11种中成药60钴-γ射线辐照前后的致突变试验观察
作者：林飞 高沛泳 郭巧生 宋宜平
单位：林 飞 宋宜平 (中国药品生物制品检定所 北京 100050)； 高沛泳 (军事医学科学院放射医学所)； 郭巧生 (江苏省药品检验所)
关键词：
卫生毒理学杂志990116 近年来由于中药卫生标准的严格实施[1]，中成药的质量有了很大提高，但因中药品种繁多，来源复杂，有些还很难保证卫生质量。目前不少中药生产厂的产品在出厂前发现达不到卫生质量标准的，通常自行采取补救措施，即60钴-γ射线辐照灭菌，其辐照剂量随意确定，辐照后药品质量的变化，药理学活性是否降低、毒理学指标有否改变等等，均无科学数据来证实。为此我们列题[2]进行了研究。对11种中成药在大剂量辐照60钴-γ射线后和辐照前共22个受检药品，用致突变试验方法-Ames试验和微核试验进行了研究。
, 百拇医药
材料与方法
1.材料：复方丹参片、冠心苏合丸、小活络片和六应丸为上海中药一厂产品：消栓再造丸、牛黄清心丸、偏瘫复原丸和小儿至宝锭为北京同仁堂制药厂产品；鼻炎丸、羚翘解毒丸和胃乃安胶囊为广州中药一厂产品。上述受检药品取半量经60钴-γ射线10KGY辐照，另外半量不进行照射直接用于检测。
微核试验采用临床剂型，试验前粉碎并用蒸馏水制备成混悬液；Ames试验采用未加蜂蜜前药粉，粉碎、研磨，通过200目标准筛，用生理盐水制备成100mg/ml混悬液，经8磅20分高压灭菌后使用。
阴性对照剂采用0.9%生理盐水或蒸馏水。阳性对照剂阿的平、环磷酰胺、正定霉素和丝裂霉素C为药品，购于医院药房；吖啶橙、丙酮醛和2-乙酰氨基芴为化学品，购于化学试剂商店。
2.方法：
, 百拇医药
(1) Ames试验：菌株为TA97、TA98、TA100和TA102，经生物学特性鉴定合格后用于试验。预试验确定最高剂量组。正式试验共设5个浓度组，外加阴性对照组和阳性对照组，每次代谢活化(+S9)和非代谢活化(-S9)同时进行，重复试验2次。试验结果以平均值范围列表。
(2) 微核试验：采用NIH品系雄性小鼠，体重(22±2)g。预试验在12～72小时选择6个时间点，以最大混悬剂量1次灌胃给药0.8ml/只或LD50的1/2量作为高剂量组，以寻找最适采样时间。正式试验采用3个剂量组，外加阴性对照组和阳性对照组，每组6只小鼠，1次灌胃给药，在预试验确定的最适采样时间处死动物，取股骨骨髓涂片，甲醇固定，Giemsa染色后，在油镜下对每只小鼠观察1000个多染红细胞，计数微核细胞出现频率，以‰率表示。同时计数100个多染红细胞与正染红细胞的比例。
结果
1.Ames试验：结果表明：11种中成药辐照前后各剂量组的菌株平均回变菌落数与阴性对照组的平均回变菌落数基本相仿，辐照前后未见明显差别；阳性对照组的回变菌落数比阴性对照组的平均回变菌落数增加2倍以上。见表1。
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表1 11种中成药辐照前后Ames试验结果 药品
浓度范围
(μg/皿)
辐照
菌株回变菌落(±S9)平均范围
TA97
TA98
TA100
TA102
消栓再造丸
1-10000
-
, 百拇医药
92～146
37～44
155～165
286～302
+
97～163
35～46
146～173
278～295
牛黄清心丸
1-10000
-
91～155
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32～39
152～163
290～310
+
108～160
30～37
144～153
287～296
羚翘解毒丸
1-10000
-
114～163
34～46
, http://www.100md.com
146～157
277～296
+
101～175
33～44
152～166
292～313
偏瘫复原丸
1-10000
-
95～154
35～41
153～170
, 百拇医药
276～287
+
103～170
30～48
146～163
280～294
冠心苏合丸
1-5000
-
99～168
37～47
155～168
283～295
, 百拇医药
+
94～144
36～44
141～156
281～302
小儿至宝锭
1-10000
-
106～171
31～45
158～169
288～296
+
, http://www.100md.com
90～162
28～47
137～166
283～290
鼻炎丸
1-10000
-
103～168
33～48
140～160
278～305
+
100～144
, 百拇医药
