乳腺癌细胞凋亡及相关基因表达的预后研究
作者：吴 炅 沈镇宙 邵志敏
单位：200032 上海医科大学肿瘤医院胸外科，分子生物学实验室
关键词：乳腺癌；预后；细胞凋亡；癌基因
乳腺癌细胞凋亡及相关基因 表达的预后研究 吴 炅 沈镇宙 邵志敏 【摘要】 目的 对细胞凋亡及其相关基因在乳腺癌预后中的作用，以及它们的表达水平与乳腺癌生物学行为的关系进行研究。方法 运用TUNEL法、免疫组化检测乳腺癌组织细胞凋亡水平以及凋亡相关基因bc1-2、bax、p27kipl表达。结果 91例乳腺癌病例中，56/ 91(61.5%)的病例凋亡指数较高，35/ 91(38.5%)凋亡指数较低；bc1-2高表达占29.7%(27/ 91)，bax高表达占30.8%(28/ 91)。181例乳腺癌中，p27kipl高表达占33.1%(60/ 81)。相关性分析发现，bc1-2高表达，AI低的病例，组织学分级高，易出现腋淋巴结转移和术后复发；bax、p27kipl高表达者，组织学分级低，腋淋巴结转移及术后复发少。单因素生存分析显示，AI高，bax、p27kipl高表达，bc1-2低表达的病例，术后无复发生存率、总生存率优于AI低，bax、p27kipl低表达，bc1-2高表达者。COX模型多因素分析发现，bc1-2、p27kipl蛋白具有独立的预后价值；84例淋巴结阴性乳腺癌中，p27kipl表达有独立预后作用。结论 凋亡相关基因bc1-2、bax、p27kipl表达状态失控，使细胞凋亡过程失调，影响乳腺癌生物学行为，bc1-2、p27kipl蛋白具有独立的预后价值。
, 百拇医药
Prognostic significance of apoptosis and its related genes in human breast cancer
WU Jiong, SHEN Zhenzhou, SHAO Zhiming.
Department of Surgery, Molecular Biology Lab Cancer Hospita, Shanghai Medical University, 200032
【Abstract】 Objective The bc1-2 oncogene and bax, p27kipl contribute to the control of apoptosis. It's not clear if their expression levels are correlated with the biological behavior of breat and their prognostic role in breast cancer patients. Methods In human breast cancer tissue sections, we studied the immunohistochemical expression of bc1-2, bax and p27kipl proteins, also detected AI(Apoptotic Index) by tunel. Results 91 cases had data about AI, bc1-2 and bax protein. High and low AI were found in 56/ 91(61.5%) and 35/ 91 (38.5%) patients. High bc1-2 and bax expression were found in 29.7%(27/ 91) and 30.8%(28/ 91) patients relatively. High expression of p27kiplwas seen in 60/ 181(33.1%). In breast cancer tissues, high bcl-2 and low AI were associated with high histologic grade, axillary lymph node metastasis and postoperative recurrence. Higher bax, p27kipl protein expression were reatled to low histologic grade, fewer axillary metastasis and postoperative recurrence. The univariate survival analysis demonstated that patients with high AI, bax, p27kipl and low bc1-2 showed better relapse free survival(RFS) and overall survial(OS). Bc1-2, p27kipl proteins were found to have independent prognostic value in COX's model multivariate analysis. In 84 cases of negation axillary lymph node patients, p27kipl proved to be an independent indicator of patient outcome.Conclusion Our findings indicate that dysrgulated expression of bcl-2, bax and p27kipl apoptosis-related genes are suggestive of serious deregulation of apoptotic process, and may contribute to the biologic aggressiveness of breast cancer. Bcl-2 and p27kipl are of independent indicators of prognosis in breast cancer patients.
