HLA-DRB1*10与中国人慢性乙肝关联
作者：沈晶晶 冀英 关晓蕾 黄若君 孙逸平
单位：沈晶晶 关晓蕾 黄若君(100045 北京儿科研究所)；冀英(北京海淀医院)；孙逸平(中日友好医院)
关键词：HLA DR抗原；肝炎；乙型；聚合酶链反应
中华微生物学和免疫学杂志990123 【 摘要 】 目的 研究HLA-DRB1基因与乙肝的关联，探讨可能由病毒感染继发的自身免疫反应导致疾病发展的主要原因，为乙肝的病因学及预后估计提供免疫学方面的资料。 方法 在我国北方地区随机选择54名慢性乙肝患者，用PCR/SSP方法进行HLA-DRB1等位基因分型，对照组为同地区92名健康人。采用疾病和HLA相关分析软件进行数据处理。 结果 病人组HLA-DRB1*10基因频率明显增高为25.9%(RR=10.38,Pc=0.001)，其它等位基因频率在实验组与对照组间差异无显著性。 结论 HLA-DRB1*10基因与中国北方人群慢性乙肝关联。
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The association of HLA-DRB1*10 with chronic hepatitis B in Chinese patients SHEN Jingjing, JI Ying, GUAN Xiaolei, et al. Beijing Research Institute of Pediatrics, Beijing 100045
【 Abstract 】 Objective Hepatitis B is a common infectious disease in China. Probably the immunoreaction which is secondary to HBV infection is the main reason. The authors studied the association of HLA-DRB1 alleles with hepatitis B in northern China, to provide some evidence of immunology for hepatitis B infection in pathogenesis and prognosis. Methods Fifty four northern Chinese patients of Han nationality affected with chronic hepatitis B were typed for HLA-DRB1 genes with PCR-SSP method. Results Compared to 92 matched controls, only DRB1*10 increased significantly in patient group. The frequency of DRB1*10 was 25.9% with RR=10.83, Pc=0.001. No significant different allele frequencies of other alleles were observed between the patient group and control. Conclusions The susceptibility to chronic hepatitis B is strongly associated with HLA-DRB1*10 allele in northern Chinese patients.
, 百拇医药
【 Subject words 】 HLA-DRB1*10 Hepatitis B Polymerase chain reaction
乙型肝炎在我国是一种常见的感染性疾病，流行很广，危害严重。临床资料表明，不同个体在感染了HBV后会出现不同的疾病过程，如急性、慢性、肝硬化、肝癌等。 流行病资料提示，肝炎的感染和发病有家族性，而亲子间的感染机率大于夫妻。普遍认为，不同的疾病过程与HBV本身无关而决定于个体的免疫反应状况〔1,2〕。由于组织相容性复合体是控制免疫应答的主要基因，因此我们推测，本病可能和MHC的基因产物有关。国外已在这方面做了一些研究，但多集中于自身免疫性肝炎，对传染性肝炎报道不多。在国内，除早期曾有某些血清学研究外，尚未见对本病有较精确的分型研究。
我们对54名慢性乙肝患者进行HLA-DRB1基因分型，与正常对照组比较后，发现HLA-DRB1*10与本病有较强的关联，报道如下。
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材料与方法
1.病人：在我国北方地区随机选择54名病人，女25人，男29人，年龄最大65岁，最小17岁，平均41岁。根据我国通行标准诊断为慢性乙型肝炎。对照组为同地区92名健康人。
2.方法： 用盐析法提取DNA〔3〕。采用医科院基础所DR分型试剂盒。用PCR/SSP方法分型，共14对引物可分别鉴定HLA-DRB1*1～10的宽特异性。扩增产物在含溴乙锭的2%琼脂糖凝胶中电泳后，在紫外照射仪下判读。
3.统计分析：用疾病和HLA抗原相关分析软件(上海第二医科大学)进行数据处理。主要算出相对风险(RR)值及校正P值(Pc)。
结果与讨论
乙肝患者和对照组的HLA-DRB1基因频率、RR值及显著性分析见表1。分析发现，乙肝患者的HLA-DRB1*10显著增高(病人25.9%,对照组3.3%,RR=10.38, Pc=0.001)。未发现显著性的保护基因。