30～39
136～153
285～299
六应丸
1-5000
-
132～157
35～44
138～148
278～287
+
109～161
32～41
, http://www.100md.com
145～155
281～291
胃乃安
1-10000
-
115～148
27～46
136～153
275～295
+
123～156
33～38
134～158
, 百拇医药
277～286
复方丹参片
1-10000
-
102～146
36～45
143～157
279～310
+
117～156
28～42
144～166
276～311
, http://www.100md.com
小活络片
1-10000
-
123～149
31～39
142～161
280～293
+
113～146
36～45
141～155
274～295
阴性对照
, 百拇医药
0
-
111～147
40～47
153～169
281～299
阳性对照
名称*
Qui
DMC
AO
GMX
, http://www.100md.com
AF
GMX
MC
μg/皿
500
2.5
40
480
40
240
1
回变数(-S9)
2 468
, http://www.100md.com
1 552
2 342
1 968
(+S9)
3 868
4784
1040
2 974
*Qui阿的平；DMC正定霉素；AO丫啶橙；GMX丙酮醛；AF乙酰氨基芴；MC丝裂霉素C
2.微核试验：结果表明：11种中成药辐照前后各剂量组与阴性对照组的结果相仿，多染红细胞与正染红细胞的比例基本正常，除个别高剂量组外，药品对骨髓细胞的毒性作用不明显，多染红细胞中的微核率均在4‰以下，用t检验方法进行统计学分析差异未见显著性(P>0.05)；阳性对照(环磷酰胺)组多染红细胞与正染红细胞的比例正常，但多染红细胞中的微核率有明显增加，统计学分析差异具有非常显著性(P<0.01)。见表2。
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表2 11种中成药辐照前后微核试验结果 药品
剂量
(g/kg)
辐照前
辐照后
细胞比值(P/N)
微核率(‰)
细胞比值(P/N)
微核率(‰)
消栓再造丸
54.6
1.21
, 百拇医药
2.83
1.19
3.83
27.3
1.31
2.32
1.10
2.33
13.7
1.86
2.33
1.19
3.00
, 百拇医药
牛黄清心丸
32.7
2.17
3.67
1.15
3.88
16.4
1.86
3.78
2.47
2.83
8.2
1.79
, 百拇医药
4.00
2.85
2.50
羚翘解毒丸
22.7
0.51
2.00
0.91
3.00
11.4
0.84
1.80
1.19
, 百拇医药
4.00
5.7
1.19
2.70
1.28
3.50
偏瘫复原丸
22.7
0.91
1.80
1.01
3.00
11.4
, http://www.100md.com
0.91
3.30
0.92
2.80
5.7
1.10
2.00
1.21
2.30
冠心苏合丸
6.8
1.41
1.00
, 百拇医药
1.18
1.50
3.4
1.63
1.80
1.60
0.80
1.7
1.54
0.80
1.55
1.20
小儿至宝锭
, 百拇医药
21.8
1.62
1.99
1.14
3.60
10.9
2.43
2.82
1.43
2.98
5.5
1.74
3.66
, http://www.100md.com
3.00
2.32
鼻炎丸
17.6
0.81
4.00
1.18
2.80
8.8
1.19
1.80
1.14
3.50
, 百拇医药
4.4
1.30
2.00
1.67
1.20
六应丸
0.8
1.28
1.80
1.17
1.30
0.4
1.49
, 百拇医药
1.00
1.26
1.20
0.2
1.54
1.70
1.23
0.80
胃乃安
27.3
1.00
2.66
3.06
, http://www.100md.com
2.98
13.7
1.33
1.66
2.03
2.67
6.9
1.72
2.83
1.91
2.16
复方丹参片
22.7
, 百拇医药
1.47
3.00
0.86
2.20
11.4
1.14
1.80
1.49
1.00
5.7
0.78
1.50
1.14
, http://www.100md.com
1.30
小活络片
20.2
1.02
1.83
1.04
1.33
10.1
1.17
1.50
1.19
1.50
5.1
