质瘤瘤体内直接注入法，用游标卡尺检测肿瘤的生长抑制率，HE染色方法检测细胞的凋亡状况。结果：C-myb反义SON组脑胶质瘤细胞的生长明显减慢，瘤细胞凋亡增加。结论：C-myb反义SON能够诱导C6脑胶质瘤细胞的凋亡，激发脑胶质瘤细胞的特异性免疫反应，同时能明显抑制肿瘤细胞的生长。
〔中图分类号〕R739.41
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〔文献标识码〕B
Preliminaary Assessment of Suppressing Gliomas Cell
Growth with C-myb Antisense Oligodeoxy nucleo Tide
YOU Chao，XU Xue-jun，ZHANG Shanɡ-fu,et al
原癌基因C-myb是目前研究最广泛，最活跃的癌基因之一，其通过特异性DNA结合位点的作用来编码一种与细胞增殖调节有关的核酸磷蛋白。C-myb癌基因在多种肿瘤中的过表达促进了瘤细胞的增殖、分裂，并与肿瘤的恶性表型有关，脑胶质瘤中亦存在C-myb的高表达〔1～4〕。本实验采用反义C-myb硫代寡核苷酸进行裸鼠的体内试验，对反义寡核苷酸抑制C6胶质瘤细胞生长作用进行初步观察。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 合成硫代寡核苷酸：采用亚磷酰胺三酯法硫酸修饰合成硫代寡核苷酸(SON)。反义链和正义链各由24个硷基组成，分别与C-myb cDNA第2～9个密码子硷基序列一致与互补。
1.2 C6脑胶质瘤裸鼠动物模型的建立：10～12周龄雌雄性裸鼠共24只，其中雌性10只，雄性14只。将C6胶质瘤细胞株复苏后，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，在37℃，5%CO2条件下培养，每2～3天传代一次，使细胞数达5×107/ml。离心去上清液，用不含牛血清的培养液稀释，使细胞数达5×107/ml。于每只裸鼠右腋皮下接种0.1ml(含细胞数5×106)。常规裸鼠饲养观察。
1.3 反义寡核苷酸给药：当裸鼠接种C6胶质瘤细胞株后10天，肿瘤于皮下长至直径约10mm时，随机将动物分成正义治疗组，反义治疗组和对照组三组(每组8只)。用一次性皮试针(1ml)经皮下直接瘤体内注射药物或生理盐水0.1ml，首次剂量正义组和反义组均为66μg(用生理盐水稀释)，以后间日给药，剂量减为33μg/0.1ml。每四日处死动物2只，共分四次处死完。
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1.4 肿瘤组织的大体观察：了解肿瘤的大小、形态及与周围组织的关系，用游标卡尺测算肿瘤的体积。注射SON后肿瘤生长抑制率计算公式为：抑制率＝(对照组肿瘤体积-注射SON后肿瘤体积)/对照组肿瘤体积×100%。
1.5 普通切片、HE染色：肿瘤组织用10%福尔马林液固定，常规行石蜡包埋切片。常规染色，在光镜下观察肿瘤细胞坏死、凋亡以及炎性反应情况。
1.6 统计学处理：采用方差分析、F检验、q检验。
2 结 果
2.1 反义SON对C6胶质瘤细胞系生长抑制作用的影响
在首次注药前，先别检测三组动物肿瘤组织的大小，测得其平均值为640mm3(P>0.05)。分别于给药后的第4、8、12、16天每组各处死两只动物，测得其肿瘤的平均值见表1。可见反义C-myb ODNS对C6胶质瘤细胞生长的抑制率分别为第四天66.7%，第八天71.4%，第十二天72%，第十六天78%。
, 百拇医药
表1. 天 数
体积(mm3)
反义治疗组
正义治疗组
对照组
第四天
792
2284.7
2376
第八天
959
3187
3356.5
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第十二天
1808.8
6035
6460
第十六天
2282
10140
10374
反义组与对照组比p<0.05；反义组与正义组比p<0.05；正义组和对照组比p<0.05.
