槲皮素对血小板衍生生长因子诱导的血管平滑肌细胞酪氨酸磷酸化蛋白表达的影响
作者:黄慧 王昌明 阳耀忠 黄文新 陈建中
单位:广西壮族自治区桂林市,桂林医学院附属医院 心内科 541001
关键词:酪氨酸蛋白激酶抑制剂 血小板衍生生长因子 主动脉平滑肌细胞 酪氨酸磷酸化蛋白
中国循环杂志990128 摘要 目的:研究酪氨酸蛋白激酶抑制剂槲皮素(quercetin)对血小板衍生生长因子(PDGF)诱导的血管平滑肌细胞(SMC)酪氨酸磷酸化蛋白表达的影响。方法:采用噻唑蓝比色法,流式细胞术分析槲皮素对PDGF诱导的SMC增殖的影响,应用免疫印迹法分析观察槲皮素对PDGF诱导的SMC酪氨酸磷酸化蛋白表达的影响。结果:与对照组相比,槲皮素处理组可显著地抑制PDGF诱导的SMC增殖及酪氨酸磷酸化蛋白的表达,尤以酪氨酸磷酸化蛋白分子量为85~180 kD明显。结论:槲皮素可显著地抑制PDGF诱导的SMC酪氨酸磷酸化蛋白的表达。
, 百拇医药
The Effects of Quercetin on Tyrosine Phosphorylation Protein Expression of
Platelet Derived Growth Factor Induced Aortic Smooth Muscle Cells
Huang Hui,Wang Changming,Yang Yaozhong,et al.
Department of Cardiology,Affiliated Hospital of Guilin Medical College,Guilin(541001),Guangxi
Abstract Objective:To study the effect of quercetin on platelet derived growth factor(PDGF)induced the expression of tyrosine phosphorylation protein in aortic smooth muscle cells(SMC).Methods:The effect of quercetin on both proliferation of SMC and expression of tyrosine phosphorylation protein induced by PDGF were analysed with MTT colorimetry,flow cytometry and western bloting technique respectirely.Results:PDGF induced the proliferation of SMC and the expression of tyrosine phosphorylation protein were inhibited significantly in quercetin treated group,especially in 85~180 kD protein,as compared with control group.Conclusion:Quercetin can significantly inhibite the expression of tyrosine phosphorylation protein induced by PDGF.
, http://www.100md.com
Key words Tyrosine protein kinase inhibitor;Platelet derived growth factor;Aortic smooth muscle cell;Tyrosine phosphorylation protein
血管平滑肌细胞(smooth muscle cell,SMC)增殖是动脉粥样硬化发生的中心环节[1]。而SMC的增殖依赖多种生长因子的作用。尤其是血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)[2]。我们于1997年2月~7月通过酪氨酸蛋白激酶抑制剂槲皮素(quercetin)来观察其对PDGF诱导的SMC增殖及酪氨酸磷酸化蛋白表达的影响,探讨槲皮素在防治动脉粥样硬化中的意义。
1 材料和方法
主要试剂及仪器:无血清混合培养基(SFM)、槲皮素、PDGF-BB均为美国Gibco产品,噻唑蓝为瑞士Fluka产品。
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噻唑蓝比色法检验细胞增殖:胸主动脉平滑肌细胞培养按赵三妹等[3]方法,取5~6代SMC接种于96孔培养板内,每孔加SMC 1.6×104个细胞,在5% CO2培养箱培养24小时,弃原有培养基,改无血清培养24小时。细胞分组如下:①槲皮素组:分别加入3种浓度的槲皮素(0.1 μmol/L,1.0 μmol/L,10.0 μmol/L),每种浓度各6孔,3小时后每孔加PDGF10 ng;②PDGF组:每孔仅加PDGF10 ng(6孔);③无血清混合培养基组:每孔仅加无血清混合培养基(6孔)。各组分别于第24、48、72小时按Mosmann[4]法进行噻唑蓝比色测定,计算6孔A值(光密度值)均数。