, 百拇医药
1.37
1.67
1.56
0.83
蒸馏水
0
1.55
2.17
环磷酰胺
0.04
1.27
31.77
P/N 多染红细胞/1个正染红细胞
, 百拇医药
讨论
本研究选择以疗效确切，出口量大，国内优质产品为原则，按药品剂型分有大、小蜜丸，水丸，微丸，散剂和胶囊6种，11种中成药包括单味药材185种。在60钴-γ射线10KGY大剂量辐照下，进行辐照前和辐照后遗传毒性的对比研究。由于中成药颗粒大，不溶于水，有蜂蜜和无菌性差等，在进行体外试验中有一定难度。我们将药粉进一步粉碎，再研磨通过200目标准筛，其药粉颗粒<70μm，便于药物与细菌充分接触，再用预培养法进行试验，使敏感性有很大提高[3]；计数结果时，先用80～160倍解剖显微镜观察，便于区别药物颗粒与细菌菌苔和回变菌落，保证在高浓度下进行检测；试验用最高浓度按药粉最大混悬浓度100mg/ml中吸取0.1ml,该剂量浓度已达到10mg/皿，比检测化学药品要求的限量浓度提高1倍以上[4]，在未提取过的中成药粉及毒性很低时，可作为限量浓度或最大混悬浓度。
辐照灭菌技术为冷灭菌，其穿透力强且无残留，国内外已日益广泛地应用于食品保鲜、卫生材料和手术器械灭菌，但未见正式文件允许应用于药物，特别是天然药物。我国中草药和中成药已大量出口，鉴于中成药质量现状及国际和国内对卫生标准的严格要求，在文明生产的基础上，采取适当手段辅助灭菌是必要的，但应根据中药不同品种、不同剂型采取安全辐照灭菌剂量，避免大剂量盲目照射。本研究表明：中成药经60钴-γ射线辐照后在Ames试验和微核试验中，均未诱发体外基因突变和体内染色体畸变。提示，60钴-γ射线在10KGY以下辐照剂量对中成药引起遗传毒性和潜在致癌性的可能较小。
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国家科委“八五”研究项目《60钴-γ射线辐照中成药质量评价研究》的组成部分
参考文献
1.卫生部药政局.药品卫生检验方法，1984.
2.王宝琴主编：60钴-γ射线辐照中成药质量评价研究.中国药品生物制品检定所等编，1995.
3.林飞，等.微生物回复突变试验检验药品的体会.中国药理学通报，1988；4(1)：54.
4.卫生部药政局.致突变试验.新药(西药)临床前研究指导原则汇编，1993，211～216.
(修回日期 1998年10月), 百拇医药
单位：林 飞 宋宜平 (中国药品生物制品检定所 北京 100050)； 高沛泳 (军事医学科学院放射医学所)； 郭巧生 (江苏省药品检验所)
关键词：
卫生毒理学杂志990116 近年来由于中药卫生标准的严格实施[1]，中成药的质量有了很大提高，但因中药品种繁多，来源复杂，有些还很难保证卫生质量。目前不少中药生产厂的产品在出厂前发现达不到卫生质量标准的，通常自行采取补救措施，即60钴-γ射线辐照灭菌，其辐照剂量随意确定，辐照后药品质量的变化，药理学活性是否降低、毒理学指标有否改变等等，均无科学数据来证实。为此我们列题[2]进行了研究。对11种中成药在大剂量辐照60钴-γ射线后和辐照前共22个受检药品，用致突变试验方法-Ames试验和微核试验进行了研究。
, 百拇医药
材料与方法
1.材料：复方丹参片、冠心苏合丸、小活络片和六应丸为上海中药一厂产品：消栓再造丸、牛黄清心丸、偏瘫复原丸和小儿至宝锭为北京同仁堂制药厂产品；鼻炎丸、羚翘解毒丸和胃乃安胶囊为广州中药一厂产品。上述受检药品取半量经60钴-γ射线10KGY辐照，另外半量不进行照射直接用于检测。
微核试验采用临床剂型，试验前粉碎并用蒸馏水制备成混悬液；Ames试验采用未加蜂蜜前药粉，粉碎、研磨，通过200目标准筛，用生理盐水制备成100mg/ml混悬液，经8磅20分高压灭菌后使用。
阴性对照剂采用0.9%生理盐水或蒸馏水。阳性对照剂阿的平、环磷酰胺、正定霉素和丝裂霉素C为药品，购于医院药房；吖啶橙、丙酮醛和2-乙酰氨基芴为化学品，购于化学试剂商店。
2.方法：
, 百拇医药
(1) Ames试验：菌株为TA97、TA98、TA100和TA102，经生物学特性鉴定合格后用于试验。预试验确定最高剂量组。正式试验共设5个浓度组，外加阴性对照组和阳性对照组，每次代谢活化(+S9)和非代谢活化(-S9)同时进行，重复试验2次。试验结果以平均值范围列表。
(2) 微核试验：采用NIH品系雄性小鼠，体重(22±2)g。预试验在12～72小时选择6个时间点，以最大混悬剂量1次灌胃给药0.8ml/只或LD50的1/2量作为高剂量组，以寻找最适采样时间。正式试验采用3个剂量组，外加阴性对照组和阳性对照组，每组6只小鼠，1次灌胃给药，在预试验确定的最适采样时间处死动物，取股骨骨髓涂片，甲醇固定，Giemsa染色后，在油镜下对每只小鼠观察1000个多染红细胞，计数微核细胞出现频率，以‰率表示。同时计数100个多染红细胞与正染红细胞的比例。
