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编号:10237744
拟除虫菊酯对大鼠脑组织谷氨酸和天门冬氨酸含量的影响
http://www.100md.com 《河北医科大学学报》 1999年第1期
     作者:牛玉杰 石年 李龙 刘毓谷

    单位:牛玉杰 河北医科大学公共卫生学院(石家庄 050017);石年 李龙 刘毓谷(同济医科大学环境毒理学教研室)

    关键词:除虫菊酯类;毒性;谷氨酸盐类;代谢;天门冬氨酸;代谢;脑;大鼠

    河北医科大学学报990101

    摘要 目的 探讨拟除虫菊酯对大鼠脑组织中谷氨酸和天门冬氨酸含量的影响及其可能机理。方法 用反相高效液相色谱技术观察溴氰菊酯和氯菊酯处理后大鼠脑组织皮层、海马、小脑中谷氨酸和天门冬氨酸含量的变化,并应用电压依赖性钙通道阻断剂尼莫地平和一氧化氮合酶竞争性抑制剂L-硝基精氨酸探讨Ca2+和一氧化氮对溴氰菊酯和氯菊酯作用的影响。结果 溴氰菊酯和氯菊酯可以明显提高大鼠脑组织皮层、海马、小脑中谷氨酸和天门冬氨酸的含量;尼莫地平能有效地阻断溴氰菊酯和氯菊酯升高谷氨酸和天门冬氨酸的作用;L-硝基精氨酸也能完全阻断溴氰菊酯的作用,但只能部分阻断氯菊酯的作用。结论 拟除虫菊酯能够提高大鼠脑组织中谷氨酸和天门冬氨酸的含量;Ca2+和一氧化氮在溴氰菊酯和氯菊酯升高谷氨酸和天门冬氨酸的机制中起着十分重要的作用;溴氰菊酯和氯菊酯升高谷氨酸和天门冬氨酸的机理可能存在着差异。
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    中图号 TQ456.3

    EFFECT OF PYRETHROIDS ON THE CONTENT OF GLUTAMATE AND

    ASPARTATE IN RAT BRAIN

    Niu Yujie

    Department of Occupational Health,the School of Public Health,Hebei Medical University

    (Shijiazhuang 050017)

    Shi Nian Li Long Liu Yugu

    Department of Environmental Toxicology,Tongji Medical University
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    ABSTRACT Objective To explore the effect of pyrethroids(Py) on the content of glutamate(Glu) and aspartate(Asp) as well as the possible mechanism of deltamethrin(DM) and permethrin(PM),which are representatives of Py,on Glu and Asp content in rat brain.Methods The technique of reversed phase high performance liquid chromatography was applied to measure the content of Glu and Asp in cerebral cortex,hippocampus,cerebellum after treatment of DM and PM,respectively.The role of Ca2+ and nitric oxide(NO) on the effect of DM and PM to Glu and Asp was explored by using a voltage-dependent Ca2+ channel blocker(Nimodipine,NIM) and a competitive inhibitor of nitric oxide synthase(Nω-nitro-L-arginine,L-NNA).Results The content of Glu and Asp in cerebral cortex,hippocampus,cerebellum were significantly enhanced by DM and PM. NIM could completely antagonise the effect of DM and PM on Glu and Asp.L-NNA could also antagonise the effect of DM on Glu and Asp,but it only partially blocked the effect of PM.Conclusion Py can promote the content of Glu and Asp in rat brain;Ca2+ and NO may play certain important roles in the action of Py on Glu and Asp; There may be some difference between the mechanism of DM and PM on the enhancement of Glu and Asp.
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    MeSH pyrethrins/tox;glutamates/metab;aspartic acid/metab;brain;rats