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【Key words】 Breast cancer Prognosis Apoptosis Oncogene
细胞凋亡不仅是胚胎发育、组织塑型中的正常生理现象，还同癌症的发生、发展、治疗有关；细胞凋亡同细胞增殖共同维持组织内稳态。已发现一些癌基因、抑癌基因同时参与了细胞凋亡和增殖周期的调控。其中，bcl-2基因族中，bcl-2、bcl-xl有抑制凋亡的作用，bax、bcl-xs则促进凋亡[1]；细胞周期G1期检查点是细胞周期重要的调控环节，抑癌基因p27kipl是周期蛋白激酶/ 周期蛋白复合物的抑制剂，使细胞停滞于G1期，而且有诱导凋亡的作用[2]。
近年来，对细胞凋亡指数(AI)、凋亡相关基因在乳腺癌中的预后作用已有报道，但尚缺少综合的研究报道；p27kipl蛋白表达的预后作用研究甚少，尚缺少p27kipl与细胞凋亡、凋亡相关基因表达水平相关性的研究。
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我们运用免疫组化、TUNEL法检测凋亡指数及相关基因bcl-2、bax、p27kipl在乳腺癌组织中的表达水平，并研究其预后作用。
材料与方法
一、实验材料
(一) 病例 共181例乳腺癌病例，其中91例进行了凋亡指数(AI)、凋亡相关基因bcl-2、bax蛋白表达的检测。全组181例病人均在本院接受治疗和随访。中位年龄51岁(26～70岁)，中位随访时间5年(4～12年)，病理分型、腋淋巴结转移情况均为术后病理组织学检查结果；肿瘤直径为术前病史体检记录之肿瘤最大直径。随访：第一年每3个月一次，第2～3年每半年一次，以后每年一次。有完整的临床、病理及随访资料；本组病例临床及病理资料见表1。石蜡包埋的组织块制成5μm厚的组织切片。
(二) 免疫组化试剂 p27kipl单抗(G173-524)购自美国Pharmingen公司，工作浓度1∶100。bcl-2单抗(100)、bax多抗(N-20)购自美国Santa Cruz公司，工作浓度bcl-2为1∶100,bax为1∶40；LSAB+试剂盒购自丹麦DAKO公司(K0679，生物素化抗兔、抗鼠、抗羊免疫球蛋白-链霉亲素和过氧化物酶)；DAB购自DAKO公司。
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(三) 细胞凋亡原位检测试剂盒 细胞凋亡原位检测试剂盒(POD)购自德国Boehringer Mannheim公司(Cat. No. 1684817)。
二、实验方法
表1 本组病人的临床和实验室资料
临床病理资料
病例数
百分率(%)
肿块最大直径
<3cm
36
19.9
≥3cm
, 百拇医药
145
70.1
腋淋巴结状态
无转移
84
46.4
1～3个
44
24.3
>3个
53
29.3
受体状态
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ER阳性
79
43.6
ER阴性
102
56.4
组织学分级(n=160)
1级
76
47.5
2级
53
33.1
, 百拇医药
3级
31
19.4
局部复发
有
8
4.4
无
173
95.6
远处转移
有
44
, 百拇医药 24.3
无
137
75.7
凋亡指数(AI)(n=91)
0～0.21
56
61.5
0.28～0.62
35
38.5
bcl-2(n=91)
低表达
, 百拇医药
64
70.3
高表达
27
29.7
bax(n=91)
低表达
63
69.2
高表达
28
30.8
p27Kipl(n=181)
, 百拇医药
低表达
121
66.9
高表达
60
33.1
(一) 免疫组化染色 采用LSAB法，加一抗前，进行高温抗原修复。
(二) 结果判断 p27Kipl阳性着色定位于细胞核，bcl-2、bax阳性着色定位于细胞浆，随机选择10个高倍视野，计数1000个肿瘤细胞，计算阳性细胞百分率。<10%为(-)，10%～50%为(+)，>50%为(++)。生存分析中，将(-)、(+)归为低表达组，(++)归为高表达组。
细胞凋亡指数(Apoptotic Index, AI)计数法：每张切片选取阳性染色最明显的5个高倍视野，共计数500个肿瘤细胞，记录其中凋亡细胞数。凋亡指数由以下公式计算：
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AI(%)=(凋亡细胞数)/(500)×100%
(三) Bloom和Richardson's组织学分级 参照Elston和Ellis改良方法[3]。对本组乳腺癌病例HE切片进行评分，标准如下：腺管形成：明显1分，中等2分，无3分；核异形性：少见1分，中等2分，明显3分；每高倍视野下核分裂组：<1个1分，1～5个2分，>5个3分。以上三项得分相加，积分3～5分者，组织学分级为1级，6～7分者分级为2级，8～9分者分级为3级。
(四) 统计方法 采用上海市肿瘤研究所流行病室统计软件SPSS软件包，运用非参数统计中Spearman等级相关对p27kipl、AI、bcl-2、bax表达与临床及病理指标的相关性进行分析；应用Kaplan-meier法进行单因素生存分析，时序检验(log rank test)，根据寿命表各随访年份生存率作生存曲线；应用COX比例风险模型进行生存的多因素分析。所有运算均在IBM-PC微机上进行。 结果
