牙龈卟啉菌内毒素诱导人牙周纤维细胞释放细胞因子的实验研究*
作者：李颖超 马良 谢玮 布静秋 郝秀华 颜光涛
单位：李颖超 马良 谢玮 布静秋：解放军总医院口腔科，北京 100853；郝秀华 颜光涛：解放军总医院生物化学研究室
关键词：细胞因子；脂多糖；牙周纤维细胞
牙龈卟啉菌内毒素诱导人牙周纤维细胞释放 细胞因子的实验研究 摘要 目的：研究牙龈卟啉菌内毒素诱导人牙周纤维细胞释放白细胞介素 6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF)的影响。方法：放射免疫检测法。结果：表明人牙周纤维细胞在牙龈卟啉菌内毒素作用下释放IL-6，而不能释放TNF。结论：人牙周纤维细胞释放IL-6的量与内毒素的浓度和作用的时间有关。
中国图书资料分类法分类号 R 781.4
Cytokine production ofhuman periodontal ligament cells stimulated
, 百拇医药
by porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide
Li Yingchao,ma liang, Xie Wei, Bu Jingqiu,hao Xiuhua, Yan Guangtao
(Department of Stomatology, Generalhospital of PLA, Beijing 100853)
Abstract Objective：To reseach the function ofhuman preiodontal ligament cell productions interleukin-6 (IL-6) and tumor necrosis factor (TNF) in response to porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide (P.G-LPS).Methods: IL-6 and TNF wasmeasured by radioimmunoassay.Results：IL-6 was released fromhuman preiodontal ligament cells stimulated by P.g-LPS, but TNF was not produced.Conclusion:The amount of IL-6 is related with the concentration of P.g-LPS in cell culturemedium and the time of action.
, 百拇医药
Key words cytokine; endotoxins; preiodontal fibroblast cells
白细胞介素6(IL-6)是一种多功能的细胞因子，参与组织的炎性反应，研究表明IL-6由淋巴细胞以及非淋巴细胞所分泌，并与骨组织吸收相关联。肿瘤坏死因子(TNF)其诱导骨吸收活性较强，可能参与牙周病的牙槽骨的破坏和吸收〔1〕。本实验的目的是研究人牙周纤维细胞在牙龈卟啉菌内毒素的作用下能否分泌IL-6和TNF并测定其含量。
1 材料和方法
1.1 牙龈卟啉菌内毒素的制备 牙龈卟啉菌 47A-1株由北京口腔医院厌氧菌研究室惠赠。收集细菌，蒸馏水洗涤 3 次，用酚-水法提取内毒素，冷冻干燥后冻存备用。
1.2 人牙周纤维细胞的培养 选取健康的青少年因正畸而拔除的前磨牙，经含青霉素、链霉素的DMEM培养液冲洗、浸泡后，于超净工作台内，刮取牙根中 1/3 处之牙周膜组织、切碎，平铺于 25ml的培养瓶(Costar)中，加少许含有青霉素 100μg/ml、链霉素 100μg/ml、10% 小牛血清的DMEM培养液覆盖组织块，置培养瓶于恒温 37°C，5%CO2孵箱中培养，待人牙周纤维细胞长满瓶底后，用 0.25%胰蛋白酶(Gibco)消化，移至另一培养瓶中。5～10 代人牙周纤维细胞用于实验。将 5×105细胞/ml的细胞悬液移植 24 孔培养板中，每孔 0.5ml培养 24h，待细胞贴壁后，吸出原培养液，用有内毒素的或无内毒素的含 2% 小牛血清的DMEM培养至实验结束。
, http://www.100md.com
