稀土对镍所致豚鼠肺巨噬细胞产生活性氧的抑制作用研究
作者：栗建林 王起恩 李爱琴 张丽帼
单位：栗建林 李爱琴 张丽帼 (北京市劳动卫生职业病防治研究所 100020)； 王起恩 (北京医科大学劳动卫生教研室)
关键词：
卫生毒理学杂志990113 在镍的开采、冶炼和精炼中，职业人群接触大量镍的硫化物、镍的氧化物后可以引起肺癌和鼻癌。已被大量的人群流行病学调查和动物实验所证实，为此IARC(1987)已将镍化合物列为第一类致癌物[1]。其致癌机理之一是被吞噬的镍在细胞内产生活性氧类(主要是羟自由基)间接引起癌症[2，3]。90年代以来，从分子、细胞、整体动物和人群流行病调查发现一定剂量的轻稀土化合物(RE)可以抑制肿瘤发生，并能提高机体抗氧化酶的活性，降低脂质过氧化，抑制活性氧自由基(如羟自由基和超氧阴离子)的产生[4，5]。为此本实验首先观察了黑色氧化镍对肺泡巨噬细胞产生活性氧的作用，并观察了氯化稀土对其作用的影响。
, 百拇医药
材料与方法
1.受试物：黑色氧化镍(Ni2O3),北京化工厂产品。
2.试剂：辣根过氧化物酶(HRP)：Sigma公司产品。细胞色素C(Cytc):Sigma公司产品。电子捕获剂(DMPO)：Sigma公司产品。镧(La),铈(Ce),混合稀土(RE)由北京有色金属研究总院提供。
3.肺泡巨噬细胞(AM)的制备：将豚鼠(北京医科大学实验动物科学部提供)用2ml戊巴比妥钠麻醉后，腹主动脉放血，剪开颈部皮肤，分离气管并进行气管插管，用生理盐水进行肺灌洗，将灌洗液1000r/min离心10分，收集细胞并计数，用生理盐水洗一遍后，调整浓度待用。
4.(.O2)的测定[6]：取0.5ml4×106个/ml细胞液，分别加入不同浓度的氧化镍(终浓度为5，10，20μg/ml)或氯化镧(LaCl310,20μg/ml)，氯化铈(CeCl310,20μg/ml),RECl3(50,100μg/ml),同时加入0.5ml 2mg/ml的CytC,37℃振荡水浴中温育1小时，放入冰浴中终止反应，2000r/min离心10分，取上清在550nm处比色，以还原型细胞色素C的含量代表.O2的产生量，还原型细胞色素C的消光系数为2.1×104mol.L-1cm-1。
, 百拇医药
5.H2O2的测定[7]：取0.5ml 4×106个/ml的AM，分别加入不同浓度的氧化镍(5，10，20μg/ml)或LaCl3(10,20μg/ml),CeCl3(10,20μg/ml),RECl3(50,100μg/ml),同时加入0.1ml 1mg/ml的HRP，0.1ml 1mg/ml的酚红，37℃振荡水浴中温育1小时，冰浴中终止反应，2000r/min离心10分，取0.5ml上清加2ml PBS和40μl 4mol/L的NaOH,在610nm处比色，用标准曲线定量。
6..OH的测定：取20μl 5×107/ml的细胞液，加入10μl 5mg/ml(终浓度为1mg/ml)的氧化镍或10μl 0.1mol/L (终浓度为20mmol/L)的CeCl3,或LaCl3 10μl 5mg/ml(终浓度为1mg/ml)的混合稀土，同时加入10μl电子自旋捕获剂(DMPO)，37℃温育5分，吸入石英毛细管中，于ESP-300型电子自旋共振仪上检测.OH信号，测定条件：中心磁场3450G，扫描宽度100G，调制幅度2.0G，扫描时间83.89秒。
, 百拇医药
7.统计分析方法：用Primer软件对数据进行t检验。
结果
1.黑色氧化镍与稀土化合物对AM产生.O2的影响
由表1可见，10，20μg/ml的Ni2O3均可使AM产生的.O2明显升高，且有明显的剂量-反应关系(r=0.984，P<0.05)，不同剂量的稀土化合物(Ce,La和RE)与20μg/ml的Ni2O3同时与AM作用时，可显著抑制AM产生的.O2。
表1 黑色氧化镍与稀土化合物对AM产生.O2的影响(
±s n=3) 分组
, 百拇医药
Ni2O3
(μg/ml)
稀土
(μg/ml)
还原型细胞色素C
(μmol/L)
对照
-
-
2.412±0.198
Ni2O3
5
, 百拇医药
-
2.508±0.055
10
-
2.825±0.145*
20
-
3.111±0.240*
Ni2O3+Ce
20
10
1.778±0.146##
, 百拇医药
Ni2O3+Ce
20
20