细胞周期时相分布测定:细胞接种于100 ml培养瓶中,细胞分组同上。各组细胞培养48小时后制成单细胞悬液,70%冷乙醇固定,4℃冰箱保存待测。流式细胞测定值输入微机处理,计算细胞周期各时相脱氧核糖核酸(DNA)的百分含量〔包括DNA静止期/DNA合成前期(G0/G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)及分裂期(M期)的含量〕。
, 百拇医药
槲皮素对血小板衍生生长因子诱导的血管平滑肌细胞酪氨酸磷酸化蛋白表达的影响:①细胞处理 细胞接种于100 ml培养瓶内培养48小时,用无血清混合培养基培养48小时,分别含槲皮素0.1 μmol/L、1.0 μmol/L、10.0 μmol/L、100.0 μmol/L,14小时后再加1次上述浓度槲皮素,3小时后加入PDGF100 ng,再培养24小时后加1次同样浓度的槲皮素,3小时后加PDGF100 ng,1~5分钟后将细胞进行免疫印迹法分析。②免疫印迹法:按参考文献[5]方法进行免疫印迹法分析。
统计学处理:结果以±s表示,组间比较用t检验。
2 结果
2.1 槲皮素对血小板衍生生长因子诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响(噻唑蓝比色)
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由表1可知槲皮素均能在24、48及72小时显著地抑制PDGF诱导的SMC增殖,呈剂量依赖性。
表1 槲皮素对血小板衍生生长因子诱导的血管
平滑肌细胞增殖的影响(噻唑蓝法) 组别
光密度值
24小时
48小时
72小时
无血清混合
培养基组
0.337±0.023
0.337±0.011
, 百拇医药
0.328±0.028
血小板衍生
生长因子组
0.590±0.033
0.667±0.029
0.708±0.017
槲皮素组
0.1 μmol/L
0.537±0.045*
0.588±0.034**
0.140±0.030**
, 百拇医药
1.0 μmol/L
0.441±0.041**
0.514±0.031**
0.533±0.030**
10.0 μmol/L
0.376±0.038**
0.389±0.028**
0.399±0.026**
注:与血小板衍生生长因子组相比*P<0.01 **P<0.001
, 百拇医药
2.2 槲皮素对血小板衍生生长因子诱导的血管平滑肌细胞周期脱氧核糖核酸含量的影响
由表2可见槲皮素能显著地抑制PDGF诱导的SMC细胞周期DNA合成期及DNA合成后期及分裂期DNA百分含量,阻断细胞由DNA静止期/DNA合成前期向DNA合成期的转化,呈剂量依赖性。
2.3 槲皮素对血小板衍生生长因子诱导的血管平滑肌细胞酪氨酸磷酸化蛋白表达的影响
表2 槲皮素对血小板衍生生长因子诱导的平滑肌
细胞脱氧核糖核酸百分含量的影响(%) 组别
平滑肌细胞脱氧核糖核酸百分含量
DNA静止期/
DNA合成前期
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DNA合成期
DNA合成后
期及分裂期
无血清混合培养基组
93.5±1.6
5.5±0.6
1.0±0.2
血小板衍生生长因子组
37.9±1.7
51.8±1.4
10.3±0.7
槲皮素组
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0.1 μmol/L
48.6±1.4*
44.9±1.6**
6.5±0.6**
1.0 μmol/L
68.5±1.0**
26.6±0.7**
4.9±1.0**
10.0 μmol/L
85.6±1.9**
, 百拇医药
10.3±0.8**
4.1±0.8**
注:与血小板衍生生长因子组相比*P<0.01 **P<0.001
由附图可知槲皮素浓度为0.1 μmol/L就能显著地抑制PDGF诱导的SMC酪氨酸磷酸化蛋白的表达。尤以酪氨酸磷酸化蛋白分子量为85~180 kD明显,100.0 μmol/L则可完全抑制PDGF诱导的SMC酪氨酸磷酸化蛋白的表达,呈剂量效应关系。
附图 免疫印迹法显示槲皮素对血小板衍生生长因子诱导的血管平滑肌细胞酪氨酸磷酸化蛋白表达的剂量效应关系,血小板衍生生长因子的浓度为20 ng/ml
, 百拇医药
3 讨论
动脉粥样硬化的一个基本病理特征就是平滑肌细胞异常增殖,已证实增生的平滑肌细胞是动脉粥样硬化斑块的主要成份[1],PDGF既有促有丝分裂作用,又有趋化作用,在平滑肌增生反应中起重要作用。阻断PDGF作用的关键是阻断酪氨酸蛋白激酶的活性,因为当PDGF与受体结合后,可激活受体细胞膜内的酪氨酸蛋白激酶,从而催化靶蛋白分子中的酪氨酸磷酸化,而这些蛋白序列可被含SH2(Src癌基因家族同源区-2)或SH3区的蛋白所识别,通过这种识别和结合的方式,可同时启动几条信号传导通路(如PLC-r、Ⅰ-P3K、ras、src癌基因家族等),并经磷酸化的级联反应将信号逐渐放大,最终将其传到核内的转录机构,以调节特定基因的表达或通过改变细胞内蛋白质的功能状况(如骨架蛋白的磷酸化等)导致细胞的增殖和分化[6]。