实验组培养液内牙龈卟啉菌内毒素的浓度为 1μg/ml和 10μg/ml两组，对照组为不含牙龈卟啉内毒素。在培养 4h、8h、12h、1d、2d、3d、4 和 5d时，吸出培养上清液，离心冻存于-20°C冰箱中，备作 IL-6 和 TNF检测。
1.3 检测方法 IL-6 和TNF 均采用放射免疫法检测，TNF放免药盒由东亚免疫研究所提供，IL-6 放免药盒由我院生化研究室提供，具体操做方法按试剂说明。
2 结果
人牙周纤维细胞在受到牙龈卟啉菌内毒素的刺激后可释放IL-6，并随着内毒素刺激时间的延长，人牙周纤维细胞释放IL-6 的含量也随之增加(表 1)。细胞培养上清液中内毒素浓度为 10μg/ml在 8h IL-6 含量明显高于对照组，P<0.05；内毒素浓度为 1μg/ml刺激人牙周纤维细胞 1d后释放的 IL-6明显高于对照组(P<0.05)。在 2d、3d、4 和 5d实验组中，内毒素浓度为 10μg/ml刺激人牙周纤维细胞释放的 IL-6明显高于内毒素浓度为 1μg/ml的含量(表 2)。
, 百拇医药
表 1 牙龈卟啉菌内毒素诱导人牙周纤维细胞释放
的IL-6(n=4,
±s,ρ/ng.ml-1)
时间
对照
内 毒 素 浓 度
10μg/ml
1μg/ml
4h
2.49±0.49
, 百拇医药
2.35±0.54
2.34±0.60
8h
2.86±0.44
4.13±0.69*
3.22±1.14
10h
2.71±0.48
4.45±0.63*
4.15±1.20
12h
, http://www.100md.com 2.94±0.49
5.05±1.07*
5.06±1.49
1d
3.34±0.53
5.45±1.12*
4.26±0.37*
2d
2.98±0.67
8.72±1.21**
4.55±0.26*
, http://www.100md.com
3d
2.52±0.07
10.04±0.74**
6.02±0.10**
4d
2.71±0.33
14.48±5.56**
5.4±0.26**
5d
2.65±0.28
11.32±1.62**
, http://www.100md.com
6.89±0.23**
*P<0.05 **P<0.05 表 2 不同浓度内毒素诱导人牙周纤维细胞释放IL-6(n=4,±s,ρ/ng.ml-1)
内毒素浓度
时间
1d
2d
3d
4d
5d
, 百拇医药
10μg/ml
5.45±1.12
8.72±1.21*
10.04±0.74**
14.48±5.56**
11.32±1.62**
1μg/ml
4.26±0.38
4.55±0.26
6.02±0.10
5.4±0.27
, 百拇医药
6.89±0.24
*P<0.05 **P<0.01
细胞培养液中有、无牙龈卟啉菌内毒素，各培养时间内上清液中均未检测出TNF。
3 讨论
牙周卟啉菌是牙周袋内一种检出率较高的革兰阴性厌氧菌，被认为是引起牙周病的先决条件，因此牙龈卟啉菌已成为牙周病微生物学中重点研究的厌氧菌之一，而内毒素又是其主要致病因素，对牙周组织具有很强的毒性，破坏牙周组织，还可导致牙槽骨组织的吸收，被认为是牙周炎症的重要病因之一，在牙周病的发生、发展过程中起重要作用〔1〕。
IL-6 是一个多肽的蛋白质，具有多种功能的细胞因子，尤以参与组织的炎性反应和免疫反应方面引起人们的重视，其主要由淋巴细胞、单核细胞分泌，并且IL-6 还可导致骨质吸收。最近发现正常人的牙龈纤维细胞，牙周纤维细胞均可分泌IL-6〔2～4〕。本实验结果说明正常人的牙周纤维细胞在牙龈卟啉菌内毒素的刺激下可产生IL-6，而不能产生TNF。Yasuk认为人牙周纤维细胞在牙龈卟啉菌内毒素刺激下释放IL-6 及其mRNA的表达〔2〕。
, 百拇医药
正常人的牙周纤维细胞在牙龈卟啉菌内毒素的刺激下，释放IL-6 的量与刺激时间、内毒素的剂量有关。内毒素浓度高对细胞的毒性大，能明显地刺激人牙周纤维细胞释放IL-6，培养液中内毒素浓度为 10μg/ml在 8h牙周纤维细胞分泌的 IL-6 就有明显的增加，而浓度为 1μg/ml则需要 1d的时间，随着培养时间的延长，培养上清液中IL-6 含量也逐渐增多。虽然内毒素浓度为 10μg/ml在 5d时的上清液 IL-6 含量较 4d时低，但仍明显高于对照组，这可能是由于内毒素剂量大，长时间培养，毒性作用使细胞出现凋亡，随之合成分泌功能下降。