1.302±0.360##
Ni2O3+La
20
10
1.302±0.275##
Ni2O3+La
20
, 百拇医药
20
1.238±0.330##
Ni2O3+RE
20
50
1.873±0.146##
Ni2O3+RE
20
100
1.270±0.146##
, 百拇医药 与对照组比较*P<0.05
与20μg/ml Ni2O3比较##P<0.01
2.黑色氧化镍与稀土化合物对AM产生H2O2的影响
从表2可见，3种剂量的Ni2O3均不能使AM产生的H2O2量增多，用各种稀土化合物与Ni2O3同时作用对AM产生H2O2也没有明显影响。
表2 黑色氧化镍与稀土化合物对AM产生H2O2的影响(±s，n=3) 分组
, http://www.100md.com
Ni2O3
(μg/ml)
稀土
(μg/ml)
H2O2
(μmol/L)
对照
-
-
1.390±0.384
Ni2O3
, 百拇医药
5
-
1.774±0.512
10
-
1.476±0.449
20
-
1.135±0.221
Ni2O3+Ce
20
10
, 百拇医药
1.774±0.895
Ni2O3+Ce
20
20
1.049±0.517
Ni2O3+La
20
10
1.859±0.532
Ni2O3+La
20
, 百拇医药
20
1.561±0.074
Ni2O3+RE
20
50
1.774±0.000
Ni2O3+RE
20
100
1.518±0.461
3.黑色氧化镍与稀土化合物对AM产生.OH的影响
, 百拇医药
标准体系(H2O2+Fe2+)可产生明显的.OH信号。但氧化镍与细胞反应体系却不能产生.OH信号，在这个体系中无论再加入H2O2，还是稀土化合物，均不能产生.OH信号，而在标准体系中只有氯化镧可使.OH信号明显增加，约是标准体系的3倍。氯化铈和混合稀土均不能产生.OH信号，提示氧化镍可能不会诱导AM产生.OH，也有可能是产生的.OH被AM中的抗氧化系统清除掉了。本结果还提示，氧化镧可加强标准体系产生的.OH，可能是镧参与了Fenton型反应造成的。
, http://www.100md.com
由此可见，黑色氧化镍可刺激AM产生.O2，但不能刺激其产生H2O2和.OH，稀土化合物可抑制氧化镍对AM产生.O2的刺激作用。
讨论
自由基广泛存在生物体内，正常情况下对机体起保护作用，如白细胞常常在感染时产生并释放自由基，消灭外来有害物质。同时体内也存在一整套自由基清除系统，清除过多的自由基以保持动态平衡。但产生的自由基超过机体的清除能力时，可对机体自身组织和细胞起到破坏作用。自由基由于含有不配对电子，其性质异常活泼，易与脂质、蛋白质及核酸反应，引起过氧化损害，造成起DNA损伤，使其断裂，碱基错位等，最终引起癌症。而镍的致癌机理之一就是，被吞噬的镍在细胞内产生活性氧类，主要是羟自由基，间接引起癌症。Kawanishi(1994)报道被吞噬进入细胞内的Ni(Ⅱ)产生活性氧类(主要是羟基自由基)，镍本身也可以通过Haber-Weiss反应催化生成羟自由基，或Fentor-Weiss反应生成.OH而引起一系列损伤[2，3]。本实验发现黑色氧化镍可以刺激肺巨噬细胞(AM)产生.O2，但不能刺激产生.OH和H2O2，考虑氧化镍可能不会刺激AM产生.OH、H2O2或者是AM具有很强消除体内有害物质的能力，有可能产生的.OH和H2O2被AM中抗氧化系统消除掉。但氧化镍刺激AM产生超量.O2，也会对机体产生一系列损伤。
, 百拇医药
我们曾经发现无论是混合稀土还是单一稀土元素镧、铈均可以不同程度抑制温石棉诱导的AM产生的.OH，.O2，并能抑制化学致突变剂的致癌作用，提高抗氧化酶的能力，降低脂质过氧化物的含量。本实验也证实稀土可以明显抑制氧化镍刺激AM产生的.O2，但稀土对镍致癌作用的影响，需要进一步研究。
参考文献
1.WHO.International Agenfy for Research on Cancer,IARC Monographs on the Evalluation of Carcinogenic Risks to Humans,Overall Evalluation of Carcinogencity:An Updating of IARC Monographs.Volumes 1 to 42,Supplement 7,Lyon 1987.