    拟除虫菊酯(pyrethroids)是根据天然除虫菊素的结构而人工合成的一种杀虫剂,具有广谱、高效、低残留等优点,广泛应用于农业、林业、仓储和卫生等部门的害虫防治〔1〕。作为一种神经毒剂,拟除虫菊酯对哺乳动物的神经毒性日益受到人们的关注,但其神经毒作用机理还不十分清楚。一般认为,拟除虫菊酯可以作用于神经细胞膜上的电压门控制Na+通道,使其关闭延迟,Na+持续内流,神经元反复去极化,从而造成神经细胞的过度兴奋〔2〕。兴奋性氨基酸如谷氨酸(glutamate,Glu)和天门冬氨酸(aspartate,ASP)作为中枢神经系统重要的神经递质,除对神经元具有强烈的兴奋作用外,还会导致兴奋性神经毒性〔3〕。外来化合物作用于动物或人体后,有可能影响兴奋性氨基酸的合成、释放和重摄取等过程,使脑组织内兴奋性氨基酸的含量发生变化,进而诱发一系列病理改变,造成神经系统损伤。因此,测定拟除虫菊酯处理后大鼠脑组织中谷氨酸和天门冬氨酸的含量,是研究拟除虫菊酯神经毒性的基础。本研究采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)技术,分别观察了溴氰菊酯(deltamethrin,DM)和氯菊酯(permethrin,PM)处理后大鼠脑组织中谷氨酸和天门冬氨酸含量的变化,并应用电压依赖性钙通道阻断剂尼莫地平(Nimodipine,NIM)和一氧化氮合酶(nitric oxide synthase)抑制剂L-硝基精氨酸(Nω-nitro-L-arginine,L-NNA)对溴氰菊酯和氯菊酯影响谷氨酸和天门冬氨酸的可能机理进行了探讨。
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    1 材料和方法

    1.1 主要试剂:溴氰菊酯(法国罗素.优克福公司产品),纯度≥98.0%;氯菊酯(江苏省农药研究所惠赠),纯度≥90%;谷氨酸和天门冬氨酸标准品(英国BDH化学有限公司产品),色谱纯;L-硝基精氨酸、尼莫地平、2,4二硝基氯苯(Sigma公司产品);其他试剂均为分析纯。

    1.2 仪器:反相高效液相色谱仪,HITACHI 638-50型,日本日立公司生产。

    1.3 动物的分组和处理

    1.3.1 分组:雄性Wistar大鼠69只,体质量180~220 g, 由同济医科大学试验动物中心提供。试验动物随机分成9组:① 对照组,② DM处理组,③ PM处理组,④L-NNA+DM处理组,⑤ NIM+DM处理组,⑥ L-NNA+PM处理组,⑦ NIM+PM处理组,⑧ L-NNA处理组,⑨ NIM处理组。对照组5只大鼠,其他各处理组均为8只。
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    1.3.2 处理:①溴氰菊酯和氯菊酯剂量分别为20 mg/kg和200 mg/kg,腹腔注射;②L-硝基精氨酸25 mg/kg,腹腔注射,1 h后腹腔注射20 mg/kg溴氰菊酯或200 mg/kg氯菊酯;③尼莫地平4 mg/kg,腹腔注射,30 min后腹腔注射20 mg/kg溴氰菊酯或200 mg/kg氯菊酯;④对照组给予1%二甲亚砜溶液;另设两组单独给予L-硝基精氨酸或尼莫地平。

    所有动物均给予DM或PM处理后1 h断头处死,分别取皮层、海马和小脑放入液氮中,以备进行氨基酸测定。

    1.4 脑组织中谷氨酸和天门冬氨酸含量的测定

    1.4.1 氨基酸提取液的制备:根据文献介绍的方法稍加改进〔4〕,按如下步骤进行操作:按1 ml/0.15 g脑组织的质量加入浓度为0.32 mol/L的蔗糖溶液→匀浆,5 000 g离心1 min→取50 μl上清,Lowry法进行蛋白定量→另取上清400 μl,加入800 μl浓度为0.4 mol/L的高氯酸,混匀,4 ℃反应30 min→1 000 g离心20 min→取上清液800 μl,加入400 μl浓度为7.5%的NaHCO3,再加入800 μl PBS(pH=6.8~7.0),混匀→0.22 μm滤膜过滤,-20 ℃保存,待测。
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    1.4.2 RP-HPLC测定:根据文献介绍的方法进行〔5〕,采用2,4二硝基氯苯柱前衍生、外标法进行。取氨基酸制备液1 ml,置于5 ml容量瓶中,加入Na2CO3 50 mg,溶解后加入2,4-二硝基氯苯,80 ℃恒温水浴,暗处反应1 h,取出,冷却,加入稀盐酸0.2 ml,以蒸馏水稀释至刻度,摇匀,进行RP-HPLC测定。测定结果用每克蛋白质中氨基酸的含量表示。测定条件:YWG-C18(4.6 mm×250 mm)不锈钢色谱柱,柱温25℃;流动相采用甲醇-醋酸盐缓冲系统,线性梯度洗脱;紫外检测器,检测波长360 nm,进样量20 μl。