对照组与实验组中内毒素浓度及实验时间，培养上清液中均未检测出TNF，说明人牙周纤维细胞在牙龈卟啉菌内毒素的作用下不能合成分泌TNF。Yasuk也报道了人牙周纤维细胞在内毒素的刺激下无TNF-mRNA的表达〔2〕。因此IL-6 可能在牙周炎症初期起有重要作用。
*“九五”军队医药卫生科研基金资助项目，批准号 96Q114
, 百拇医药
参考文献
[1]李德懿 著.牙周微生物学.天津：天津科技翻译出版公司，1994.63，114
[2]Yasuko Yamaji, Takao Kubota, Konichi Sasaguri et al.Inflammatory cytokine gene expression inhuman preiodontal ligament fibroblasts stimulated with bacteaial lipopolysaccharides.Indect Immu, 1995，63(9)∶3576
[3]Naomi Ogura, Yasuko Shibata, Yoshikazu Kamino et al.Stimulation of interleukin-6 production of periodontal ligament cells by porphromonas endidintalis lipopolysaccharides.Biochemmedmet Bio, 1994，53(2)∶130
[4]Bartold PM,haynesdR.Interleukin-6 production byhuman gingival fibroblasts.J Preiodont Res, 1991，26(4)∶339
(1998—10—08收稿，1998—11—23修回), 百拇医药
单位：李颖超 马良 谢玮 布静秋：解放军总医院口腔科，北京 100853；郝秀华 颜光涛：解放军总医院生物化学研究室
关键词：细胞因子；脂多糖；牙周纤维细胞
牙龈卟啉菌内毒素诱导人牙周纤维细胞释放 细胞因子的实验研究 摘要 目的：研究牙龈卟啉菌内毒素诱导人牙周纤维细胞释放白细胞介素 6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF)的影响。方法：放射免疫检测法。结果：表明人牙周纤维细胞在牙龈卟啉菌内毒素作用下释放IL-6，而不能释放TNF。结论：人牙周纤维细胞释放IL-6的量与内毒素的浓度和作用的时间有关。
中国图书资料分类法分类号 R 781.4
Cytokine production ofhuman periodontal ligament cells stimulated
, 百拇医药
by porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide
Li Yingchao,ma liang, Xie Wei, Bu Jingqiu,hao Xiuhua, Yan Guangtao
(Department of Stomatology, Generalhospital of PLA, Beijing 100853)
Abstract Objective：To reseach the function ofhuman preiodontal ligament cell productions interleukin-6 (IL-6) and tumor necrosis factor (TNF) in response to porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide (P.G-LPS).Methods: IL-6 and TNF wasmeasured by radioimmunoassay.Results：IL-6 was released fromhuman preiodontal ligament cells stimulated by P.g-LPS, but TNF was not produced.Conclusion:The amount of IL-6 is related with the concentration of P.g-LPS in cell culturemedium and the time of action.