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一、乳腺癌组织中凋亡指数、凋亡相关基因bcl-2、bax、p27kipl表达水平
凋亡细胞散在分布，细胞核染成棕色，部分凋亡细胞核明显缩小，但核膜、胞膜完整，核染色质浓缩，贴近核膜，形似半月形、镰刀状；部分区域可观察到凋亡小体。另一部分凋亡细胞形态与正常细胞无明显区别，唯有细胞核染成棕色。56例(61.5%)凋亡指数为0～0.21,35例(38.5%)凋亡指数为0.28～0.62。
bcl-2、bax蛋白阳性产物定位于胞浆，呈棕色颗粒状，部分阳性染色定位于核膜、胞膜。在乳腺癌组织中，上述两蛋白产物呈异质性表达。bcl-2阳性率为60/ 91(65.9%)，bax阳性率为59/ 91(64.8%)，bcl-2强阳性27/ 91(29.7%),bax强阳性28/ 91(30.8%)。
p27kipl蛋白产物在乳腺癌组织石蜡切片中阳性着色定位于细胞核。阳性病例125/ 181(69.1%)，强阳性60/ 181(33.1%)。该蛋白在乳腺癌组织中表达呈异质性。
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二、乳腺癌AI、凋亡相关基因表达与临床、病理指标的相关性分析(表2)
bcl-2蛋白高表达、AI低的病例，组织学分级高，易出现腋淋巴结转移、术后局部复发与转移；bcl-2表达与乳腺癌组织中ER水平呈正相关。
bax、p27kipl蛋白高表达组，腋淋巴结转移少，术后局部复发与转移少，组织学分级较低。
三、AI、凋亡相关基因相互间关系的研究(表2)
AI高的病例，bcl-2蛋白低表达；bcl-2与bax、p27kipl蛋白表达之间存在明显的负相关。
四、生存分析
(一) 单因素生存分析 AI高，bax、p27kipl蛋白高表达，bcl-2蛋白低表达的病例，术后无复发生存率、总生存率优于AI低，bax、p27kipl蛋白低表达，bcl-2蛋白高表达的病例。
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(二) 多因素生存分析 对91例和181例病人分别进行COX模型多因素分析，发现bcl-2和p27kipl蛋白具有独立的预后价值。
(三) 不同bcl-2/ AI、bax/ AI、p27/ AI、bcl-2/bax表型乳腺癌患者术后生存情况 见表3，在上述不同表型的乳腺癌患者中，bcl-2(H)/ AI(L)、bax(L)/ AI(L)、bcl/2(H)/ bax(L)、p27(L)/ AI(L)表型的患者在各自的组别中预后最差。其复发和死亡人数分别占75%、43.5%、76%、48%，有显著的统计学意义(P<0.05)。
表2 乳腺癌组织AI、bcl-2、bax、p27Kipl表达与临床病理指标以及相互间的关系
AI
bcl-2
, 百拇医药
bax
p27Kipl
rs
P
rs
P
rs
P
rs
P
组织学分级
-0.479
0.000
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0.527
0.000
-0.611
0.000
-0.303
0.000
腋淋巴结转移
-0.292
0.006
0.480
0.000
-0.510
0.000
, 百拇医药
-0.589
0.000
局部复发
-0.127
0.105
0.282
0.007
-0.256
0.015
-0.175
0.019
远处转移
-0.206
, 百拇医药
0.051
0.454
0.000
-0.404
0.000
-0.342
0.000
bcl-2
-0.699
0.000
-
-
-
, 百拇医药
-
-
-
bax
0.568
0.000
-0.564
0.000
-
-
-
-
p27Kipl
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0.189
0.075
-0.466
0.000
0.478
0.000
-
-
Spearman等级相关检验，rs为相关系数 表3 不同bcl-2/ AI、bcl-2/ bax、bax/ AI、p27/ AI表型的
乳腺癌患者的生存情况
表型
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例数
健康例数
复发例数
死亡例数
bcl-2/ AI
bcl-2(H) AI(L)
24
6(25%)
10(41.7%)
8(33.3%)
bcl-2(L) AI(H)
32
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30(93.8%)
1(3.1%)
1(3.1%)
bax/ AI
bax(H) AI(H)
18
17(94.4%)
1(5.6%)
0(0)
bax(L) AI(L)
46
26(56.5%)
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11(23.9%)
9(19.6%)
bcl-2/ bax
bcl-2(H) bax(L)
25
6(24%)
11(44%)
8(32%)
bcl-2(L) bax(H)
26
26(100%)
0(0)
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0(0)