, 百拇医药
2.Kawanishi S et al.Biol Trace Elem Res,1989,21:367～372.
3.Kawanish S et al.Environ Health Perspect,1994,21:367～372.摘自国外医学卫生学分册1996，23(3)：130
4.纪云晶，王宗惠，栗建林，等.稀土与肿瘤关系的探讨.卫生毒理学杂志，1994，8(3)：164.
5.栗建林，张丽帼，刘建中，等.氯化稀土抑制氨基甲酸乙酯诱发肺癌的研究.卫生毒理学杂志，1997，11(3)：158.
6.Greenwald RA.CRC handbook of methods for oxygen radical research.Florida:CRC Press Inc.1985,120～147.
7.Pick E,Keisari Y.A simple colorimetric method for the measurement of hydrogen peroxide produced by cells in culture.J Immunol Method,1980,38:161～170.
(修回日期 1998年8月), http://www.100md.com
单位：栗建林 李爱琴 张丽帼 (北京市劳动卫生职业病防治研究所 100020)； 王起恩 (北京医科大学劳动卫生教研室)
关键词：
卫生毒理学杂志990113 在镍的开采、冶炼和精炼中，职业人群接触大量镍的硫化物、镍的氧化物后可以引起肺癌和鼻癌。已被大量的人群流行病学调查和动物实验所证实，为此IARC(1987)已将镍化合物列为第一类致癌物[1]。其致癌机理之一是被吞噬的镍在细胞内产生活性氧类(主要是羟自由基)间接引起癌症[2，3]。90年代以来，从分子、细胞、整体动物和人群流行病调查发现一定剂量的轻稀土化合物(RE)可以抑制肿瘤发生，并能提高机体抗氧化酶的活性，降低脂质过氧化，抑制活性氧自由基(如羟自由基和超氧阴离子)的产生[4，5]。为此本实验首先观察了黑色氧化镍对肺泡巨噬细胞产生活性氧的作用，并观察了氯化稀土对其作用的影响。
, 百拇医药
材料与方法
1.受试物：黑色氧化镍(Ni2O3),北京化工厂产品。
2.试剂：辣根过氧化物酶(HRP)：Sigma公司产品。细胞色素C(Cytc):Sigma公司产品。电子捕获剂(DMPO)：Sigma公司产品。镧(La),铈(Ce),混合稀土(RE)由北京有色金属研究总院提供。
3.肺泡巨噬细胞(AM)的制备：将豚鼠(北京医科大学实验动物科学部提供)用2ml戊巴比妥钠麻醉后，腹主动脉放血，剪开颈部皮肤，分离气管并进行气管插管，用生理盐水进行肺灌洗，将灌洗液1000r/min离心10分，收集细胞并计数，用生理盐水洗一遍后，调整浓度待用。
4.(.O2)的测定[6]：取0.5ml4×106个/ml细胞液，分别加入不同浓度的氧化镍(终浓度为5，10，20μg/ml)或氯化镧(LaCl310,20μg/ml)，氯化铈(CeCl310,20μg/ml),RECl3(50,100μg/ml),同时加入0.5ml 2mg/ml的CytC,37℃振荡水浴中温育1小时，放入冰浴中终止反应，2000r/min离心10分，取上清在550nm处比色，以还原型细胞色素C的含量代表.O2的产生量，还原型细胞色素C的消光系数为2.1×104mol.L-1cm-1。
, 百拇医药
5.H2O2的测定[7]：取0.5ml 4×106个/ml的AM，分别加入不同浓度的氧化镍(5，10，20μg/ml)或LaCl3(10,20μg/ml),CeCl3(10,20μg/ml),RECl3(50,100μg/ml),同时加入0.1ml 1mg/ml的HRP，0.1ml 1mg/ml的酚红，37℃振荡水浴中温育1小时，冰浴中终止反应，2000r/min离心10分，取0.5ml上清加2ml PBS和40μl 4mol/L的NaOH,在610nm处比色，用标准曲线定量。