2.2 大体观察：注射反义SON第四天，见肿瘤呈烂鱼肉样，较脆，与周围组织和皮肤易分离，血供不丰富，未见明显坏死和液化灶。第八天反义组2只动物坏死区呈斑片状，正义组和对照组肿瘤仅中心区可见点灶状坏死。第十二天，正义组和对照组各有1只动物肿瘤表面皮肤溃烂、脱落，肿瘤亦呈烂鱼肉样，中心区有坏死和液化区，尤以反义组明显。第十六天，反义组2只动物肿瘤中心坏死液化区已形成大小约4mm×5mm的空腔。
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2.3 HE染色：光镜下见对照组肿瘤中坏死灶呈点片状逐渐增大，最后形成大片坏死区，未见炎性细胞浸润和斑点状钙化，偶见凋亡细胞。正义治疗组所见与对照组基本相似。反义治疗组中见肿瘤细胞片状坏死，并可见较多凋亡细胞。
3 讨 论
近十年，随着分子生物学在肿瘤的发生发展等基础研究中取得的突破性进展，为临床目前难以解决的恶性脑肿瘤治疗带来了用分子靶基因特异性治疗的新方法。反义寡核苷酸为肿瘤的反义基因治疗提供了一个新的、高特异性的治疗手段〔5〕。为了使其在体内保持结构的稳定性，增加对核酸酶的抗性，我们采用对寡核苷酸的磷酸＝酯键骨架中磷原子硫代修饰〔6〕。在证明C6胶质瘤细胞有高水平的C-myb蛋白表达的基础上，采用瘤体内直接注射法，将24个碱基表达的反义寡核苷酸C-myb作用于C6胶质瘤细胞，结果显示其能特异性地抑制C6胶质瘤细胞增殖，并诱导细胞凋亡。其生长抑制具有序列特异性、剂量和时间相关性，与文献报道相同〔7〕。
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HE染色光镜下见用反义C-myb硫代寡核苷酸治疗的C6胶质瘤内可见炎性细胞(中性粒细胞和网状细胞为主)浸润，以及斑点状钙化灶；且随用药时间的延长而逐渐增多。正义治疗组和对照组中却无上述表现。有学者认为，用反义寡核苷酸转染C6脑胶质瘤细胞后接种于鼠的皮下，不能形成肿瘤，其机制是由于免疫介导所致，因为免疫组织化学检测结果显示，许多胶质瘤细胞被大量的单核细胞浸润，而未被转染的亲代瘤细胞则无单核细胞的浸润，这说明亲代C6胶质瘤细胞避开了宿主的免疫反应。并且认为这些抗肿瘤作用是由于胶质瘤特异性的免疫反应，包括CD8+淋巴细胞介导所致〔8〕。这些免疫细胞侵入肿瘤组织支持了免疫介导的抗肿瘤反应这种观点，而不是病毒载体所携带的特异性硷基序列对恶性脑肿瘤治疗的旁效应。
我们的研究结果还表明，C6胶质瘤细胞直接注射两种SON治疗后，均可抑制细胞的生长和诱导细胞的凋亡，但反义SON对细胞的抑制作用和诱导凋亡作用明显高于正义SON。胶质瘤特异性的免疫反应可能是反义C-mybONDS抑制C6胶质瘤生长的机制之一。所以C-myb在胶质瘤的生长中具有重要地位，作为胶质瘤基因治疗的靶基因之一，有进一步深入研究的价值。
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*卫生部基金资助课题。
*四川省卫生厅资助课题。
参考文献
1.Gewirtz AM et al:Science 1989;245:180.
2.Larocca RV et al:J Neuroscience Research 1989;24:97-106.
3.Welter C et al:Cancer Lett 1990;52:57-62.
4.Walter A et al:Neurosurgery 1996;38:376-383.
5.Stein CA et al:Science 1993;261:1004-1012.
6.Khan IM et al:Nucleic Acids Res 1993;21:2957-2958.
7.Nitta MD et al:Neurosurgery 1994;34:309-315.
8.Trojan J et al:Proc Natl Acad Sci.USA 1992;89:4874-4878.
(1998-10-25收稿), 百拇医药