云芝糖肽对人外周血淋巴细胞增殖和T细胞亚群变化的调节作用△
作者：梁中琴 盛伟华 王晓霞 杨吉成** 顾振纶
单位：梁中琴 盛伟华王晓霞 杨吉成** 顾振纶苏州医学院药理教研室(215007)
关键词：云芝糖肽；人外周血淋巴细胞；增殖；T细胞亚群
中草药/990119 摘 要 用流式细胞仪技术和MTT法观察了云芝糖肽(PSP)对由植物血凝素(PHA)诱导的人外周血淋巴细胞(PBL)增殖和T细胞亚群变化的调节作用。结果表明，50～100 μg/mL PSP对经PHA诱导的人PBL增殖有显著的促进作用(P<0.05)，该浓度的PSP也能促进细胞从G1期进入S期，并可使CD+4细胞明显升高，使CD+4/CD+8细胞比例增加，提示PSP具有免疫促进作用。
, 百拇医药
Regulatory Effect of Polysacchariopeptide on Human Peripheral Blood LymphocyteProliferation and T Lymphocyte Subpopulation
Liang Zhongqin, Sheng Weihua, Wang Xiaoxia, et al.
(Department of Pharmacology, Suzhou Medical College, Suzhou 215007)
Abstract Regulatory effect of polysaccheriopeptide (PSP) on human peripheral blood lymphocyte (PBL) proliferation and T lymphocyte subpopulation was studied.
, 百拇医药
The results showed that: phytohemagglutinin (PHA)-activated human PBL could increase proliferation especially after treated with PSP in concentrations of 50～100 μg/mL. In this study, the effect of PSP on cell cycling induced by PHA was investigated, DNA synthesis measured by a flowcytometer was shown to be increased but not in a dose-dependant manner. Cell cycling analysis demonstrated that the increment was mainly at the stage when cells enter S phase.
It was observed that in PSP treated cases CD+4 cell group increased, suggested that PSP has certain immunoregulatory effect in improving proliferation of activated human PBL, and increasing the CD+4 cell group.
, http://www.100md.com
Key words polysacchariopeptide human peripheral blood lymphocyte T lymphocyte subpopulation
近年来实验研究证明，云芝糖肽(polysacchariopeptied, PSP)具有广泛的药理作用，特别对机体的免疫功能具有调节和增强作用〔1～3〕。但PSP对人外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyles, PBL)作用的体外实验研究迄今未见报道。我们研究了PSP对PHA诱导的人PBL的增殖作用和对T细胞亚群变化的影响，为云芝糖肽的免疫调节作用提供新的药效学资料。
1 材料
云芝糖肽系多孔菌科真菌云芝Coriolus versicolor (L.ex.Fr.) Quel cov-1菌株中提取的蛋白多糖肽，由上海师范大学微生物与免疫学研究所杨庆尧教授提供，淡褐色粉末，0.1 g溶于10 mL 1640培养液中，经无菌过滤后置冰箱保存；人白细胞取自昆山中心血站提供的健康人外周血；MTT、碘化丙啶(PI)为Sigma产品；CD+4、CD+8单抗为北京邦定生物医药公司产品。
, 百拇医药
2 方法
2.1 PBL的分离：取健康人的白细胞5份，分别用含有10 U/mL肝素和100 U/mL双抗的无钙镁磷酸缓冲液(PBS)稀释后，再用淋巴细胞分层液(体积质量比为1.077)分离淋巴细胞，用PBS离心洗涤2 次，最后用1640培养液(含小牛血清10%，双抗100 U/mL)调细胞数为1×106/mL备用。
2.2 PBL增殖活性检测