, 百拇医药
表1 乙肝患者与健康人HLA-DRB1基因的分布
Table 1. Distribution of HLA-DRB1 alleles in HB patients and controls HLA-
DRB1
allele
Frequencies(%)
in patients
(n=54)
Frequencies(%)
in controls
(n=92)
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RR
Pc
DR1
3.7
7.6
0.47
ns
DR15
24.0
38.0
0.52
ns
DR16
, http://www.100md.com
3.7
5.4
0.67
ns
DR3
1.8
5.4
0.33
ns
DR4
22.2
26.1
0.81
, 百拇医药
ns
DR11
9.2
14.1
0.62
ns
DR12
18.5
13.0
1.52
ns
DR13
1.9
, 百拇医药
4.3
0.42
ns
DR14
13.0
12.0
1.09
ns
DR6
25.9
16.3
1.80
ns
, http://www.100md.com
DR7
13.0
25.0
0.45
ns
DR8
7.4
8.7
0.84
ns
DR9
35.1
27.1
, http://www.100md.com
1.45
ns
DR10
25.9
3.3
10.38
0.001
RR：Relative risk Pc：Corrected P values
国外有关乙肝和HLA关联研究的报道较少。在有限的工作中曾报道冈比亚人群中HLA-DRB1 *1302为保护基因〔1〕；卡塔尔人群中DR2为保护基因，DR7为易感基因〔4〕；还有报道乙肝严重程度与HLA-I类基因纯合细胞有关〔5〕。另一方面，报道较多的是免疫性肝炎和HLA的关系，发现患者组中DR3(白人)、DR4(日本)、DRB1*1301(阿根廷儿童)频率增高，也有报道扩展单倍型B8-SC01-DR3和B44-FC31-DR7与免疫性肝炎关联；而DR2、DR7、DQA1*0201、DQB1*0602等基因频率降低(均根据1996年第12届国际组织相容性会议材料)。由于与自身免疫性肝炎关联的HLA表型和基因型较分散，对探讨本病和HLA关联的本质和机理增加了困难，我们的研究发现乙肝与HLA-DRB1*10关联，在此前未见报道。
, 百拇医药
DRB1*10为中国人少见的HLA基因型，正常人群中频率仅为3.3%〔6〕,在乙肝患者中却高达25.9%。未见此基因与其它疾病关联的报道。我们手头的材料是在中国人类风湿关节炎中，DRB1*1001为仅次于DRB1*0405的关联基因(个人材料未发表)。因此，本研究结果提供了有意义的线索。
自身免疫反应是引起慢性活动性肝炎的重要机制之一。近年来，HLA与自身免疫病关联的研究随HLA分子三维结构的阐明而取得了重大进展，现认为，HLA与疾病的关联可能源于HLA分子本身〔7，8〕。由于受类风湿关节炎(其易感性涉及DRβ链第67,70,71位氨基酸)和胰岛素依赖型糖尿病(与DQα链第52位精氨酸以及DQβ链第57位非天门冬氨酸相关)的易感性的启发，与HLA分子的肽链结构有关，据此对HLA-DR分子的一级结构进行比较分析(表2)，结果提示，40位苯丙氨酸可能是乙肝的一个保护基因，而第70位精氨酸则与易感性有关。DR分子肽链第40位和第70位氨基酸参与构成HLA的抗原结合槽(α螺旋和β底层)。因此我们认为，HLA-DR分子第40位酪氨酸和第70位精氨酸是与乙型肝炎易感性相关的结构特征。此假说是否正确有待进一步研究。
, 百拇医药
表2 DRB1*10在β链第40和70位的氨基酸残基
Table 2. Amino acid residues of DRB1*10 in position 40 and 70 of β chain
RR
40
70
Pos
DR9
1.45
Phe
Arg
DR10
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10.3
Tyr
Arg
DR12
1.52
Phe
Asp
Neg
DR1
0.47
Phe
Gln
DR3
, 百拇医药
0.33
Phe
Gln
DR7
0.45
Phe
Asp
DR13
0.42
Phe
Asp
DR15
0.52
, 百拇医药
Phe
Gln
Pos:Increased alleles in patients;Neg:Decreased alleles in patients;RR:Relative risk;Tyr:Tyrosine; Arg:Arginine; Phe: Phenylalanine; Gln: Glutamine; Asp:Aspartic acid
志谢：本研究得到中国医学科学院基础医学研究所邱长春教授支持，表示感谢。 参考文献
[1]Mark R Thursz, M.R.C.P., Dominic Kwiatkowski, et al. Association between an MHC class II allele and clearance of hepatitis B virus in the Gambia. New Engl J Med, 1995,332∶ 1065-1068.