, 百拇医药
Key words cytokine; endotoxins; preiodontal fibroblast cells
白细胞介素6(IL-6)是一种多功能的细胞因子，参与组织的炎性反应，研究表明IL-6由淋巴细胞以及非淋巴细胞所分泌，并与骨组织吸收相关联。肿瘤坏死因子(TNF)其诱导骨吸收活性较强，可能参与牙周病的牙槽骨的破坏和吸收〔1〕。本实验的目的是研究人牙周纤维细胞在牙龈卟啉菌内毒素的作用下能否分泌IL-6和TNF并测定其含量。
1 材料和方法
1.1 牙龈卟啉菌内毒素的制备 牙龈卟啉菌 47A-1株由北京口腔医院厌氧菌研究室惠赠。收集细菌，蒸馏水洗涤 3 次，用酚-水法提取内毒素，冷冻干燥后冻存备用。
1.2 人牙周纤维细胞的培养 选取健康的青少年因正畸而拔除的前磨牙，经含青霉素、链霉素的DMEM培养液冲洗、浸泡后，于超净工作台内，刮取牙根中 1/3 处之牙周膜组织、切碎，平铺于 25ml的培养瓶(Costar)中，加少许含有青霉素 100μg/ml、链霉素 100μg/ml、10% 小牛血清的DMEM培养液覆盖组织块，置培养瓶于恒温 37°C，5%CO2孵箱中培养，待人牙周纤维细胞长满瓶底后，用 0.25%胰蛋白酶(Gibco)消化，移至另一培养瓶中。5～10 代人牙周纤维细胞用于实验。将 5×105细胞/ml的细胞悬液移植 24 孔培养板中，每孔 0.5ml培养 24h，待细胞贴壁后，吸出原培养液，用有内毒素的或无内毒素的含 2% 小牛血清的DMEM培养至实验结束。
, http://www.100md.com
实验组培养液内牙龈卟啉菌内毒素的浓度为 1μg/ml和 10μg/ml两组，对照组为不含牙龈卟啉内毒素。在培养 4h、8h、12h、1d、2d、3d、4 和 5d时，吸出培养上清液，离心冻存于-20°C冰箱中，备作 IL-6 和 TNF检测。
1.3 检测方法 IL-6 和TNF 均采用放射免疫法检测，TNF放免药盒由东亚免疫研究所提供，IL-6 放免药盒由我院生化研究室提供，具体操做方法按试剂说明。
2 结果
人牙周纤维细胞在受到牙龈卟啉菌内毒素的刺激后可释放IL-6，并随着内毒素刺激时间的延长，人牙周纤维细胞释放IL-6 的含量也随之增加(表 1)。细胞培养上清液中内毒素浓度为 10μg/ml在 8h IL-6 含量明显高于对照组，P<0.05；内毒素浓度为 1μg/ml刺激人牙周纤维细胞 1d后释放的 IL-6明显高于对照组(P<0.05)。在 2d、3d、4 和 5d实验组中，内毒素浓度为 10μg/ml刺激人牙周纤维细胞释放的 IL-6明显高于内毒素浓度为 1μg/ml的含量(表 2)。
, 百拇医药
表 1 牙龈卟啉菌内毒素诱导人牙周纤维细胞释放
的IL-6(n=4,
±s,ρ/ng.ml-1)时间
对照
内 毒 素 浓 度
10μg/ml
1μg/ml
4h
2.49±0.49
, 百拇医药
2.35±0.54
2.34±0.60
8h
2.86±0.44
4.13±0.69*
3.22±1.14
10h
2.71±0.48
4.45±0.63*
4.15±1.20
12h
, http://www.100md.com 2.94±0.49
5.05±1.07*
5.06±1.49
1d
3.34±0.53
5.45±1.12*
4.26±0.37*
2d
2.98±0.67
8.72±1.21**
4.55±0.26*
, http://www.100md.com
3d
2.52±0.07
10.04±0.74**
6.02±0.10**
4d
2.71±0.33
14.48±5.56**
5.4±0.26**
5d
2.65±0.28
11.32±1.62**
, http://www.100md.com
6.89±0.23**
*P<0.05 **P<0.05 表 2 不同浓度内毒素诱导人牙周纤维细胞释放IL-6(n=4,