6..OH的测定：取20μl 5×107/ml的细胞液，加入10μl 5mg/ml(终浓度为1mg/ml)的氧化镍或10μl 0.1mol/L (终浓度为20mmol/L)的CeCl3,或LaCl3 10μl 5mg/ml(终浓度为1mg/ml)的混合稀土，同时加入10μl电子自旋捕获剂(DMPO)，37℃温育5分，吸入石英毛细管中，于ESP-300型电子自旋共振仪上检测.OH信号，测定条件：中心磁场3450G，扫描宽度100G，调制幅度2.0G，扫描时间83.89秒。
, 百拇医药
7.统计分析方法：用Primer软件对数据进行t检验。
结果
1.黑色氧化镍与稀土化合物对AM产生.O2的影响
由表1可见，10，20μg/ml的Ni2O3均可使AM产生的.O2明显升高，且有明显的剂量-反应关系(r=0.984，P<0.05)，不同剂量的稀土化合物(Ce,La和RE)与20μg/ml的Ni2O3同时与AM作用时，可显著抑制AM产生的.O2。
表1 黑色氧化镍与稀土化合物对AM产生.O2的影响(
±s n=3) 分组, 百拇医药
Ni2O3
(μg/ml)
稀土
(μg/ml)
还原型细胞色素C
(μmol/L)
对照
-
-
2.412±0.198
Ni2O3
5
, 百拇医药
-
2.508±0.055
10
-
2.825±0.145*
20
-
3.111±0.240*
Ni2O3+Ce
20
10
1.778±0.146##
, 百拇医药
Ni2O3+Ce
20
20
1.302±0.360##
Ni2O3+La
20
10
1.302±0.275##
Ni2O3+La
20
, 百拇医药
20
1.238±0.330##
Ni2O3+RE
20
50
1.873±0.146##
Ni2O3+RE
20
100
1.270±0.146##
, 百拇医药 与对照组比较*P<0.05
与20μg/ml Ni2O3比较##P<0.01
2.黑色氧化镍与稀土化合物对AM产生H2O2的影响
从表2可见，3种剂量的Ni2O3均不能使AM产生的H2O2量增多，用各种稀土化合物与Ni2O3同时作用对AM产生H2O2也没有明显影响。
表2 黑色氧化镍与稀土化合物对AM产生H2O2的影响(
±s，n=3) 分组, http://www.100md.com
Ni2O3
(μg/ml)
稀土
(μg/ml)
H2O2
(μmol/L)
对照
-
-
1.390±0.384
Ni2O3
, 百拇医药
5
-
1.774±0.512
10
-
1.476±0.449
20
-
1.135±0.221
Ni2O3+Ce
20
10
, 百拇医药
1.774±0.895
Ni2O3+Ce
20
20
1.049±0.517
Ni2O3+La
20
10
1.859±0.532
Ni2O3+La
20
, 百拇医药
20
1.561±0.074
Ni2O3+RE
20
50
1.774±0.000
Ni2O3+RE
20
100
1.518±0.461
3.黑色氧化镍与稀土化合物对AM产生.OH的影响
, 百拇医药
标准体系(H2O2+Fe2+)可产生明显的.OH信号。但氧化镍与细胞反应体系却不能产生.OH信号，在这个体系中无论再加入H2O2，还是稀土化合物，均不能产生.OH信号，而在标准体系中只有氯化镧可使.OH信号明显增加，约是标准体系的3倍。氯化铈和混合稀土均不能产生.OH信号，提示氧化镍可能不会诱导AM产生.OH，也有可能是产生的.OH被AM中的抗氧化系统清除掉了。本结果还提示，氧化镧可加强标准体系产生的.OH，可能是镧参与了Fenton型反应造成的。
