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编号:10233247
肝细胞癌p53及nm23-H1 mRNA表达的意义
http://www.100md.com 《世界华人消化杂志》 1999年第1期
     作者:郑建勇1 李开宗1 窦科峰1 李 江2

    单位:

    关键词:肝肿瘤;癌,肝细胞;RNA,信使;p53基因;nm23-H1基因;基因表达

    中国图书资料分类号 R735中国图书资料分类号 R735.7

    摘 要

    目的 探讨p53,nm23-H1与原发性肝细胞癌(HCC)发生发展的关系.

    方法 运用原位分子杂交技术对49例HCC中p53和nm23-H1基因mRNA进行检测,并结合临床病理特征进行分析.

    结果 p53 mRNA杂交阳性23例,占46.9%;p53 mRNA过表达与肿瘤的肝内转移. 包膜侵犯及Edmondson分级相关(P<0.05);nm23-H1 mRNA阳性表达27例,占55.1%;nm23-H1 mRNA表达与肿瘤肝内转移及TNM分期呈负相关(P<0.05);同时发现p53 mRNA过表达和nm23-H1 mRNA低表达在HCC肝内转移中具有协同作用.
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    结论 p53和nm23-H1参与HCC的发生发展,p53过表达及nm23-H1低表达提示HCC肝内转移.

    Studies on p53 and nm23-H1 mRNA

    expression in hepatocellular

    carcinoma

    ZHENG Jian-Yong1, LI Kai-Zong1, DOU Ke-Feng1 and LI Jiang2

    1Department of Hepatobiliary Surgery, Xijing Hospital, 2Department of Pathology, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, Shaanxi Province, China
, 百拇医药
    Subject headings liver neoplasms; carcinoma, hepatocellular; RNA, messenger; p53 gene; nm23-H1 gene; gene expression

    Abstract

    AIM To study the relationship between p53 and nm23-H1 mRNA expressions and progression of hepatocellular carcinoma (HCC).

    METHODS By using in situ hybridization, expressions of mRNA for p53 and nm23-H1 genes were detected in 49 cases of hepatocellular carcinoma, and analyzed in combination with clinical materials.
, 百拇医药
    RESULTS p53 mRNA was positive in 23 cases (46.9%). There was a significant correlation between the positivity of p53 mRNA and some pathological features, such as intrahepatic metastasis, infiltration to capsule and the degree of differentiation of HCC (P<0.05). nm23-H1 mRNA was positive in 27 cases (55.1%). Expression of nm23-H1 mRNA was inversely correlated with intrahepatic metastasis and TNM stage. And there was synergism between overexpression of p53 mRNA and low expression of nm23-H1 mRNA in intrahepatic metastasis of HCC.
, 百拇医药
    CONCLUSION p53 and nm23-H1 are associated with progression of hepatocellular carcinoma, p53 overexpression and nm23-H1 lower expression may indicate the intrahepatic metastasis of HCC.

    0 引言

    癌基因激活与抑癌基因失活被认为是肿瘤发生的分子基础. p53基因点突变在肿瘤发生上的重要作用, nm23基因与肿瘤转移的负相关关系,已在大多数上皮源性肿瘤中得到证实[1,2]. 我们采用原位分子杂交技术对49例肝细胞癌(HCC)手术切除的标本进行p53及nm23-H1 mRNA定位检测,探讨与HCC的发生及临床生物学行为的关系.

    1 材料和方法
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    1.1 材料 收集我院1995-01/1996-07手术切除的经病理诊断为HCC标本49例,男41例,女8例,年龄15岁~72岁,平均51.6岁,带有癌旁肝组织16例. 2例正常肝组织来自经病理证实无肝炎肝硬变病史的肝血管瘤手术患者. 全部标本经100mL/L福尔马林固定,石蜡包埋,连续5μm厚切片,HE染色. 突变型p53质粒由本文作者李江博士提供,其中p53基因249密码子突变(G→T),片段大小1.8kb,经BamHⅠ单酶切,nm23-H1片段购于北京中山生物技术公司.