, 百拇医药
[2]Czaja AJ, Carpenter HA, Santrach PJ, et al. Significance of human leukocyte antigens DR3 and DR4 in chronic viral hepatitis. Dig Dis Sci， 1995，40(10)∶2098-2106.
[3]Miller SA, Dyke DD, Polesk HF, et al. A simple salting-out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res, 1988,16∶1215-1215.
[4]Ajaybe Almarri, J Richard Batchelor. HLA and hepatitis B infection. Lancet，1994，344∶1194-1195.
, http://www.100md.com
[5]Pollicino T, Pernice F, Campo S, et al. Severe outcome of hepatitis B virus (HBV) infection and lack of HBV e antigen-defective virus emergence in patients homozygous for HLA class I alleles. J Gen Virol， 1996，77∶1833-1836.
[6]Gao X, Sun Y, An J, et al. DNA typing for HLA-DR, and-DP alleles in Chinese population using the polymerase chain reaction (PCR) and oligonucleotide probes. Tissue Antigens， 1991,38∶24-30.
[7]Dominique Charron. HLA class Ⅱ disease associations: molecular basis. Journal of Autoimmunity, 1992,5∶45-53.
[8]Erik Thorsby. HLA-associated disease susceptibility-which genes are primarily involved? The Immunologist,1995,3(2)∶51-58.
(收稿：1997-07-07 修回：1998-03-26), 百拇医药
单位：沈晶晶 关晓蕾 黄若君(100045 北京儿科研究所)；冀英(北京海淀医院)；孙逸平(中日友好医院)
关键词：HLA DR抗原；肝炎；乙型；聚合酶链反应
中华微生物学和免疫学杂志990123 【 摘要 】 目的 研究HLA-DRB1基因与乙肝的关联，探讨可能由病毒感染继发的自身免疫反应导致疾病发展的主要原因，为乙肝的病因学及预后估计提供免疫学方面的资料。 方法 在我国北方地区随机选择54名慢性乙肝患者，用PCR/SSP方法进行HLA-DRB1等位基因分型，对照组为同地区92名健康人。采用疾病和HLA相关分析软件进行数据处理。 结果 病人组HLA-DRB1*10基因频率明显增高为25.9%(RR=10.38,Pc=0.001)，其它等位基因频率在实验组与对照组间差异无显著性。 结论 HLA-DRB1*10基因与中国北方人群慢性乙肝关联。
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The association of HLA-DRB1*10 with chronic hepatitis B in Chinese patients SHEN Jingjing, JI Ying, GUAN Xiaolei, et al. Beijing Research Institute of Pediatrics, Beijing 100045
【 Abstract 】 Objective Hepatitis B is a common infectious disease in China. Probably the immunoreaction which is secondary to HBV infection is the main reason. The authors studied the association of HLA-DRB1 alleles with hepatitis B in northern China, to provide some evidence of immunology for hepatitis B infection in pathogenesis and prognosis. Methods Fifty four northern Chinese patients of Han nationality affected with chronic hepatitis B were typed for HLA-DRB1 genes with PCR-SSP method. Results Compared to 92 matched controls, only DRB1*10 increased significantly in patient group. The frequency of DRB1*10 was 25.9% with RR=10.83, Pc=0.001. No significant different allele frequencies of other alleles were observed between the patient group and control. Conclusions The susceptibility to chronic hepatitis B is strongly associated with HLA-DRB1*10 allele in northern Chinese patients.