p27/ AI
p27(H) AI(H)
14
14(100%)
0(0)
0(0)
p27(L) AI(L)
37
19(52%)
9(24%)
9(24%)
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H:高表达；L：低表达
(四) 淋巴结阴性乳腺癌中p27kipl蛋白表达的预后作用 见表4，在84例淋巴结阴性乳腺癌中的多因素生存分析显示，p27kipl蛋白表达对于术后无复发生存率和总生存率均有独立的预后作用。 讨论
细胞凋亡是在内源性多基因调控下实现的编程性细胞死亡过程。一些癌基因与肿瘤抑制基因参与了上述调控过程[4]。bcl-2基因族是细胞凋亡的重要调节因子，其成员主要包括bcl-2、bax、bcl-x1、bcl-xs、MCL-1等；在调节凋亡方面的功能表现为bcl-2、bcl-xl、MCL-1抑制调亡；bax、bcl-xs、bak、bad则加速凋亡。p27kipl是细胞周期G1期负向调节因子，是Cdk2/ cyclin E复合物的抑制剂，可使细胞周期停滞于G1期[5]，并可在体外诱导乳腺癌细胞发生凋亡。
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我们通过免疫组化染色，研究bcl-2、bax、p27kipl蛋白产物在乳腺癌组织中的表达，发现两种蛋白阳性着色定位于胞浆，少量核膜着色，bcl-2阳性率65.9%，bax阳性率64.8%，与文献报道相符[6，7]。p27kipl阳性着色定位于细胞核，正常导管上皮、肌上皮、内皮细胞均有阳性着色，并可资内对照，p27kipl在本组乳腺癌组织表达阳性率69.1%，与文献报道一致[8]。与临床、病理资料相关性分析发现：bcl-2蛋白表达水平与凋亡指数、bax蛋白表达水平呈负相关；而bax表达水平与凋亡指数正相关，说明了在凋亡的调控中，上述两蛋白产物有相互抑制的作用；同时证实了在乳腺癌中bcl-2抑制凋亡，而bax有加速凋亡的作用。p27kipl与bax正相关，与AI接近正相关，与bcl-2负相关。说明p27kipl生G1期停滞作用后，在细胞凋亡相关基因bcl-2、bax的相应改变下，细胞凋亡增加。由于p27kipl主要抑制G1后期细胞即在进入S期前不久的细胞，说明这组变异、DNA受损细胞在经历G1期停滞后，无法被修复，基本上以细胞凋亡的方式结束使命。我们还发现，bcl-2蛋白表达与腋淋巴结转移情况、组织学分级、术后局部复发与转移均呈正相关；bax表达与淋巴结转移、组织学分级、TNM分期、术后复发与转移为负相关，说明上述凋亡相关蛋白产物有助于判断乳腺癌的分化水平。在乳腺癌组织中，bcl-2、bax蛋白异常表达，提示凋亡进程失凋，可能导致肿瘤进展。p27kipl蛋白表达抑制与肿瘤高分级、肿瘤直径大、腋淋巴结转移、术后局部复发及远处转移均有相关性，说明p27kipl蛋白低表达组病例，肿瘤恶性程度增高。
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在对影响乳腺癌生存率的各因素进行分析后，我们发现：在单因素生存分析中，bcl-2、bax、p27kipl蛋白表达水平及凋亡指数是除了组织学分级、肿块大小、腋淋巴结转移情况之外有意义的预后指标；经多因素检验，bcl-2、p27kipl蛋白表达水平是有独立预后意义的指标。在淋巴结阴性的84例乳腺癌病例中，p27kipl蛋白表达具有独立的预后作用，低表达者可提示术后复发或转移，有较高的临床应用价值。
我们对不同bcl-2/ AI、bcl-2/ bax、bax/ AI、p27/ AI表型的乳腺癌患者的生存情况进行分析，发现bcl-2(H)/ AI(L)、bax(L)/ AI(L)、bcl-2(H)/ bax(L)、p27(L)/ AI(L)表型的患者在各自的组别中预后最差。其复发和死亡例数分别占75%、43.5%、76%、48%，说明综合研究细胞凋亡、G1期检查点及其相关蛋白表达水平为乳腺癌预后提供更有价值的预后指标。
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本研究通过检测凋亡指数及凋亡相关基因bcl-2、bax、p27kipl蛋白在乳腺癌组织中的表达水平，并进行生存分析，证实了bcl-2、p27kipl蛋白表达具有独立预后价值，有助于临床选择高危复发病例，提高预后水平，给予积极治疗，并可作为建立乳腺癌预后模型的重要指标。
表4 84例淋巴结阴性乳腺癌术后生存情况的多因素分析
预后因子
无复发生存率
总生存率
危险度(95%可信限)
P
危险度(95%可信限)
, 百拇医药
P
p27
0.1734(0.0541～0.5859)
0.003
0.2646(0.0703～0.9964)
0.049
组织分级
3.546(1.124～11.19)
0.031
2.555(0.5242～12.46)
0.246
, http://www.100md.com TNM分期
5.169(0.8517～31.37)
0.074
3.916(0.5913～25.93)
0.157
ER
0.8723(0.7195～0.9866)
0.817
0.7343(0.5721～0.8962)
0.633
参考文献
, 百拇医药 [1] Reed JC. Bcl-2 and the regulation of programmed cell death. J Cell Biol, 1994,124:1-5.