本文结果显示酪氨酸蛋白激酶特异性抑制剂槲皮素能抑制PDGF诱导的SMC增殖及酪氨酸磷酸化蛋白的表达。且呈显著的剂量效应关系。表明酪氨酸蛋白激酶抑制剂槲皮素有望应用于动脉粥样硬化的防治。
, 百拇医药
作者简介:黄慧 女 46岁 教授 学士
参考文献
1 Ross R.The pathogenesis of atherosclerosis:A perspective for the 19905.Nature,1993,362:801—812.
2 Russell R.Peptide regulatory factor platelet derivecl growth factor.Lancet,1989,335:1179—1182.
3 赵三妹,夏人仪,王宗立,等.动脉平滑肌细胞的培养方法及应用.中华病理学杂志,1987,16:260—261.
4 Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cell growth and survival:Application to proliferation and cytotoxicity assays.J Immunol Methods,1983,65:55—63.
5 金冬雁,黎孟枫主编.分子克隆实验指南.第2版.北京:科学出版社,1992.889—898.
6 Cohen GB.Modular binding domains in signal transduction protein.Cell,1995,80:237—245.
(收稿:1998-03-26 修回:1998-11-20), 百拇医药
单位:广西壮族自治区桂林市,桂林医学院附属医院 心内科 541001
关键词:酪氨酸蛋白激酶抑制剂 血小板衍生生长因子 主动脉平滑肌细胞 酪氨酸磷酸化蛋白
中国循环杂志990128 摘要 目的:研究酪氨酸蛋白激酶抑制剂槲皮素(quercetin)对血小板衍生生长因子(PDGF)诱导的血管平滑肌细胞(SMC)酪氨酸磷酸化蛋白表达的影响。方法:采用噻唑蓝比色法,流式细胞术分析槲皮素对PDGF诱导的SMC增殖的影响,应用免疫印迹法分析观察槲皮素对PDGF诱导的SMC酪氨酸磷酸化蛋白表达的影响。结果:与对照组相比,槲皮素处理组可显著地抑制PDGF诱导的SMC增殖及酪氨酸磷酸化蛋白的表达,尤以酪氨酸磷酸化蛋白分子量为85~180 kD明显。结论:槲皮素可显著地抑制PDGF诱导的SMC酪氨酸磷酸化蛋白的表达。
, 百拇医药
The Effects of Quercetin on Tyrosine Phosphorylation Protein Expression of
Platelet Derived Growth Factor Induced Aortic Smooth Muscle Cells
Huang Hui,Wang Changming,Yang Yaozhong,et al.
Department of Cardiology,Affiliated Hospital of Guilin Medical College,Guilin(541001),Guangxi
Abstract Objective:To study the effect of quercetin on platelet derived growth factor(PDGF)induced the expression of tyrosine phosphorylation protein in aortic smooth muscle cells(SMC).Methods:The effect of quercetin on both proliferation of SMC and expression of tyrosine phosphorylation protein induced by PDGF were analysed with MTT colorimetry,flow cytometry and western bloting technique respectirely.Results:PDGF induced the proliferation of SMC and the expression of tyrosine phosphorylation protein were inhibited significantly in quercetin treated group,especially in 85~180 kD protein,as compared with control group.Conclusion:Quercetin can significantly inhibite the expression of tyrosine phosphorylation protein induced by PDGF.