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【 Subject words 】 HLA-DRB1*10 Hepatitis B Polymerase chain reaction
乙型肝炎在我国是一种常见的感染性疾病，流行很广，危害严重。临床资料表明，不同个体在感染了HBV后会出现不同的疾病过程，如急性、慢性、肝硬化、肝癌等。 流行病资料提示，肝炎的感染和发病有家族性，而亲子间的感染机率大于夫妻。普遍认为，不同的疾病过程与HBV本身无关而决定于个体的免疫反应状况〔1,2〕。由于组织相容性复合体是控制免疫应答的主要基因，因此我们推测，本病可能和MHC的基因产物有关。国外已在这方面做了一些研究，但多集中于自身免疫性肝炎，对传染性肝炎报道不多。在国内，除早期曾有某些血清学研究外，尚未见对本病有较精确的分型研究。
我们对54名慢性乙肝患者进行HLA-DRB1基因分型，与正常对照组比较后，发现HLA-DRB1*10与本病有较强的关联，报道如下。
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材料与方法
1.病人：在我国北方地区随机选择54名病人，女25人，男29人，年龄最大65岁，最小17岁，平均41岁。根据我国通行标准诊断为慢性乙型肝炎。对照组为同地区92名健康人。
2.方法： 用盐析法提取DNA〔3〕。采用医科院基础所DR分型试剂盒。用PCR/SSP方法分型，共14对引物可分别鉴定HLA-DRB1*1～10的宽特异性。扩增产物在含溴乙锭的2%琼脂糖凝胶中电泳后，在紫外照射仪下判读。
3.统计分析：用疾病和HLA抗原相关分析软件(上海第二医科大学)进行数据处理。主要算出相对风险(RR)值及校正P值(Pc)。
结果与讨论
乙肝患者和对照组的HLA-DRB1基因频率、RR值及显著性分析见表1。分析发现，乙肝患者的HLA-DRB1*10显著增高(病人25.9%,对照组3.3%,RR=10.38, Pc=0.001)。未发现显著性的保护基因。
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表1 乙肝患者与健康人HLA-DRB1基因的分布
Table 1. Distribution of HLA-DRB1 alleles in HB patients and controls HLA-
DRB1
allele
Frequencies(%)
in patients
(n=54)
Frequencies(%)
in controls
(n=92)
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RR
Pc
DR1
3.7
7.6
0.47
ns
DR15
24.0
38.0
0.52
ns
DR16
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3.7
5.4
0.67
ns
DR3
1.8
5.4
0.33
ns
DR4
22.2
26.1
0.81
, 百拇医药
ns
DR11
9.2
14.1
0.62
ns
DR12
18.5
13.0
1.52
ns
DR13
1.9
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4.3
0.42
ns
DR14
13.0
12.0
1.09
ns
DR6
25.9
16.3
1.80
ns
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DR7
13.0
25.0
0.45
ns
DR8
7.4
8.7
0.84
ns
DR9
35.1
27.1
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1.45
ns
DR10
25.9
3.3
10.38
0.001
RR：Relative risk Pc：Corrected P values
国外有关乙肝和HLA关联研究的报道较少。在有限的工作中曾报道冈比亚人群中HLA-DRB1 *1302为保护基因〔1〕；卡塔尔人群中DR2为保护基因，DR7为易感基因〔4〕；还有报道乙肝严重程度与HLA-I类基因纯合细胞有关〔5〕。另一方面，报道较多的是免疫性肝炎和HLA的关系，发现患者组中DR3(白人)、DR4(日本)、DRB1*1301(阿根廷儿童)频率增高，也有报道扩展单倍型B8-SC01-DR3和B44-FC31-DR7与免疫性肝炎关联；而DR2、DR7、DQA1*0201、DQB1*0602等基因频率降低(均根据1996年第12届国际组织相容性会议材料)。由于与自身免疫性肝炎关联的HLA表型和基因型较分散，对探讨本病和HLA关联的本质和机理增加了困难，我们的研究发现乙肝与HLA-DRB1*10关联，在此前未见报道。
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DRB1*10为中国人少见的HLA基因型，正常人群中频率仅为3.3%〔6〕,在乙肝患者中却高达25.9%。未见此基因与其它疾病关联的报道。我们手头的材料是在中国人类风湿关节炎中，DRB1*1001为仅次于DRB1*0405的关联基因(个人材料未发表)。因此，本研究结果提供了有意义的线索。