2.2.1 MTT比色法〔4〕：将细胞加入96孔培养板中，加入不同浓度的PSP(6～800 μg/mL)，稳定培养10 h后加入PHA(终浓度为100 μg/mL)，37℃、5%CO2条件下培养72 h，在细胞培养结束前4 h加入MTT(噻唑蓝，使用浓度为5 mg/mL, 10 μL/孔)，4 h后用酸化十二烷基磺酸钠(SDS)终止反应，以MR-710型酶标仪测OD值(参考波长630 nm，实验波长570 nm)。
, 百拇医药
2.2.2 流式细胞仪(FACS)检测细胞周期〔5〕：以不同浓度的PSP(5和100 μg/mL)与人PBL(5×106/mL)、PHA(100 μg/mL)共同培养72 h后收获细胞，以冷的PBS洗涤2次，细胞沉淀用70%乙醇混匀备用，上机前用PBS洗涤后再用PBS调细胞浓度为1×106/mL，加入RNA酶50 μg/mL，37℃水浴作用30 min后置冰浴终止反应，每毫升细胞悬液加PI染液100 μL(1 μg/mL)，暗室中放置30 min后，用流式细胞仪分析细胞周期。
2.3 T细胞亚群的双标记检测〔6〕：选择促进增殖效应最佳浓度的PSP(50～100 μg/mL)与人PBL及PHA混合培养至48 h，调细胞浓度为1×106/mL，每个样品分别加入CD+4、CD+8单抗，同时加入荧光素标记的羊抗鼠IgG抗体及抗体稀释液各100 μL，放置4℃冰箱30 min，洗涤2次后用流式细胞仪检测，每份标本测5×104细胞，在荧光直方图上分别计算出CD+4、CD+8细胞峰的百分率。
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2.4 统计学处理：实验结果用方差分析统计处理。
3 结果
3.1 PSP对PHA活化的人PBL增殖的调节作用：经PHA活化后的人PBL在不同浓度的PSP作用下培养72 h，MTT比色法检测，结果见表1。其OD值的变化与浓度不呈正相关，高浓度的PSP(400 μg/mL)促增殖作用较低，而低浓度PSP(12.5～200 μg/mL)作用显著，其OD值明显高于PHA对照组，经统计学处理差异显著(P<0.05)，呈现明显的促进作用，最佳促进效应浓度为50～100 μg/mL，随着PSP浓度的降低，增殖活性也随之降低，但最小浓度6.125 μg/mL仍有增殖效应，提示PSP对活化的人PBL增殖有明显的促进作用。
表1 PSP对人PBL增殖的影响(n＝4，
±s) 组别
, http://www.100md.com
PSP(μg/mL)
OD值
PHA对照组
—
0.138±0.025
PHA+PSP处理组
400
0.193±0.022
200
0.244±0.021*
100
0.268±0.026*
, http://www.100md.com
50
0.256±0.035*
25
0.245±0.025*
12.5
0.248±0.031*
6.25
0.226±0.028
与对照组比较：*P<0.05 流式细胞仪检测细胞周期的结果显示，PSP浓度为50 μg/mL时可使PHA活化的人PBL有10.67%细胞进入S期，PSP浓度为100 μg/mL时有14.3%细胞进入S期，而单加PHA对照组仅有5.93%进入S期。提示PSP明显促进经PHA活化的细胞进人S期，进一步表明PSP可促进人PBL的DNA合成(表2)。'
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表2 PSP对PHA诱导的人PBL进入细胞周期的影响(n＝3，±s) 组别
PSP
(μg/mL)
G1
不同时期细
胞百分数S
G2
PHA对照
—
81.67±4.39
, 百拇医药
5.93±1.16
12.43±4.01
PHA+PSP
100
74.93±4.71
14.30±1.90*
10.80±3.83
50
76.16±3.59
10.67±3.08*
13.20±3.30
, http://www.100md.com
与PHA对照组比较：*P<0.05
3.2 PSP对经PHA活化后的T细胞亚群变化的影响：见表3。
表3 PSP对细胞亚群变化的影响(n＝3，±s) 组别
PSP(μg/mL)
CD+4
CD+8
G+4/CD+8
, 百拇医药 PHA对照
—
13.65±3.04
4.85±2.76
2.95±1.17
PHA+PSP
100
25.85±6.01*
5.35±0.16
5.02±2.15
50
21.20±4.81*
, 百拇医药
5.16±0.71
4.08±0.91
与PHA对照组比较：*P<0.05
结果表明在加入PSP的实验组中T细胞亚群有明显的变化，CD+4细胞明显增加，CD+8细胞也略有增加，但主要呈现为CD+4细胞的增加，故使CD+4/CD+8比值升高(P<0.05)。
4 讨论