结果
1.Ames试验：结果表明：11种中成药辐照前后各剂量组的菌株平均回变菌落数与阴性对照组的平均回变菌落数基本相仿，辐照前后未见明显差别；阳性对照组的回变菌落数比阴性对照组的平均回变菌落数增加2倍以上。见表1。
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表1 11种中成药辐照前后Ames试验结果 药品
浓度范围
(μg/皿)
辐照
菌株回变菌落(±S9)平均范围
TA97
TA98
TA100
TA102
消栓再造丸
1-10000
-
, 百拇医药
92～146
37～44
155～165
286～302
+
97～163
35～46
146～173
278～295
牛黄清心丸
1-10000
-
91～155
, http://www.100md.com
32～39
152～163
290～310
+
108～160
30～37
144～153
287～296
羚翘解毒丸
1-10000
-
114～163
34～46
, http://www.100md.com
146～157
277～296
+
101～175
33～44
152～166
292～313
偏瘫复原丸
1-10000
-
95～154
35～41
153～170
, 百拇医药
276～287
+
103～170
30～48
146～163
280～294
冠心苏合丸
1-5000
-
99～168
37～47
155～168
283～295
, 百拇医药
+
94～144
36～44
141～156
281～302
小儿至宝锭
1-10000
-
106～171
31～45
158～169
288～296
+
, http://www.100md.com
90～162
28～47
137～166
283～290
鼻炎丸
1-10000
-
103～168
33～48
140～160
278～305
+
100～144
, 百拇医药
30～39
136～153
285～299
六应丸
1-5000
-
132～157
35～44
138～148
278～287
+
109～161
32～41
, http://www.100md.com
145～155
281～291
胃乃安
1-10000
-
115～148
27～46
136～153
275～295
+
123～156
33～38
134～158
, 百拇医药
277～286
复方丹参片
1-10000
-
102～146
36～45
143～157
279～310
+
117～156
28～42
144～166
276～311
, http://www.100md.com
小活络片
1-10000
-
123～149
31～39
142～161
280～293
+
113～146
36～45
141～155
274～295
阴性对照
, 百拇医药
0
-
111～147
40～47
153～169
281～299
阳性对照
名称*
Qui
DMC
AO
GMX
, http://www.100md.com
AF
GMX
MC
μg/皿
500
2.5
40
480
40
240
1
回变数(-S9)
2 468
, http://www.100md.com
1 552
2 342
1 968
(+S9)
3 868
4784
1040
2 974
*Qui阿的平；DMC正定霉素；AO丫啶橙；GMX丙酮醛；AF乙酰氨基芴；MC丝裂霉素C
2.微核试验：结果表明：11种中成药辐照前后各剂量组与阴性对照组的结果相仿，多染红细胞与正染红细胞的比例基本正常，除个别高剂量组外，药品对骨髓细胞的毒性作用不明显，多染红细胞中的微核率均在4‰以下，用t检验方法进行统计学分析差异未见显著性(P>0.05)；阳性对照(环磷酰胺)组多染红细胞与正染红细胞的比例正常，但多染红细胞中的微核率有明显增加，统计学分析差异具有非常显著性(P<0.01)。见表2。
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表2 11种中成药辐照前后微核试验结果 药品
剂量
(g/kg)
辐照前
辐照后
细胞比值(P/N)
微核率(‰)
细胞比值(P/N)
微核率(‰)
消栓再造丸
54.6
1.21
, 百拇医药
2.83
1.19
3.83
27.3
1.31
2.32