    2 结果

    2.1 溴氰菊酯和氯菊酯对大鼠脑组织氨基酸含量的影响:测定结果表明,溴氰菊酯和氯菊酯可使皮层、海马和小脑组织中谷氨酸和天门冬氨酸含量明显升高,与对照组相比具有显著性意义(P<0.01)。溴氰菊酯使皮层、海马、小脑中谷氨酸和天门冬氨酸分别增加了113.5%、125.3%、108.6%和122.5%、82.6%、131.0%,而氯菊酯则使其分别增加了103.1%、113.1%、98.1%和93.6%、54.6%、120.2%,结果见表1。
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    表1 溴氰菊酯和氯菊酯对大鼠脑组织氨基酸含量的影响

    Table 1 Effect of deltamethrin and permethrin on amino

    acid content of rat brain

    (±s,mB/nmol.g-1) Group

    n

    Glu

    Asp

    Cortex
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    Hippocampus

    Cerebellum

    Cortex

    Hippocampus

    Cerebellum

    Control

    5

    19.64±1.20

    16.94±2.39

    18.75±1.69

    5.43 ±0.95

    6.72±0.94
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    5.20±0.89

    Deltamethrin

    8

    41.94±2.26*

    37.83±2.28*

    39.12±2.03*

    12.08±1.48*

    12.27±1.54*

    12.01±1.97*

    Permethrin
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    8

    39.88±2.23*

    36.10±1.24*

    37.15±2.50*

    10.51±1.75*

    10.39±1.08*

    11.45±1.84*

    * P<0.01 vs control by t test △ per g protein

    2.2 L-硝基精氨酸和尼莫地平对溴氰菊酯作用的影响:预先用L-硝基精氨酸和尼莫地平处理大鼠,然后给予溴氰菊酯,结果发现皮层、海马和小脑中谷氨酸和天门冬氨酸均降低到对照组水平,和对照组相比,无显著性意义(P>0.05),说明L-硝基精氨酸和尼莫地平能有效的阻止溴氰菊酯升高谷氨酸和天门冬氨酸的作用(图1~3)。
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    2.3 L-硝基精氨酸和尼莫地平对氯氰菊酯作用的影响:预先用L-硝基精氨酸处理大鼠,再给予氯菊酯时,皮层、海马和小脑中谷氨酸和天门冬氨酸的含量虽明显低于氯菊酯单独处理组,但仍显著高于对照组,提示L-硝基精氨酸只能部分阻断氯菊酯升高谷氨酸和天门冬氨酸的作用;但是预先用尼莫地平处理大鼠,则各脑区谷氨酸和天门冬氨酸均降至对照组水平,说明尼莫地平可以有效的阻断氯菊酯升高谷氨酸和天门冬氨酸的作用(图1~3)。

    2.4 溴氰菊酯和氯菊酯作用的比较:溴氰菊酯处理组和氯菊酯处理组之间,各脑区谷氨酸和天门冬氨酸的含量没有显著性意义(P>0.05),说明溴氰菊酯和氯菊酯对脑内谷氨酸和天门冬氨酸的影响作用可能是相同的。

    另外,单独给予L-硝基精氨酸和尼莫地平时,谷氨酸和天门冬氨酸的含量未见明显差异。

    图1 L-硝基精氨酸和尼莫地平在溴氰菊酯和氯菊酯
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    升高皮层谷氨酸和天门冬氨酸中的作用

    Figure 1 Role of L-NNA and NIM in enhancement of glutamate and

    aspartate in cortex by DM and PM

    * P<0.01vs control by t test

    △ per g protein

    图2 L-硝基精氨酸和尼莫地平在溴氰菊酯和氯菊酯

    升高海马谷氨酸和天门冬氨酸中的作用

    Figure 2 Role of L-NNA and NIM in enhancement of glutamate and
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    aspartate in hippocampus by DM and PM

    * P<0.01 vs control by t test

    △ per g protein

    图3 L-硝基精氨酸和尼莫地平在溴氰菊酯和氯菊酯

    升高小脑谷氨酸和天门冬氨酸中的作用

    Figure 3 Role of L-NNA and NIM in enhancement of glutamate and

    asparte in cerebellum by DM and PM
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    * P<0.01vs control by t test

    △ per g protein

    3 讨论

    3.1 拟除虫菊酯对脑组织中谷氨酸和天门冬氨酸含量的影响:谷氨酸和天门冬氨酸是中枢神经系统中主要的兴奋性神经递质,不但在信号转导、记忆机制中起着十分重要的作用,而且在许多神经疾病和外来化合物的神经毒性作用中起着十分重要的作用。