PSP能明显抑制肿瘤生长，初步的研究表明，其抑瘤机制与免疫调节作用相关〔1，2〕。本文用MTT比色法和流式细胞仪分析法检测了不同浓度PSP对PHA活化的人PBL增殖的影响，两种检测方法均显示出PSP对人PBL的增殖有明显的促进作用。与MTT比色法相比，流式细胞仪分析法不仅能直接观察细胞内DNA的含量，而且可确定细胞周期，能较准确地定位药物的作用时相，结果表明PSP主要作用于细胞周期的S期，提示PSP对活化的人PBL增殖有明显的促进作用。研究结果还表明，经PHA活化后的人PBL在100 μg/mL浓度的PSP作用下，T细胞亚群发生明显改变，使CD+4细胞大量增多，而CD+8细胞增加的幅度较少，因此CD+4/CD+8比值升高，说明PSP可使细胞免疫功能增强，由此表明PSP能增强机体免疫功能，是一种有效的免疫增强剂。
, 百拇医药
致谢：香港保健协会主席周文轩教授、理事郭次仪教授及上海师范大学杨庆尧教授关心、指导本课题研究，谨致衷心谢意。
参 考 文 献
[1] 周金煦，等.上海师范大学学报自然科学版，1988，17：71
[2] 杨庆尧，等.国际学术研讨会论文和论文摘要集.1993：89
[3] 杨吉成，等.中草药，1991，22(5)：237
[4] Mosmanu T, et al.J Immunol Methods,1983，65:55
[5] Blus M L, et al. J Immunol,1988，4:70
[6] Lakhanpal P, et al.J Immunol Methods, 1987，96:35
(1998-01-23 收稿), http://www.100md.com(梁中琴 盛伟华 王晓霞 杨吉成** 顾振纶)
单位：梁中琴 盛伟华王晓霞 杨吉成** 顾振纶苏州医学院药理教研室(215007)
关键词：云芝糖肽；人外周血淋巴细胞；增殖；T细胞亚群
中草药/990119 摘 要 用流式细胞仪技术和MTT法观察了云芝糖肽(PSP)对由植物血凝素(PHA)诱导的人外周血淋巴细胞(PBL)增殖和T细胞亚群变化的调节作用。结果表明，50～100 μg/mL PSP对经PHA诱导的人PBL增殖有显著的促进作用(P<0.05)，该浓度的PSP也能促进细胞从G1期进入S期，并可使CD+4细胞明显升高，使CD+4/CD+8细胞比例增加，提示PSP具有免疫促进作用。
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Regulatory Effect of Polysacchariopeptide on Human Peripheral Blood LymphocyteProliferation and T Lymphocyte Subpopulation
Liang Zhongqin, Sheng Weihua, Wang Xiaoxia, et al.
(Department of Pharmacology, Suzhou Medical College, Suzhou 215007)
Abstract Regulatory effect of polysaccheriopeptide (PSP) on human peripheral blood lymphocyte (PBL) proliferation and T lymphocyte subpopulation was studied.
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The results showed that: phytohemagglutinin (PHA)-activated human PBL could increase proliferation especially after treated with PSP in concentrations of 50～100 μg/mL. In this study, the effect of PSP on cell cycling induced by PHA was investigated, DNA synthesis measured by a flowcytometer was shown to be increased but not in a dose-dependant manner. Cell cycling analysis demonstrated that the increment was mainly at the stage when cells enter S phase.
It was observed that in PSP treated cases CD+4 cell group increased, suggested that PSP has certain immunoregulatory effect in improving proliferation of activated human PBL, and increasing the CD+4 cell group.