[2] Katayose Y, Kim M, Rakkar ANS, et al. Promoting apoptosis: A novel activity associated with the cyclin-dependent kinase inhibitor p27. Cancer Res, 1997,57:5441-5445.
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(收稿：1998-10-07), 百拇医药
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乳腺癌细胞凋亡及相关基因 表达的预后研究 吴 炅 沈镇宙 邵志敏 【摘要】 目的 对细胞凋亡及其相关基因在乳腺癌预后中的作用，以及它们的表达水平与乳腺癌生物学行为的关系进行研究。方法 运用TUNEL法、免疫组化检测乳腺癌组织细胞凋亡水平以及凋亡相关基因bc1-2、bax、p27kipl表达。结果 91例乳腺癌病例中，56/ 91(61.5%)的病例凋亡指数较高，35/ 91(38.5%)凋亡指数较低；bc1-2高表达占29.7%(27/ 91)，bax高表达占30.8%(28/ 91)。181例乳腺癌中，p27kipl高表达占33.1%(60/ 81)。相关性分析发现，bc1-2高表达，AI低的病例，组织学分级高，易出现腋淋巴结转移和术后复发；bax、p27kipl高表达者，组织学分级低，腋淋巴结转移及术后复发少。单因素生存分析显示，AI高，bax、p27kipl高表达，bc1-2低表达的病例，术后无复发生存率、总生存率优于AI低，bax、p27kipl低表达，bc1-2高表达者。COX模型多因素分析发现，bc1-2、p27kipl蛋白具有独立的预后价值；84例淋巴结阴性乳腺癌中，p27kipl表达有独立预后作用。结论 凋亡相关基因bc1-2、bax、p27kipl表达状态失控，使细胞凋亡过程失调，影响乳腺癌生物学行为，bc1-2、p27kipl蛋白具有独立的预后价值。
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WU Jiong, SHEN Zhenzhou, SHAO Zhiming.
Department of Surgery, Molecular Biology Lab Cancer Hospita, Shanghai Medical University, 200032
【Abstract】 Objective The bc1-2 oncogene and bax, p27kipl contribute to the control of apoptosis. It's not clear if their expression levels are correlated with the biological behavior of breat and their prognostic role in breast cancer patients. Methods In human breast cancer tissue sections, we studied the immunohistochemical expression of bc1-2, bax and p27kipl proteins, also detected AI(Apoptotic Index) by tunel. Results 91 cases had data about AI, bc1-2 and bax protein. High and low AI were found in 56/ 91(61.5%) and 35/ 91 (38.5%) patients. High bc1-2 and bax expression were found in 29.7%(27/ 91) and 30.8%(28/ 91) patients relatively. High expression of p27kiplwas seen in 60/ 181(33.1%). In breast cancer tissues, high bcl-2 and low AI were associated with high histologic grade, axillary lymph node metastasis and postoperative recurrence. Higher bax, p27kipl protein expression were reatled to low histologic grade, fewer axillary metastasis and postoperative recurrence. The univariate survival analysis demonstated that patients with high AI, bax, p27kipl and low bc1-2 showed better relapse free survival(RFS) and overall survial(OS). Bc1-2, p27kipl proteins were found to have independent prognostic value in COX's model multivariate analysis. In 84 cases of negation axillary lymph node patients, p27kipl proved to be an independent indicator of patient outcome.Conclusion Our findings indicate that dysrgulated expression of bcl-2, bax and p27kipl apoptosis-related genes are suggestive of serious deregulation of apoptotic process, and may contribute to the biologic aggressiveness of breast cancer. Bcl-2 and p27kipl are of independent indicators of prognosis in breast cancer patients.