1.10
2.33
13.7
1.86
2.33
1.19
3.00
, 百拇医药
牛黄清心丸
32.7
2.17
3.67
1.15
3.88
16.4
1.86
3.78
2.47
2.83
8.2
1.79
, 百拇医药
4.00
2.85
2.50
羚翘解毒丸
22.7
0.51
2.00
0.91
3.00
11.4
0.84
1.80
1.19
, 百拇医药
4.00
5.7
1.19
2.70
1.28
3.50
偏瘫复原丸
22.7
0.91
1.80
1.01
3.00
11.4
, http://www.100md.com
0.91
3.30
0.92
2.80
5.7
1.10
2.00
1.21
2.30
冠心苏合丸
6.8
1.41
1.00
, 百拇医药
1.18
1.50
3.4
1.63
1.80
1.60
0.80
1.7
1.54
0.80
1.55
1.20
小儿至宝锭
, 百拇医药
21.8
1.62
1.99
1.14
3.60
10.9
2.43
2.82
1.43
2.98
5.5
1.74
3.66
, http://www.100md.com
3.00
2.32
鼻炎丸
17.6
0.81
4.00
1.18
2.80
8.8
1.19
1.80
1.14
3.50
, 百拇医药
4.4
1.30
2.00
1.67
1.20
六应丸
0.8
1.28
1.80
1.17
1.30
0.4
1.49
, 百拇医药
1.00
1.26
1.20
0.2
1.54
1.70
1.23
0.80
胃乃安
27.3
1.00
2.66
3.06
, http://www.100md.com
2.98
13.7
1.33
1.66
2.03
2.67
6.9
1.72
2.83
1.91
2.16
复方丹参片
22.7
, 百拇医药
1.47
3.00
0.86
2.20
11.4
1.14
1.80
1.49
1.00
5.7
0.78
1.50
1.14
, http://www.100md.com
1.30
小活络片
20.2
1.02
1.83
1.04
1.33
10.1
1.17
1.50
1.19
1.50
5.1
, 百拇医药
1.37
1.67
1.56
0.83
蒸馏水
0
1.55
2.17
环磷酰胺
0.04
1.27
31.77
P/N 多染红细胞/1个正染红细胞
, 百拇医药
讨论
本研究选择以疗效确切，出口量大，国内优质产品为原则，按药品剂型分有大、小蜜丸，水丸，微丸，散剂和胶囊6种，11种中成药包括单味药材185种。在60钴-γ射线10KGY大剂量辐照下，进行辐照前和辐照后遗传毒性的对比研究。由于中成药颗粒大，不溶于水，有蜂蜜和无菌性差等，在进行体外试验中有一定难度。我们将药粉进一步粉碎，再研磨通过200目标准筛，其药粉颗粒<70μm，便于药物与细菌充分接触，再用预培养法进行试验，使敏感性有很大提高[3]；计数结果时，先用80～160倍解剖显微镜观察，便于区别药物颗粒与细菌菌苔和回变菌落，保证在高浓度下进行检测；试验用最高浓度按药粉最大混悬浓度100mg/ml中吸取0.1ml,该剂量浓度已达到10mg/皿，比检测化学药品要求的限量浓度提高1倍以上[4]，在未提取过的中成药粉及毒性很低时，可作为限量浓度或最大混悬浓度。
辐照灭菌技术为冷灭菌，其穿透力强且无残留，国内外已日益广泛地应用于食品保鲜、卫生材料和手术器械灭菌，但未见正式文件允许应用于药物，特别是天然药物。我国中草药和中成药已大量出口，鉴于中成药质量现状及国际和国内对卫生标准的严格要求，在文明生产的基础上，采取适当手段辅助灭菌是必要的，但应根据中药不同品种、不同剂型采取安全辐照灭菌剂量，避免大剂量盲目照射。本研究表明：中成药经60钴-γ射线辐照后在Ames试验和微核试验中，均未诱发体外基因突变和体内染色体畸变。提示，60钴-γ射线在10KGY以下辐照剂量对中成药引起遗传毒性和潜在致癌性的可能较小。
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国家科委“八五”研究项目《60钴-γ射线辐照中成药质量评价研究》的组成部分
参考文献
1.卫生部药政局.药品卫生检验方法，1984.
2.王宝琴主编：60钴-γ射线辐照中成药质量评价研究.中国药品生物制品检定所等编，1995.
3.林飞，等.微生物回复突变试验检验药品的体会.中国药理学通报，1988；4(1)：54.
4.卫生部药政局.致突变试验.新药(西药)临床前研究指导原则汇编，1993，211～216.
(修回日期 1998年10月), 百拇医药