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Key words Tyrosine protein kinase inhibitor;Platelet derived growth factor;Aortic smooth muscle cell;Tyrosine phosphorylation protein
血管平滑肌细胞(smooth muscle cell,SMC)增殖是动脉粥样硬化发生的中心环节[1]。而SMC的增殖依赖多种生长因子的作用。尤其是血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)[2]。我们于1997年2月~7月通过酪氨酸蛋白激酶抑制剂槲皮素(quercetin)来观察其对PDGF诱导的SMC增殖及酪氨酸磷酸化蛋白表达的影响,探讨槲皮素在防治动脉粥样硬化中的意义。
1 材料和方法
主要试剂及仪器:无血清混合培养基(SFM)、槲皮素、PDGF-BB均为美国Gibco产品,噻唑蓝为瑞士Fluka产品。
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噻唑蓝比色法检验细胞增殖:胸主动脉平滑肌细胞培养按赵三妹等[3]方法,取5~6代SMC接种于96孔培养板内,每孔加SMC 1.6×104个细胞,在5% CO2培养箱培养24小时,弃原有培养基,改无血清培养24小时。细胞分组如下:①槲皮素组:分别加入3种浓度的槲皮素(0.1 μmol/L,1.0 μmol/L,10.0 μmol/L),每种浓度各6孔,3小时后每孔加PDGF10 ng;②PDGF组:每孔仅加PDGF10 ng(6孔);③无血清混合培养基组:每孔仅加无血清混合培养基(6孔)。各组分别于第24、48、72小时按Mosmann[4]法进行噻唑蓝比色测定,计算6孔A值(光密度值)均数。
细胞周期时相分布测定:细胞接种于100 ml培养瓶中,细胞分组同上。各组细胞培养48小时后制成单细胞悬液,70%冷乙醇固定,4℃冰箱保存待测。流式细胞测定值输入微机处理,计算细胞周期各时相脱氧核糖核酸(DNA)的百分含量〔包括DNA静止期/DNA合成前期(G0/G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)及分裂期(M期)的含量〕。
, 百拇医药
槲皮素对血小板衍生生长因子诱导的血管平滑肌细胞酪氨酸磷酸化蛋白表达的影响:①细胞处理 细胞接种于100 ml培养瓶内培养48小时,用无血清混合培养基培养48小时,分别含槲皮素0.1 μmol/L、1.0 μmol/L、10.0 μmol/L、100.0 μmol/L,14小时后再加1次上述浓度槲皮素,3小时后加入PDGF100 ng,再培养24小时后加1次同样浓度的槲皮素,3小时后加PDGF100 ng,1~5分钟后将细胞进行免疫印迹法分析。②免疫印迹法:按参考文献[5]方法进行免疫印迹法分析。
统计学处理:结果以±s表示,组间比较用t检验。
2 结果
2.1 槲皮素对血小板衍生生长因子诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响(噻唑蓝比色)
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由表1可知槲皮素均能在24、48及72小时显著地抑制PDGF诱导的SMC增殖,呈剂量依赖性。
表1 槲皮素对血小板衍生生长因子诱导的血管
平滑肌细胞增殖的影响(噻唑蓝法) 组别
光密度值
24小时
48小时
72小时
无血清混合
培养基组
0.337±0.023
0.337±0.011
, 百拇医药
0.328±0.028
血小板衍生
生长因子组
0.590±0.033
0.667±0.029
0.708±0.017
槲皮素组
0.1 μmol/L
0.537±0.045*
0.588±0.034**
0.140±0.030**
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1.0 μmol/L
0.441±0.041**
0.514±0.031**
0.533±0.030**
10.0 μmol/L
0.376±0.038**
0.389±0.028**
0.399±0.026**
注:与血小板衍生生长因子组相比*P<0.01 **P<0.001
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2.2 槲皮素对血小板衍生生长因子诱导的血管平滑肌细胞周期脱氧核糖核酸含量的影响