    1.2 方法

    1.2.1 探针标记 按分子克隆操作指南进行. 常规提取质粒,酶切电泳,回收片段,用随机引物延伸法标记地高辛作为探针(DNA Labeling and Detection Kit, Cat No.1093657, Boehringer Mannheim Biochemica).

    1.2.2 原位杂交 原位分子杂交检测p53及nm23-H1 mRNA主要步骤:⑴石蜡切片常规脱蜡至DEPC水,及1mL/L DEPC-PBS;⑵0.2mol/L HCl处理20min;⑶蛋白酶K 37℃下消化15min;⑷2mL/L甘氨酸-PBS振洗10min;⑸40mL/L多聚甲醛固定30min;⑹5mg/L MgCl2-PBS振洗15min×3;⑺梯度酒精脱水后42℃预杂交2h;⑻加杂交液,98℃ 10min变性探针,冰上速冷,于湿盒中42℃杂交过夜;⑼500mL/L甲酰胺6×SSC振洗15min×2,室温2×SSC振洗15min×2,0.2×SSC振洗15min×2;⑽Buffer 1(100mmol/L Tris-HCl, 150mmol/L NaCl,pH 7.5)洗片20min;⑾用20mL/L正常羊血清,室温封闭30min;⑿用含10mL/L正常羊血清,3g/L Triton X-100的Buffer 1稀释,Anti-DIG-AP(1∶500)室温孵育切片2h;⒀Buffer 1洗片15min×2;⒁Buffer 2(100mmol/L Tris-HCl, 100mmol/L NaCl, 50mmol/L MgCl2, pH 9.5)洗片3min;⒂NBT/BCIP暗处显色2h~10h;⒃浸入TE(10mmol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA, pH 8.0)中终止反应;⒄常规脱水,透明封片. 杂交前各步严防RNase污染.
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    实验对照为省去探针的空白对照及RNase消化对照.

    2 结果

    2.1 突变型p53 mRNA 杂交阳性反应物呈蓝色细颗粒状,主要位于癌细胞核(图1A,B). 49例HCC标本中,p53 mRNA表达阳性23例,占46.9%(表1),而在癌旁区和正常肝组织少见阳性. p53 mRNA表达与肿瘤的大小及TNM分期无明显相关性(P>0.05),HCC伴肝内转移组p53 mRNA表达阳性率明显高于无肝内转移组,侵犯包膜组阳性率明显高于无包膜侵犯组,HCC高分化组阳性率明显低于低分化组.41-1.gif (30085 bytes)41-2.gif (118844 bytes)
, 百拇医药
    图1 突变型p53 mRNA原位杂交结果 A:突变型p53 mRNA杂交阳性反应物位于癌细胞核 ×400 B:癌细胞质中存在脂肪变性 HE×400

    表1 p53和nm23-H1 mRNA表达与临床病理学特征的关系

    (n=49)

    临床病理特征

    p53

    nm23-H1

    -

    +

    -

    +

    肿瘤大小
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    ≤5cm

    8

    5

    3

    10

    >5cm

    18

    18

    19

    17

    肝内转移

    无

    20

    9
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    9

    20

    有

    6

    14a

    13

    7a

    包膜侵犯

    无

    15

    6

    7

    14
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    有

    11

    17a

    15

    13

    Edmondson分级

    Ⅰ,Ⅱ

    19

    7

    10

    16

    Ⅲ,Ⅳ

    7
, 百拇医药
    16a

    12

    11

    TNM分期

    Ⅰ,Ⅱ

    15

    11

    7

    19

    Ⅲ,Ⅳ

    11

    12

    15
, 百拇医药
    8a

    aP<0.05.