±s,ρ/ng.ml-1)内毒素浓度
时间
1d
2d
3d
4d
5d
, 百拇医药
10μg/ml
5.45±1.12
8.72±1.21*
10.04±0.74**
14.48±5.56**
11.32±1.62**
1μg/ml
4.26±0.38
4.55±0.26
6.02±0.10
5.4±0.27
, 百拇医药
6.89±0.24
*P<0.05 **P<0.01
细胞培养液中有、无牙龈卟啉菌内毒素，各培养时间内上清液中均未检测出TNF。
3 讨论
牙周卟啉菌是牙周袋内一种检出率较高的革兰阴性厌氧菌，被认为是引起牙周病的先决条件，因此牙龈卟啉菌已成为牙周病微生物学中重点研究的厌氧菌之一，而内毒素又是其主要致病因素，对牙周组织具有很强的毒性，破坏牙周组织，还可导致牙槽骨组织的吸收，被认为是牙周炎症的重要病因之一，在牙周病的发生、发展过程中起重要作用〔1〕。
IL-6 是一个多肽的蛋白质，具有多种功能的细胞因子，尤以参与组织的炎性反应和免疫反应方面引起人们的重视，其主要由淋巴细胞、单核细胞分泌，并且IL-6 还可导致骨质吸收。最近发现正常人的牙龈纤维细胞，牙周纤维细胞均可分泌IL-6〔2～4〕。本实验结果说明正常人的牙周纤维细胞在牙龈卟啉菌内毒素的刺激下可产生IL-6，而不能产生TNF。Yasuk认为人牙周纤维细胞在牙龈卟啉菌内毒素刺激下释放IL-6 及其mRNA的表达〔2〕。
, 百拇医药
正常人的牙周纤维细胞在牙龈卟啉菌内毒素的刺激下，释放IL-6 的量与刺激时间、内毒素的剂量有关。内毒素浓度高对细胞的毒性大，能明显地刺激人牙周纤维细胞释放IL-6，培养液中内毒素浓度为 10μg/ml在 8h牙周纤维细胞分泌的 IL-6 就有明显的增加，而浓度为 1μg/ml则需要 1d的时间，随着培养时间的延长，培养上清液中IL-6 含量也逐渐增多。虽然内毒素浓度为 10μg/ml在 5d时的上清液 IL-6 含量较 4d时低，但仍明显高于对照组，这可能是由于内毒素剂量大，长时间培养，毒性作用使细胞出现凋亡，随之合成分泌功能下降。
对照组与实验组中内毒素浓度及实验时间，培养上清液中均未检测出TNF，说明人牙周纤维细胞在牙龈卟啉菌内毒素的作用下不能合成分泌TNF。Yasuk也报道了人牙周纤维细胞在内毒素的刺激下无TNF-mRNA的表达〔2〕。因此IL-6 可能在牙周炎症初期起有重要作用。
*“九五”军队医药卫生科研基金资助项目，批准号 96Q114
, 百拇医药
参考文献
[1]李德懿 著.牙周微生物学.天津：天津科技翻译出版公司，1994.63，114
[2]Yasuko Yamaji, Takao Kubota, Konichi Sasaguri et al.Inflammatory cytokine gene expression inhuman preiodontal ligament fibroblasts stimulated with bacteaial lipopolysaccharides.Indect Immu, 1995，63(9)∶3576
[3]Naomi Ogura, Yasuko Shibata, Yoshikazu Kamino et al.Stimulation of interleukin-6 production of periodontal ligament cells by porphromonas endidintalis lipopolysaccharides.Biochemmedmet Bio, 1994，53(2)∶130
[4]Bartold PM,haynesdR.Interleukin-6 production byhuman gingival fibroblasts.J Preiodont Res, 1991，26(4)∶339
(1998—10—08收稿，1998—11—23修回), 百拇医药