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Key words polysacchariopeptide human peripheral blood lymphocyte T lymphocyte subpopulation
近年来实验研究证明，云芝糖肽(polysacchariopeptied, PSP)具有广泛的药理作用，特别对机体的免疫功能具有调节和增强作用〔1～3〕。但PSP对人外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyles, PBL)作用的体外实验研究迄今未见报道。我们研究了PSP对PHA诱导的人PBL的增殖作用和对T细胞亚群变化的影响，为云芝糖肽的免疫调节作用提供新的药效学资料。
1 材料
云芝糖肽系多孔菌科真菌云芝Coriolus versicolor (L.ex.Fr.) Quel cov-1菌株中提取的蛋白多糖肽，由上海师范大学微生物与免疫学研究所杨庆尧教授提供，淡褐色粉末，0.1 g溶于10 mL 1640培养液中，经无菌过滤后置冰箱保存；人白细胞取自昆山中心血站提供的健康人外周血；MTT、碘化丙啶(PI)为Sigma产品；CD+4、CD+8单抗为北京邦定生物医药公司产品。
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2 方法
2.1 PBL的分离：取健康人的白细胞5份，分别用含有10 U/mL肝素和100 U/mL双抗的无钙镁磷酸缓冲液(PBS)稀释后，再用淋巴细胞分层液(体积质量比为1.077)分离淋巴细胞，用PBS离心洗涤2 次，最后用1640培养液(含小牛血清10%，双抗100 U/mL)调细胞数为1×106/mL备用。
2.2 PBL增殖活性检测
2.2.1 MTT比色法〔4〕：将细胞加入96孔培养板中，加入不同浓度的PSP(6～800 μg/mL)，稳定培养10 h后加入PHA(终浓度为100 μg/mL)，37℃、5%CO2条件下培养72 h，在细胞培养结束前4 h加入MTT(噻唑蓝，使用浓度为5 mg/mL, 10 μL/孔)，4 h后用酸化十二烷基磺酸钠(SDS)终止反应，以MR-710型酶标仪测OD值(参考波长630 nm，实验波长570 nm)。
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2.2.2 流式细胞仪(FACS)检测细胞周期〔5〕：以不同浓度的PSP(5和100 μg/mL)与人PBL(5×106/mL)、PHA(100 μg/mL)共同培养72 h后收获细胞，以冷的PBS洗涤2次，细胞沉淀用70%乙醇混匀备用，上机前用PBS洗涤后再用PBS调细胞浓度为1×106/mL，加入RNA酶50 μg/mL，37℃水浴作用30 min后置冰浴终止反应，每毫升细胞悬液加PI染液100 μL(1 μg/mL)，暗室中放置30 min后，用流式细胞仪分析细胞周期。
2.3 T细胞亚群的双标记检测〔6〕：选择促进增殖效应最佳浓度的PSP(50～100 μg/mL)与人PBL及PHA混合培养至48 h，调细胞浓度为1×106/mL，每个样品分别加入CD+4、CD+8单抗，同时加入荧光素标记的羊抗鼠IgG抗体及抗体稀释液各100 μL，放置4℃冰箱30 min，洗涤2次后用流式细胞仪检测，每份标本测5×104细胞，在荧光直方图上分别计算出CD+4、CD+8细胞峰的百分率。
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2.4 统计学处理：实验结果用方差分析统计处理。
3 结果
3.1 PSP对PHA活化的人PBL增殖的调节作用：经PHA活化后的人PBL在不同浓度的PSP作用下培养72 h，MTT比色法检测，结果见表1。其OD值的变化与浓度不呈正相关，高浓度的PSP(400 μg/mL)促增殖作用较低，而低浓度PSP(12.5～200 μg/mL)作用显著，其OD值明显高于PHA对照组，经统计学处理差异显著(P<0.05)，呈现明显的促进作用，最佳促进效应浓度为50～100 μg/mL，随着PSP浓度的降低，增殖活性也随之降低，但最小浓度6.125 μg/mL仍有增殖效应，提示PSP对活化的人PBL增殖有明显的促进作用。
表1 PSP对人PBL增殖的影响(n＝4，
±s) 组别, http://www.100md.com