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【Key words】 Breast cancer Prognosis Apoptosis Oncogene
细胞凋亡不仅是胚胎发育、组织塑型中的正常生理现象，还同癌症的发生、发展、治疗有关；细胞凋亡同细胞增殖共同维持组织内稳态。已发现一些癌基因、抑癌基因同时参与了细胞凋亡和增殖周期的调控。其中，bcl-2基因族中，bcl-2、bcl-xl有抑制凋亡的作用，bax、bcl-xs则促进凋亡[1]；细胞周期G1期检查点是细胞周期重要的调控环节，抑癌基因p27kipl是周期蛋白激酶/ 周期蛋白复合物的抑制剂，使细胞停滞于G1期，而且有诱导凋亡的作用[2]。
近年来，对细胞凋亡指数(AI)、凋亡相关基因在乳腺癌中的预后作用已有报道，但尚缺少综合的研究报道；p27kipl蛋白表达的预后作用研究甚少，尚缺少p27kipl与细胞凋亡、凋亡相关基因表达水平相关性的研究。
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我们运用免疫组化、TUNEL法检测凋亡指数及相关基因bcl-2、bax、p27kipl在乳腺癌组织中的表达水平，并研究其预后作用。
材料与方法
一、实验材料
(一) 病例 共181例乳腺癌病例，其中91例进行了凋亡指数(AI)、凋亡相关基因bcl-2、bax蛋白表达的检测。全组181例病人均在本院接受治疗和随访。中位年龄51岁(26～70岁)，中位随访时间5年(4～12年)，病理分型、腋淋巴结转移情况均为术后病理组织学检查结果；肿瘤直径为术前病史体检记录之肿瘤最大直径。随访：第一年每3个月一次，第2～3年每半年一次，以后每年一次。有完整的临床、病理及随访资料；本组病例临床及病理资料见表1。石蜡包埋的组织块制成5μm厚的组织切片。
(二) 免疫组化试剂 p27kipl单抗(G173-524)购自美国Pharmingen公司，工作浓度1∶100。bcl-2单抗(100)、bax多抗(N-20)购自美国Santa Cruz公司，工作浓度bcl-2为1∶100,bax为1∶40；LSAB+试剂盒购自丹麦DAKO公司(K0679，生物素化抗兔、抗鼠、抗羊免疫球蛋白-链霉亲素和过氧化物酶)；DAB购自DAKO公司。
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(三) 细胞凋亡原位检测试剂盒 细胞凋亡原位检测试剂盒(POD)购自德国Boehringer Mannheim公司(Cat. No. 1684817)。
二、实验方法
表1 本组病人的临床和实验室资料
临床病理资料
病例数
百分率(%)
肿块最大直径
<3cm
36
19.9
≥3cm
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145
70.1
腋淋巴结状态
无转移
84
46.4
1～3个
44
24.3
>3个
53
29.3
受体状态
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ER阳性
79
43.6
ER阴性
102
56.4
组织学分级(n=160)
1级
76
47.5
2级
53
33.1
, 百拇医药
3级
31
19.4
局部复发
有
8
4.4
无
173
95.6
远处转移
有
44
, 百拇医药 24.3
无
137
75.7
凋亡指数(AI)(n=91)
0～0.21
56
61.5
0.28～0.62
35
38.5
bcl-2(n=91)
低表达
, 百拇医药
64
70.3
高表达
27
29.7
bax(n=91)
低表达
63
69.2
高表达
28
30.8
p27Kipl(n=181)
, 百拇医药
低表达
121
66.9
高表达
60
33.1
(一) 免疫组化染色 采用LSAB法，加一抗前，进行高温抗原修复。
(二) 结果判断 p27Kipl阳性着色定位于细胞核，bcl-2、bax阳性着色定位于细胞浆，随机选择10个高倍视野，计数1000个肿瘤细胞，计算阳性细胞百分率。<10%为(-)，10%～50%为(+)，>50%为(++)。生存分析中，将(-)、(+)归为低表达组，(++)归为高表达组。
细胞凋亡指数(Apoptotic Index, AI)计数法：每张切片选取阳性染色最明显的5个高倍视野，共计数500个肿瘤细胞，记录其中凋亡细胞数。凋亡指数由以下公式计算：
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AI(%)=(凋亡细胞数)/(500)×100%
(三) Bloom和Richardson's组织学分级 参照Elston和Ellis改良方法[3]。对本组乳腺癌病例HE切片进行评分，标准如下：腺管形成：明显1分，中等2分，无3分；核异形性：少见1分，中等2分，明显3分；每高倍视野下核分裂组：<1个1分，1～5个2分，>5个3分。以上三项得分相加，积分3～5分者，组织学分级为1级，6～7分者分级为2级，8～9分者分级为3级。
(四) 统计方法 采用上海市肿瘤研究所流行病室统计软件SPSS软件包，运用非参数统计中Spearman等级相关对p27kipl、AI、bcl-2、bax表达与临床及病理指标的相关性进行分析；应用Kaplan-meier法进行单因素生存分析，时序检验(log rank test)，根据寿命表各随访年份生存率作生存曲线；应用COX比例风险模型进行生存的多因素分析。所有运算均在IBM-PC微机上进行。 结果