由表2可见槲皮素能显著地抑制PDGF诱导的SMC细胞周期DNA合成期及DNA合成后期及分裂期DNA百分含量,阻断细胞由DNA静止期/DNA合成前期向DNA合成期的转化,呈剂量依赖性。
2.3 槲皮素对血小板衍生生长因子诱导的血管平滑肌细胞酪氨酸磷酸化蛋白表达的影响
表2 槲皮素对血小板衍生生长因子诱导的平滑肌
细胞脱氧核糖核酸百分含量的影响(%) 组别
平滑肌细胞脱氧核糖核酸百分含量
DNA静止期/
DNA合成前期
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DNA合成期
DNA合成后
期及分裂期
无血清混合培养基组
93.5±1.6
5.5±0.6
1.0±0.2
血小板衍生生长因子组
37.9±1.7
51.8±1.4
10.3±0.7
槲皮素组
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0.1 μmol/L
48.6±1.4*
44.9±1.6**
6.5±0.6**
1.0 μmol/L
68.5±1.0**
26.6±0.7**
4.9±1.0**
10.0 μmol/L
85.6±1.9**
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10.3±0.8**
4.1±0.8**
注:与血小板衍生生长因子组相比*P<0.01 **P<0.001
由附图可知槲皮素浓度为0.1 μmol/L就能显著地抑制PDGF诱导的SMC酪氨酸磷酸化蛋白的表达。尤以酪氨酸磷酸化蛋白分子量为85~180 kD明显,100.0 μmol/L则可完全抑制PDGF诱导的SMC酪氨酸磷酸化蛋白的表达,呈剂量效应关系。
附图 免疫印迹法显示槲皮素对血小板衍生生长因子诱导的血管平滑肌细胞酪氨酸磷酸化蛋白表达的剂量效应关系,血小板衍生生长因子的浓度为20 ng/ml
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3 讨论
动脉粥样硬化的一个基本病理特征就是平滑肌细胞异常增殖,已证实增生的平滑肌细胞是动脉粥样硬化斑块的主要成份[1],PDGF既有促有丝分裂作用,又有趋化作用,在平滑肌增生反应中起重要作用。阻断PDGF作用的关键是阻断酪氨酸蛋白激酶的活性,因为当PDGF与受体结合后,可激活受体细胞膜内的酪氨酸蛋白激酶,从而催化靶蛋白分子中的酪氨酸磷酸化,而这些蛋白序列可被含SH2(Src癌基因家族同源区-2)或SH3区的蛋白所识别,通过这种识别和结合的方式,可同时启动几条信号传导通路(如PLC-r、Ⅰ-P3K、ras、src癌基因家族等),并经磷酸化的级联反应将信号逐渐放大,最终将其传到核内的转录机构,以调节特定基因的表达或通过改变细胞内蛋白质的功能状况(如骨架蛋白的磷酸化等)导致细胞的增殖和分化[6]。
本文结果显示酪氨酸蛋白激酶特异性抑制剂槲皮素能抑制PDGF诱导的SMC增殖及酪氨酸磷酸化蛋白的表达。且呈显著的剂量效应关系。表明酪氨酸蛋白激酶抑制剂槲皮素有望应用于动脉粥样硬化的防治。
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作者简介:黄慧 女 46岁 教授 学士
参考文献
1 Ross R.The pathogenesis of atherosclerosis:A perspective for the 19905.Nature,1993,362:801—812.
2 Russell R.Peptide regulatory factor platelet derivecl growth factor.Lancet,1989,335:1179—1182.
3 赵三妹,夏人仪,王宗立,等.动脉平滑肌细胞的培养方法及应用.中华病理学杂志,1987,16:260—261.
4 Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cell growth and survival:Application to proliferation and cytotoxicity assays.J Immunol Methods,1983,65:55—63.
5 金冬雁,黎孟枫主编.分子克隆实验指南.第2版.北京:科学出版社,1992.889—898.
6 Cohen GB.Modular binding domains in signal transduction protein.Cell,1995,80:237—245.
(收稿:1998-03-26 修回:1998-11-20), 百拇医药