PSP(μg/mL)
OD值
PHA对照组
—
0.138±0.025
PHA+PSP处理组
400
0.193±0.022
200
0.244±0.021*
100
0.268±0.026*
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50
0.256±0.035*
25
0.245±0.025*
12.5
0.248±0.031*
6.25
0.226±0.028
与对照组比较：*P<0.05 流式细胞仪检测细胞周期的结果显示，PSP浓度为50 μg/mL时可使PHA活化的人PBL有10.67%细胞进入S期，PSP浓度为100 μg/mL时有14.3%细胞进入S期，而单加PHA对照组仅有5.93%进入S期。提示PSP明显促进经PHA活化的细胞进人S期，进一步表明PSP可促进人PBL的DNA合成(表2)。'
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表2 PSP对PHA诱导的人PBL进入细胞周期的影响(n＝3，
±s) 组别PSP
(μg/mL)
G1
不同时期细
胞百分数S
G2
PHA对照
—
81.67±4.39
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5.93±1.16
12.43±4.01
PHA+PSP
100
74.93±4.71
14.30±1.90*
10.80±3.83
50
76.16±3.59
10.67±3.08*
13.20±3.30
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与PHA对照组比较：*P<0.05
3.2 PSP对经PHA活化后的T细胞亚群变化的影响：见表3。
表3 PSP对细胞亚群变化的影响(n＝3，
±s) 组别PSP(μg/mL)
CD+4
CD+8
G+4/CD+8
, 百拇医药 PHA对照
—
13.65±3.04
4.85±2.76
2.95±1.17
PHA+PSP
100
25.85±6.01*
5.35±0.16
5.02±2.15
50
21.20±4.81*
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5.16±0.71
4.08±0.91
与PHA对照组比较：*P<0.05
结果表明在加入PSP的实验组中T细胞亚群有明显的变化，CD+4细胞明显增加，CD+8细胞也略有增加，但主要呈现为CD+4细胞的增加，故使CD+4/CD+8比值升高(P<0.05)。
4 讨论
PSP能明显抑制肿瘤生长，初步的研究表明，其抑瘤机制与免疫调节作用相关〔1，2〕。本文用MTT比色法和流式细胞仪分析法检测了不同浓度PSP对PHA活化的人PBL增殖的影响，两种检测方法均显示出PSP对人PBL的增殖有明显的促进作用。与MTT比色法相比，流式细胞仪分析法不仅能直接观察细胞内DNA的含量，而且可确定细胞周期，能较准确地定位药物的作用时相，结果表明PSP主要作用于细胞周期的S期，提示PSP对活化的人PBL增殖有明显的促进作用。研究结果还表明，经PHA活化后的人PBL在100 μg/mL浓度的PSP作用下，T细胞亚群发生明显改变，使CD+4细胞大量增多，而CD+8细胞增加的幅度较少，因此CD+4/CD+8比值升高，说明PSP可使细胞免疫功能增强，由此表明PSP能增强机体免疫功能，是一种有效的免疫增强剂。
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致谢：香港保健协会主席周文轩教授、理事郭次仪教授及上海师范大学杨庆尧教授关心、指导本课题研究，谨致衷心谢意。
参 考 文 献
[1] 周金煦，等.上海师范大学学报自然科学版，1988，17：71
[2] 杨庆尧，等.国际学术研讨会论文和论文摘要集.1993：89
[3] 杨吉成，等.中草药，1991，22(5)：237
[4] Mosmanu T, et al.J Immunol Methods,1983，65:55
[5] Blus M L, et al. J Immunol,1988，4:70
[6] Lakhanpal P, et al.J Immunol Methods, 1987，96:35
(1998-01-23 收稿), http://www.100md.com(梁中琴 盛伟华 王晓霞 杨吉成** 顾振纶)