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一、乳腺癌组织中凋亡指数、凋亡相关基因bcl-2、bax、p27kipl表达水平
凋亡细胞散在分布，细胞核染成棕色，部分凋亡细胞核明显缩小，但核膜、胞膜完整，核染色质浓缩，贴近核膜，形似半月形、镰刀状；部分区域可观察到凋亡小体。另一部分凋亡细胞形态与正常细胞无明显区别，唯有细胞核染成棕色。56例(61.5%)凋亡指数为0～0.21,35例(38.5%)凋亡指数为0.28～0.62。
bcl-2、bax蛋白阳性产物定位于胞浆，呈棕色颗粒状，部分阳性染色定位于核膜、胞膜。在乳腺癌组织中，上述两蛋白产物呈异质性表达。bcl-2阳性率为60/ 91(65.9%)，bax阳性率为59/ 91(64.8%)，bcl-2强阳性27/ 91(29.7%),bax强阳性28/ 91(30.8%)。
p27kipl蛋白产物在乳腺癌组织石蜡切片中阳性着色定位于细胞核。阳性病例125/ 181(69.1%)，强阳性60/ 181(33.1%)。该蛋白在乳腺癌组织中表达呈异质性。
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二、乳腺癌AI、凋亡相关基因表达与临床、病理指标的相关性分析(表2)
bcl-2蛋白高表达、AI低的病例，组织学分级高，易出现腋淋巴结转移、术后局部复发与转移；bcl-2表达与乳腺癌组织中ER水平呈正相关。
bax、p27kipl蛋白高表达组，腋淋巴结转移少，术后局部复发与转移少，组织学分级较低。
三、AI、凋亡相关基因相互间关系的研究(表2)
AI高的病例，bcl-2蛋白低表达；bcl-2与bax、p27kipl蛋白表达之间存在明显的负相关。
四、生存分析
(一) 单因素生存分析 AI高，bax、p27kipl蛋白高表达，bcl-2蛋白低表达的病例，术后无复发生存率、总生存率优于AI低，bax、p27kipl蛋白低表达，bcl-2蛋白高表达的病例。
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(二) 多因素生存分析 对91例和181例病人分别进行COX模型多因素分析，发现bcl-2和p27kipl蛋白具有独立的预后价值。
(三) 不同bcl-2/ AI、bax/ AI、p27/ AI、bcl-2/bax表型乳腺癌患者术后生存情况 见表3，在上述不同表型的乳腺癌患者中，bcl-2(H)/ AI(L)、bax(L)/ AI(L)、bcl/2(H)/ bax(L)、p27(L)/ AI(L)表型的患者在各自的组别中预后最差。其复发和死亡人数分别占75%、43.5%、76%、48%，有显著的统计学意义(P<0.05)。
表2 乳腺癌组织AI、bcl-2、bax、p27Kipl表达与临床病理指标以及相互间的关系
AI
bcl-2
, 百拇医药
bax
p27Kipl
rs
P
rs
P
rs
P
rs
P
组织学分级
-0.479
0.000
, http://www.100md.com
0.527
0.000
-0.611
0.000
-0.303
0.000
腋淋巴结转移
-0.292
0.006
0.480
0.000
-0.510
0.000
, 百拇医药
-0.589
0.000
局部复发
-0.127
0.105
0.282
0.007
-0.256
0.015
-0.175
0.019
远处转移
-0.206
, 百拇医药
0.051
0.454
0.000
-0.404
0.000
-0.342
0.000
bcl-2
-0.699
0.000
-
-
-
, 百拇医药
-
-
-
bax
0.568
0.000
-0.564
0.000
-
-
-
-
p27Kipl
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0.189
0.075
-0.466
0.000
0.478
0.000
-
-
Spearman等级相关检验，rs为相关系数 表3 不同bcl-2/ AI、bcl-2/ bax、bax/ AI、p27/ AI表型的
乳腺癌患者的生存情况
表型
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例数
健康例数
复发例数
死亡例数
bcl-2/ AI
bcl-2(H) AI(L)
24
6(25%)
10(41.7%)
8(33.3%)
bcl-2(L) AI(H)
32
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30(93.8%)
1(3.1%)
1(3.1%)
bax/ AI
bax(H) AI(H)
18
17(94.4%)
1(5.6%)
0(0)
bax(L) AI(L)
46
26(56.5%)
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11(23.9%)
9(19.6%)
bcl-2/ bax
bcl-2(H) bax(L)
25
6(24%)
11(44%)
8(32%)
bcl-2(L) bax(H)
26
26(100%)
0(0)
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0(0)
p27/ AI