    2.2 nm23-H1 mRNA 杂交阳性为细胞质中蓝色颗粒(图2). 49例HCC标本中,nm23-H1 mRNA表达阳性27例,阳性率为55.1%(表1),癌旁区及正常肝组织为阳性. nm23-H1 mRNA表达与肿瘤大小、包膜侵犯与否及Edmondson分级无明显相关性(P>0.05). 伴肝内转移组nm23-H1 mRNA杂交阳性率明显低于无肝内转移组,而且nm23-H1 mRNA表达与本组HCC进展有关,TNMⅢ,Ⅳ期患者癌组织mRNA阴性率明显高于TNMⅠ,Ⅱ期患者.41-3.gif (54467 bytes)

    图2 nm23-H1 mRNA原位杂交结果 nm23-H1 mRNA杂交阳性反应物位于癌细胞质
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    2.3 突变型p53和nm23-H1 mRNA表达与肝内转移 比较HCC肝内转移发现,23例p53 mRNA杂交阳性中,有12例与22例nm23-H1 mRNA杂交阴性者中的12例为共同患者,其肝内转移率达83.3%;26例p53 mRNA杂交阴性的16例与27例nm23-H1 mRNA杂交阳性的16例为共同患者,其肝内转移仅为18.8%,二者比较,差异显著. 分析发现突变型p53 mRNA高表达和nm23-H1 mRNA低表达在HCC肝内转移中具有协同作用.

    3 讨论

    p53基因目前被认为是与人类肿瘤相关性最高的基因,可分为野生型和突变型,前者为肿瘤的抑制基因,后者为肿瘤的致癌基因,前者的缺失突变或者后者的过量表达与多种肿瘤发生有关[1]. 野生型P53蛋白T1/2短,极不稳定,常规免疫组化方法难以检测出,而突变型P53 T1/2延长,稳定性增强,聚积在细胞中,采用常规免疫组化方法即可检出. 国内外报道HCC中p53基因的异常率为27%~58%[3]. 我们采用原位分子杂交法检测HCC中的突变型p53 mRNA分布及其关系. 结果显示突变型p53 mRNA阳性颗粒主要位于癌细胞核内,阳性率为46.9%,癌旁区及正常肝组织均为阴性. 表明突变型p53 mRNA过度表达可能对HCC的发生发展起重要作用. 其核内表达说明杂交的可能是mRNA的前体hnRNA. Hsu et al[4]研究认为p53基因表达与肿瘤生长及浸润有关. 赵波et al[5]亦认为p53基因突变与肿瘤转移发生率有关;而文献[6]的结果相反. Tanaka et al[7]报道,p53的突变率与HCC的病理分级相关. 我们发现突变型p53 mRNA的高表达与HCC包膜的侵犯与否,有无肝内转移及肿瘤的分化程度等因素密切相关,提示突变型p53 mRNA高表达与HCC的侵袭及转移有关,进一步提示突变型p53 mRNA过度表达对肿瘤的发生发展起重要作用.
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    nm23基因被认为是抑制肿瘤转移的最佳候选基因[8]. 人类nm23包含nm23-H1和nm23-H2两种基因. 人类乳腺癌. 恶性黑素瘤和结肠癌中nm23-H1和蛋白表达水平与转移呈负相关,而与预后良好呈正相关. 研究表明nm23编码的蛋白与核苷二磷酸激酶(NDPK)高度同源,具有NDPK活性,同时参与微管的聚合和纺锤体形成. 若NDPK出现异常,会发生纺锤体形成障碍,出现非整倍体细胞,引起细胞运动异常,促进肿瘤发生转移[9]. 我们的结果显示nm23-H1 mRNA阳性颗粒主要位于癌细胞质内,阳性率为55.1%. 癌旁区及正常肝组织均为阳性. 提示nm23-H1 mRNA的低表达与HCC的发生发展有关,而且显示,nm23-H1 mRNA的表达与HCC肝内转移呈显著的负相关性,与Yamaguchi et al[10]的报道一致. 其次,nm23-H1 mRNA的低表达与HCC的TNM分期相关,而与肿瘤大小和分化程度无显著关系,这些都提示nm23-H1的表达异常发生在HCC进展的晚期,同时表明nm23-H1能抑制肿瘤转移,但不能抑制肿瘤生长的特性. 此外,nm23-H1 mRNA杂交阳性的HCC中大多数伴有大量淋巴细胞的浸润,而淋巴细胞的浸润常预示着预后良好,这与nm23-H1 mRNA阳性组的低肝内转移率一致.
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    p53基因和nm23-H1在肿瘤转移中的关系尚不清楚,有学者在非小细胞肺癌研究中,发现nm23基因与p53基因间存在明显的负相关关系. 本结果提示,p53基因的高表达和nm23-H1基因的低表达都与HCC的肝内转移相关,并具有协同作用. 野生型p53基因的生物学功能类似“分子警察”,监视细胞基因组的完整性. 我们猜测p53基因可能对nm23基因有一定的调控作用. 而肿瘤转移是影响患者预后的重要因素,继续研究p53基因和nm23基因之间的关系,有希望为HCC提供新的预后指标和治疗措施[11].