    近年来,人们开始重视拟除虫菊酯引起的兴奋性神经毒性,尤其是谷氨酸所起的作用。本文证实溴氰菊酯和氯菊酯对皮层、海马、小脑中谷氨酸和天门冬氨酸含量具有明显的升高作用,说明溴氰菊酯和氯菊酯有可能诱导谷氨酸和天门冬氨酸的合成增加,进而破坏中枢神经系统兴奋性递质和抑制性递质的平衡,产生过度兴奋症状。兴奋性氨基酸递质正常情况下储存在突触体的囊泡中,也可以存在于神经元的胞体中,只有过度释放进入突触间隙时,才会产生神经毒性。作者曾在用RP-HPLC测定脑中谷氨酸和天门冬氨酸总量的同时,测定了神经细胞内谷氨酸的含量,发现其未有什么变化,提示合成增加的氨基酸,可能已进入了突触间隙。本室以前的研究曾经证实溴氰菊酯可以促进大鼠脑片谷氨酸的释放,并增加谷氨酸与突触后膜上谷氨酸受体的结合〔6,7〕。因此,可以认为溴氰菊酯和氯菊酯可能通过诱导谷氨酸和天门冬氨酸合成增加并过量释放进入突触间隙而产生其神经毒性作用。
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    3.2 L-硝基精氨酸和尼莫地平在升高谷氨酸和天门冬氨酸中的作用:Ca2+是中枢神经系统中重要的第二信使,细胞内Ca2+浓度的升高,可以促进神经细胞内兴奋性氨基酸递质的过量释放,同时兴奋性氨基酸递质也可以使突触后膜Ca2+内流增加,产生损伤作用〔8〕。拟除虫菊酯可以使细胞内Ca2+浓度明显升高,而且尼莫地平作为一种电压依赖性钙通道阻滞剂,可以有效抑制溴氰菊酯和氯菊酯引起的谷氨酸和天门冬氨酸的升高,说明Ca2+与谷氨酸及天门冬氨酸升高之间有密切的关系,但谷氨酸和天门冬氨酸升高与Ca2+之间的确切因果关系,有待进一步深入研究。

    一氧化氮作为一种神经信息传递物质,在神经系统中起着十分重要的作用,不仅对神经元有直接的损伤作用,而且还可以介导谷氨酸等兴奋性氨基酸递质所致的神经损伤。溴氰菊酯和氯菊酯可以激活脑内一氧化氮合酶,产生过量的一氧化氮〔9〕,而且一氧化氮是一种逆行信使,又可以促进突触前兴奋性氨基酸的释放〔10〕,加速其在突触间隙的堆积。L-硝基精氨酸是一氧化氮合酶的竞争性抑制剂,可以有效阻止溴氰菊酯和氯菊酯升高谷氨酸和天门冬氨酸的作用,说明一氧化氮在拟除虫菊酯神经毒性中起着重要作用。
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    3.3 不同类型拟除虫菊酯对谷氨酸和天门冬氨酸的升高作用:根据化学结构不同,拟除虫菊酯可分为两大类:不含α-氰基的Ⅰ型拟除虫菊酯如氯菊酯、氨菊酯等;含有α-氰基的Ⅱ型拟除虫菊酯如溴氰菊酯、氯氰菊酯等〔11,12〕。其化学结构不同,毒性作用机理和中毒后的表现也不尽相同。为了比较两型拟除虫菊酯的神经毒作用机理,本研究对溴氰菊酯和氯菊酯升高谷氨酸和天门冬氨酸的作用进行了比较,发现含α-氰基的溴氰菊酯和不含α-氰基的氯菊酯,在RP-HPLC检测中,对于谷氨酸和天门冬氨酸含量的影响没有区别。但作者以前的研究曾发现在脑片实验中,Ⅱ型拟除虫菊酯诱发谷氨酸释放的作用强于Ⅰ型〔7〕,可能是因为本研究的模型为整体动物,由于其神经-内分泌调节的复杂性,以致溴氰菊酯和氯菊酯对谷氨酸和天门冬氨酸的影响在表现上没有什么差异。但是,溴氰菊酯升高谷氨酸和天门冬氨酸的作用能够被L-硝基精氨酸完全阻断,而L-硝基精氨酸只能部分阻断氯菊酯对谷氨酸和天门冬氨酸的升高,说明二者在升高谷氨酸和天门冬氨酸的机理方面可能存在差异。因此,对于拟除虫菊酯影响兴奋性氨基酸递质的准确机理,还应进行更加深入的研究。
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    国家自然科学基金重点课题(No.39430110)

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    (1998-09-10 收稿), 百拇医药