p27(H) AI(H)
14
14(100%)
0(0)
0(0)
p27(L) AI(L)
37
19(52%)
9(24%)
9(24%)
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H:高表达；L：低表达
(四) 淋巴结阴性乳腺癌中p27kipl蛋白表达的预后作用 见表4，在84例淋巴结阴性乳腺癌中的多因素生存分析显示，p27kipl蛋白表达对于术后无复发生存率和总生存率均有独立的预后作用。 讨论
细胞凋亡是在内源性多基因调控下实现的编程性细胞死亡过程。一些癌基因与肿瘤抑制基因参与了上述调控过程[4]。bcl-2基因族是细胞凋亡的重要调节因子，其成员主要包括bcl-2、bax、bcl-x1、bcl-xs、MCL-1等；在调节凋亡方面的功能表现为bcl-2、bcl-xl、MCL-1抑制调亡；bax、bcl-xs、bak、bad则加速凋亡。p27kipl是细胞周期G1期负向调节因子，是Cdk2/ cyclin E复合物的抑制剂，可使细胞周期停滞于G1期[5]，并可在体外诱导乳腺癌细胞发生凋亡。
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我们通过免疫组化染色，研究bcl-2、bax、p27kipl蛋白产物在乳腺癌组织中的表达，发现两种蛋白阳性着色定位于胞浆，少量核膜着色，bcl-2阳性率65.9%，bax阳性率64.8%，与文献报道相符[6，7]。p27kipl阳性着色定位于细胞核，正常导管上皮、肌上皮、内皮细胞均有阳性着色，并可资内对照，p27kipl在本组乳腺癌组织表达阳性率69.1%，与文献报道一致[8]。与临床、病理资料相关性分析发现：bcl-2蛋白表达水平与凋亡指数、bax蛋白表达水平呈负相关；而bax表达水平与凋亡指数正相关，说明了在凋亡的调控中，上述两蛋白产物有相互抑制的作用；同时证实了在乳腺癌中bcl-2抑制凋亡，而bax有加速凋亡的作用。p27kipl与bax正相关，与AI接近正相关，与bcl-2负相关。说明p27kipl生G1期停滞作用后，在细胞凋亡相关基因bcl-2、bax的相应改变下，细胞凋亡增加。由于p27kipl主要抑制G1后期细胞即在进入S期前不久的细胞，说明这组变异、DNA受损细胞在经历G1期停滞后，无法被修复，基本上以细胞凋亡的方式结束使命。我们还发现，bcl-2蛋白表达与腋淋巴结转移情况、组织学分级、术后局部复发与转移均呈正相关；bax表达与淋巴结转移、组织学分级、TNM分期、术后复发与转移为负相关，说明上述凋亡相关蛋白产物有助于判断乳腺癌的分化水平。在乳腺癌组织中，bcl-2、bax蛋白异常表达，提示凋亡进程失凋，可能导致肿瘤进展。p27kipl蛋白表达抑制与肿瘤高分级、肿瘤直径大、腋淋巴结转移、术后局部复发及远处转移均有相关性，说明p27kipl蛋白低表达组病例，肿瘤恶性程度增高。
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在对影响乳腺癌生存率的各因素进行分析后，我们发现：在单因素生存分析中，bcl-2、bax、p27kipl蛋白表达水平及凋亡指数是除了组织学分级、肿块大小、腋淋巴结转移情况之外有意义的预后指标；经多因素检验，bcl-2、p27kipl蛋白表达水平是有独立预后意义的指标。在淋巴结阴性的84例乳腺癌病例中，p27kipl蛋白表达具有独立的预后作用，低表达者可提示术后复发或转移，有较高的临床应用价值。
我们对不同bcl-2/ AI、bcl-2/ bax、bax/ AI、p27/ AI表型的乳腺癌患者的生存情况进行分析，发现bcl-2(H)/ AI(L)、bax(L)/ AI(L)、bcl-2(H)/ bax(L)、p27(L)/ AI(L)表型的患者在各自的组别中预后最差。其复发和死亡例数分别占75%、43.5%、76%、48%，说明综合研究细胞凋亡、G1期检查点及其相关蛋白表达水平为乳腺癌预后提供更有价值的预后指标。
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本研究通过检测凋亡指数及凋亡相关基因bcl-2、bax、p27kipl蛋白在乳腺癌组织中的表达水平，并进行生存分析，证实了bcl-2、p27kipl蛋白表达具有独立预后价值，有助于临床选择高危复发病例，提高预后水平，给予积极治疗，并可作为建立乳腺癌预后模型的重要指标。
表4 84例淋巴结阴性乳腺癌术后生存情况的多因素分析
预后因子
无复发生存率
总生存率
危险度(95%可信限)
P
危险度(95%可信限)
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P
p27
0.1734(0.0541～0.5859)
0.003
0.2646(0.0703～0.9964)
0.049
组织分级
3.546(1.124～11.19)
0.031
2.555(0.5242～12.46)
0.246
, http://www.100md.com TNM分期
5.169(0.8517～31.37)
0.074
3.916(0.5913～25.93)
0.157
ER
0.8723(0.7195～0.9866)
0.817
0.7343(0.5721～0.8962)
0.633
参考文献
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(收稿：1998-10-07), 百拇医药