    作者简介:郑建勇,男,1968-12-01生,湖北省襄樊市人,汉族. 1993年第四军医大学毕业,住院医师,1995年第四军医大学硕士,第四军医大学’97级博士研究生,主要从事肝胆胰等疾病的诊治及肝癌的基因治疗研究,发表论文2篇,译著2部.

    通讯作者 郑建勇,710033,第四军医大学西京医院肝胆外科,陕西省西安市长乐西路15号.
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    Correspondence to:Dr. ZHENG Jian-Yong, Department of Hepatobiliary Surgery, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, 15 Changle Xilu, Xi'an 710033, Shaanxi Province, China

    Tel. +86.29.3375259

    作者单位:郑建勇 李开宗 窦科峰 第四军医大学 1西京医院肝胆外科

    李 江 病理学教研室 陕西省西安市 710033

    4 参考文献

    [1] Luo D, Liu QF, Gove C, Naomov NV, Su JJ, Williams R. Analysis of N-ras gene mutation and p53 gene expression in human hepatocellular carcinomas. WJG, 1998;4:97-99
, 百拇医药
    [2] Nakayarna T, Ohturu A, Nakao K, Alan R, Thomas BL, Jarnes EH. Expression in hepatocellular carcinoma of nucleoside diphosphate diphosphate kinase, a homolog of the nm23 gene product. J Natl Cancer Inst, 1992;84:1349-1357

    [3] Piao Z, Kin H, Jeon BK, Lee WJ, Park C. Relationship between loss of heterozygosity of tumor suppressor genes and histologic differentiation in hepatocellular carcinoma. Cancer, 1997;80:865-872

    [4] Hsu HC, Tseng HJ, Lai PL, Lee PH, Peng SY. Expression of p53 gene in 184 unifocal hepatocellular carcinoma: association with tumor growth and invasiveness. Cancer Res, 1993;53:4691-4694
, 百拇医药
    [5] 赵波,杨光华. 肝细胞癌p53基因的分子病理研究. 中华病理学杂志,1993;22:16-18

    [6] Irene OL, Gopesh S, Lap P, Stella WY, Matthew MT. Overexpression and point mutations of p53 tumer suppressor gene in hepatocellular carcinomas in Hong Kong Chinese people. Cancer, 1994;74:30-37

    [7] Tanaka S, Toh Y, Adachi E, Matsumata T, Mori R, Sugimachi K. Tumor progression in hepatocellular carcinoma may be mediated by p53 mutation. Cancer Res, 1993;53:2884-2887
, 百拇医药
    [8] Lconc A, Flatow U, King CR, Sandeen MA, Margulies IM, Liotta LA, Steeg PS. Reduced tumor incidence, metastatic potential and cytokine responsiveness of nm23 transfected melanoma cells. Cell, 1991;65:25-35

    [9] Martinez R, Venturelli D, Perrotti D, Veronese ML, Kastury K, Druck T, Huebner K, Calabretta B. Gene structure, promoter activity, and chromosomal location of the DR-nm23 gene, a related member of the nm23 gene family. Cancer Res, 1997;57:1180-1187
, 百拇医药
    [10] Yamaguchi A, Urano T, Goi T, Takeuchi K, Niimoto S, Nakagawara G, Furukawa K, Shiku H. Expression of human nm23-H1 and nm23-H2 protein in hepatocellular carcinoma. Cancer, 1994;73:2280-2284

    [11] Xu CT, Pan BR. Current status of gene therapy in gastroenterology. WJG, 1998;4:85-88

    收稿日期 1998-07-15 修回日期 1998-08-12, http://www.100md.com(郑建勇1 李开宗1 窦科峰1 李 江2)