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编号:10240103
mRNA差异显示
http://www.100md.com 《军医进修学院学报》 1999年第1期
     作者:李忆农 黄烽

    单位:解放军总医院风湿科,北京 100853

    关键词:RNA;信使;基因表达

    军医进修学院学报990129 中国图书资料分类法分类号 R 394

    差异基因的分离,对细胞生命过程中调节机制的研究以及致病机制的探讨极有价值。分离差异基因的方法多种多样,但根据所分差异基因性质的不同,可粗略分成两大类:①差异基因的分离,常用方法主要有消减杂交法〔1〕及其改进〔2,3〕,随机引物多态性DNA聚合酶链反应(AP-PCR)〔4〕等。②差异表达基因的分离,常用方法有两种:①RNA任意引物PCR指纹分析(RAP)〔5〕,②mRNA差异显示(mRNA dd)〔6〕。此外,用于差异表达基因分离的还有AFLP介导的RNA指纹图〔7〕及双相电泳cDNA指纹分析〔8〕。本文主要对mRNA DD作一简单介绍。
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    1 mRNA DD的基本原理

    mRNA DD是由Liang和Pardee〔6〕于 1992 年最先建立的,这一方法的根据是,所有mRNA3端均有polyA结构,而且其3末端与polyA相邻的两个碱基只有 12 种组合(即GG GC GT GA CC CG CA CT TT TG TC TA)。因而设计寡聚dT与polyA配对,并外加两个针对相邻的 12 组碱基的配对碱基,后者被称作锚碱基(AA AG AT AC GG GC GT GA CC CA CT CG),这样共需 12 组引物,每组引物锚定总mRNA的 1/12,故这种引物又称为锚引物。锚引物与mRNA 3端锚定后,在逆转录酶作用下,逆转录合成cDNA的第一链;而后加入任意引物,经变性后,以cDNA第一链为模板,经过低温复性,造成任意引物与cDNA第一链错配,而后在Tag酶作用下,进行cDNA第二链的合成。最后在上述两种引物的共同引导下,进行PCR扩增。因不同mRNA扩增产物大小不同,经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,通过自显影或荧光显色检测,可得到mRNA的指纹图谱。两种以上细胞的指纹图经比较即可得到差异表达的mRNA带,可进一步扩增、筛选、克隆和鉴定。
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    2 基本方法

    2.1 引物的选择 由上所述,mRNA DD需要两种引物,第一种为锚引物,第二种为随机引物。1992 年Liang最初创立此方法时发现〔6〕用9b以下的引物,mRNA DD结果无多态性,主要原因可能是太短的引物其融点温度太低(<40°C),不能与模板形成有效的结合,故随机引物与锚引物均应不低于10b。Liang用总长13b的12 种锚引物与 20 个 10b 的随机引物可扩增出较多的带。但工作量较大,每个样品需要 12 个反应体系。随后,Liang进一步比较发现〔9〕,引物3端倒数第二个碱基,即与寡聚dT直接相连的那个碱基无区别作用,遂将锚引物从 12 个减为 4 个,即T12MA、T12MT、T12MC、T12MG,M为ACG的混合。1994 年日本学者Takashi也证实这一点〔10〕。同年Liang再次将锚引物的锚碱基数减少为 1 个,并将5-TGCCG加在锚引物和随机引物的5端,使其长度分别达21b和 18b,发现 1 个锚碱基的长引物比 2 个锚碱基的短引物有更好的起始特异性〔11〕。同一年,Ayala也发现较长的引物和较高的复性温度可以提高mRNA DD的特异性,并可增加重复性,于是将锚引物再延长 10 个碱基,达 28b,并嵌合入 1 个EcoR Ⅰ酶切位点,不仅提高了重复性,而且为PCR产物的亚克隆提供了方便,并认为只要锚引物GC含量达到 50%~60%,其它酶切位点也可以嵌入,且上下游引物的解链温度可接近 60°C〔12〕。1996 年Luda〔13〕联合了以上经验,建立起新的引物策略,即以长的 25b随机引物,9 种 2 个锚碱基的 29b 的锚引物,同时使用高浓度(50 mmol/L)的dNTP,并以抗Tag酶抗体介导的热启动PCR,其中Tag酶为长和精确度高的两种温稳DNA聚合酶混合使用〔14〕,取得了更好的差异显示结果。
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    2.2 RNA提取mRNA DD中对RNA提取过程无特殊要求,多种方法得到的RNA,包括总RNA或纯化的mRNA,均可用于mRNA DD,目前使用较普遍的有酸性胍-酚-氯仿法〔10〕,热酚法〔15〕等,使用市售RNA kit或RNAzol试剂更为方便。