, http://www.100md.com
由此可见，黑色氧化镍可刺激AM产生.O2，但不能刺激其产生H2O2和.OH，稀土化合物可抑制氧化镍对AM产生.O2的刺激作用。
讨论
自由基广泛存在生物体内，正常情况下对机体起保护作用，如白细胞常常在感染时产生并释放自由基，消灭外来有害物质。同时体内也存在一整套自由基清除系统，清除过多的自由基以保持动态平衡。但产生的自由基超过机体的清除能力时，可对机体自身组织和细胞起到破坏作用。自由基由于含有不配对电子，其性质异常活泼，易与脂质、蛋白质及核酸反应，引起过氧化损害，造成起DNA损伤，使其断裂，碱基错位等，最终引起癌症。而镍的致癌机理之一就是，被吞噬的镍在细胞内产生活性氧类，主要是羟自由基，间接引起癌症。Kawanishi(1994)报道被吞噬进入细胞内的Ni(Ⅱ)产生活性氧类(主要是羟基自由基)，镍本身也可以通过Haber-Weiss反应催化生成羟自由基，或Fentor-Weiss反应生成.OH而引起一系列损伤[2，3]。本实验发现黑色氧化镍可以刺激肺巨噬细胞(AM)产生.O2，但不能刺激产生.OH和H2O2，考虑氧化镍可能不会刺激AM产生.OH、H2O2或者是AM具有很强消除体内有害物质的能力，有可能产生的.OH和H2O2被AM中抗氧化系统消除掉。但氧化镍刺激AM产生超量.O2，也会对机体产生一系列损伤。
, 百拇医药
我们曾经发现无论是混合稀土还是单一稀土元素镧、铈均可以不同程度抑制温石棉诱导的AM产生的.OH，.O2，并能抑制化学致突变剂的致癌作用，提高抗氧化酶的能力，降低脂质过氧化物的含量。本实验也证实稀土可以明显抑制氧化镍刺激AM产生的.O2，但稀土对镍致癌作用的影响，需要进一步研究。
参考文献
1.WHO.International Agenfy for Research on Cancer,IARC Monographs on the Evalluation of Carcinogenic Risks to Humans,Overall Evalluation of Carcinogencity:An Updating of IARC Monographs.Volumes 1 to 42,Supplement 7,Lyon 1987.
, 百拇医药
2.Kawanishi S et al.Biol Trace Elem Res,1989,21:367～372.
3.Kawanish S et al.Environ Health Perspect,1994,21:367～372.摘自国外医学卫生学分册1996，23(3)：130
4.纪云晶，王宗惠，栗建林，等.稀土与肿瘤关系的探讨.卫生毒理学杂志，1994，8(3)：164.
5.栗建林，张丽帼，刘建中，等.氯化稀土抑制氨基甲酸乙酯诱发肺癌的研究.卫生毒理学杂志，1997，11(3)：158.
6.Greenwald RA.CRC handbook of methods for oxygen radical research.Florida:CRC Press Inc.1985,120～147.
7.Pick E,Keisari Y.A simple colorimetric method for the measurement of hydrogen peroxide produced by cells in culture.J Immunol Method,1980,38:161～170.
(修回日期 1998年8月), http://www.100md.com