自身免疫反应是引起慢性活动性肝炎的重要机制之一。近年来，HLA与自身免疫病关联的研究随HLA分子三维结构的阐明而取得了重大进展，现认为，HLA与疾病的关联可能源于HLA分子本身〔7，8〕。由于受类风湿关节炎(其易感性涉及DRβ链第67,70,71位氨基酸)和胰岛素依赖型糖尿病(与DQα链第52位精氨酸以及DQβ链第57位非天门冬氨酸相关)的易感性的启发，与HLA分子的肽链结构有关，据此对HLA-DR分子的一级结构进行比较分析(表2)，结果提示，40位苯丙氨酸可能是乙肝的一个保护基因，而第70位精氨酸则与易感性有关。DR分子肽链第40位和第70位氨基酸参与构成HLA的抗原结合槽(α螺旋和β底层)。因此我们认为，HLA-DR分子第40位酪氨酸和第70位精氨酸是与乙型肝炎易感性相关的结构特征。此假说是否正确有待进一步研究。
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表2 DRB1*10在β链第40和70位的氨基酸残基
Table 2. Amino acid residues of DRB1*10 in position 40 and 70 of β chain
RR
40
70
Pos
DR9
1.45
Phe
Arg
DR10
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10.3
Tyr
Arg
DR12
1.52
Phe
Asp
Neg
DR1
0.47
Phe
Gln
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0.33
Phe
Gln
DR7
0.45
Phe
Asp
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0.42
Phe
Asp
DR15
0.52
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Phe
Gln
Pos:Increased alleles in patients;Neg:Decreased alleles in patients;RR:Relative risk;Tyr:Tyrosine; Arg:Arginine; Phe: Phenylalanine; Gln: Glutamine; Asp:Aspartic acid
志谢：本研究得到中国医学科学院基础医学研究所邱长春教授支持，表示感谢。 参考文献
[1]Mark R Thursz, M.R.C.P., Dominic Kwiatkowski, et al. Association between an MHC class II allele and clearance of hepatitis B virus in the Gambia. New Engl J Med, 1995,332∶ 1065-1068.
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[2]Czaja AJ, Carpenter HA, Santrach PJ, et al. Significance of human leukocyte antigens DR3 and DR4 in chronic viral hepatitis. Dig Dis Sci， 1995，40(10)∶2098-2106.
[3]Miller SA, Dyke DD, Polesk HF, et al. A simple salting-out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res, 1988,16∶1215-1215.
[4]Ajaybe Almarri, J Richard Batchelor. HLA and hepatitis B infection. Lancet，1994，344∶1194-1195.
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[5]Pollicino T, Pernice F, Campo S, et al. Severe outcome of hepatitis B virus (HBV) infection and lack of HBV e antigen-defective virus emergence in patients homozygous for HLA class I alleles. J Gen Virol， 1996，77∶1833-1836.
[6]Gao X, Sun Y, An J, et al. DNA typing for HLA-DR, and-DP alleles in Chinese population using the polymerase chain reaction (PCR) and oligonucleotide probes. Tissue Antigens， 1991,38∶24-30.
[7]Dominique Charron. HLA class Ⅱ disease associations: molecular basis. Journal of Autoimmunity, 1992,5∶45-53.
[8]Erik Thorsby. HLA-associated disease susceptibility-which genes are primarily involved? The Immunologist,1995,3(2)∶51-58.
(收稿：1997-07-07 修回：1998-03-26), 百拇医药