    清除DNA污染很重要,可先用LiCl洗涤,而后用无RNase的DNase处理〔10〕,也可以在RNA提取过程中直接加入10U DNase Ⅰ〔9〕或提取后以Message-Clean TmKit处理〔15〕

    2.3 逆转录和cDNA扩增 逆转录条件与引物种类有关,如以FITC标记的3-引物,则总RNA量不少于 2.5ng,如果以dT11VN(V:C、G、A;N:T、C、G、A)引物则总RNA量只需 0.1~0.2ng〔7~9〕。引物终浓度一般为 0.4pmol/L〔12〕,逆转录后,在Tag酶催化下合成cDNA第二链,反应条件一般为 94°C变性 5min,40°C不严格复性 5min,72°C延长 5min,随后在严格条件下进行 30~40 个PCR循环,条件为 94°C 30~60s,42~60°C60s,72°C30s~120s,最后 72°C延伸 5min。
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    2.4 筛选和再扩增 上述PCR产物 2~4μl经 4.5%~6%聚丙烯酰胺-7mol/L尿素变性凝胶电泳〔10〕而分离,但也有用不变性凝胶电泳的〔16〕,认为后者可避免DNA因变性程度不同而产生几条带,可使复杂性降低。电泳后经自显影或荧光显影,找出差异带,切下后转入Eppendoff管中,以过去的条件加入引物、dNTPs,再扩增 20~30 个循环。

    2.5 鉴定 筛选出的差异带是否是真正的差异,即是否来源于其中某一个样品,而不出现于另一个样品,其序列是什么等,必须经过鉴定予以明确。目前通常是先克隆进入载体,而后制成探针,进行Northern杂交和测序,也可以直接测序〔10〕。Ayala〔12〕在第二次PCR中加入[α-32P]dCTP 925 kBq〔6〕,而后用 2% 低融点胶电泳纯化,直接用作Northern Blot的探针,使步骤更简便。5端带酶切位点的引物所进行的mRNA DD,此时可直接克隆入载体,也可以进一步扩增,测序。如证实为新基因,可以通过基因库调出全序列,了解其性质,还可以表达出产物,免疫动物,制成抗体进行免疫组化,也可以原位杂交了解组织或细胞内分布,以进一步探讨其功能和意义。
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    3 mRNA DD的应用

    mRNA DD是一种极其有效的研究基因行为差异的方法,该方法简单,快速,具有重复性好,灵敏度高,多能等特点,在分离与分化、发育、细胞周期调节、癌变及疾病相关的基因方面得到了广泛应用。

    3.1 细胞因子或各种药物的活性作用机制研究 比较同一种组织或细胞在用和不用某种细胞因子或药物处理时其表达的差异,研究该细胞因子或药物对细胞行为的影响,为神经递质、炎性介质、细胞活性物质及某些药物的性质及其作用机制的研究提供了强有力的手段。

    3.2 同一细胞或组织在不同生命时期表达差异的比较 是研究细胞周期、发育、分化、凋亡的调节机制的十分简便可行的方法。

    3.3 病理条件下机体调节过程的研究 通过各种环境因子的设置,观察组织或细胞在这些环境因子作用下表达的差异,如缺血、缺氧、氧化应激、防御反应、病毒或细菌感染、噪音、放射线等,为防治方法研究提供指导和理论依据。
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    3.4 疾病相关基因的研究 其中研究得最多的是肿瘤,如浸润相关基因、癌基因、抑癌基因、肿瘤时过高或过低表达的正常基因。其次为自身免疫性疾病、糖尿病及心肺等疾病的相关基因。

    4 结语

    总之,mRNA DD在分离、筛选和鉴定差异表达的基因方面具有广泛的应用前景,对生命过程中细胞发育和分化、细胞周期调节、细胞衰老和死亡及细胞在病理条件下的变化的调节机制的探索极有意义。有理由相信,随着本技术的完善和普及,人们将利用该技术揭示更多的生命现象和本质。

    参考文献

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    (1998—10—14收稿,1998—11—29修回), 百拇医药