小鼠釉原蛋白成熟肽编码区cDNA的克隆和部分序列分析*
作者：郝建军 江卫民 费 俭 顾淑萍 麻孙恺 刘 正 郭礼和 史俊南
单位：刘 正 郝建军 第二医科大学第九人民医院，上海 200011；郭礼和 费 俭 麻孙恺 中科院上海细胞所基因工程组，上海 200031；江卫民 史俊南 第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)
关键词：釉原蛋白；cDNA；聚合酶链反应；小鼠
牙体牙髓牙周病学杂志CHINESE JOURNAL OF CONSERVATIVE DENTISTRY1999年 第9卷 第1期 Vol 摘要 目的：克隆小鼠釉原蛋白(AMG)成熟肽编码区基因。方法：用异硫氰酸胍一步法从昆明新生小鼠磨牙牙胚组织中抽提总RNA，用Oligo(dt)作引物逆转录合成牙胚cDNA，然后利用PCR方法，从cDNA中扩增出小鼠釉原蛋白成熟区的基因片段(约670 bp)，将所得基因片段插入pBS质粒载体，转化到大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆，提取重组质粒DNA，通过限制性酶切和部分核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果：重组质粒pBS-AMG的酶切图谱和序列分析结果与国外文献报道一致。结论：克隆到小鼠釉原蛋白成熟肽编码区基因。
, 百拇医药
中图号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1005-2593(1999)01-0045-02
[牙体牙髓牙周病学杂志，1999，9(1)：45]
Cloning and partially sequencing of mouse
amelogenin encoding mature protei
Hao Jianjun, Jiang Weimin, Fei Jian et al
School of Stomatology, The Shanghai Secondary Medical University, Shanghai 200011
Abstract Aim: Cloning and partially sequencing of mouse amelogenin encoding mature protein. Methods: In the study, total RNA was extracted from the tooth germs of newborn mouse by acid guanidinium thiocyanata-phenol-chloroform method, the desired DNA product was obtained from the total RNA by RT-PCR with the primers including Oligo(dt) and two gene specific primers. The segment (about 670 bp) was inserted into pBluescript vector， and the interesting plasmid was transformed into E. Coli host strain DH5α. The double-stranded DNA of the positive clone was analyzed by restriction endonuclease mapping and DNA sequencing. Results: The restriction endonuclease map and sequence of mouse amelogenin encoding mature protein were consistent with those of the references appeared. Conclusion: the mouse amelogenin cDNA encoding mature protein was obtained for further study.
, 百拇医药
Key Words amelogenin；cDNA；PCR；mice
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 1999,9(1):45]
成熟釉质中无机物占总重量的98%以上，是人体组织中矿化程度最高的组织。但发育中的釉质富含蛋白质和水，蛋白含量高达25%～30%。这些釉质基质蛋白中可分为两大类：釉原蛋白(amelogenin，AMG)和非釉原蛋白(non-amelogenin)。其中釉原蛋白占90%，是发育中釉质基质蛋白的主要成分，在釉质矿化和成熟中发挥着重要的作用[1]。本文采用逆转录PCR技术克隆小鼠釉原蛋白成熟肽编码区cDNA，为表达该蛋白和研究其生物学效应打下基础。
1 材料和方法
根据小鼠釉原蛋白的cDNA序列[1]，采用PC Gene 设计PCR扩增的两条引物。5'端引物碱基序列为：5' TGGTTGCACGGACTTCTCCC 3'；3'端的引物序列为5'TAGTGCTCTTAACACCTTCACTGCG3'。载体质粒pBS用 SmaI酶切消化，平端连接目的基因片段和酶切质粒载体，转化大肠杆菌DH5α，蓝白斑筛选阳性克隆pBS-AMG。
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小鼠磨牙牙胚总RNA的提取、逆转录PCR扩增、PCR产物的克隆、酶谱分析和核苷酸序列分析与郝建军等的报道相同[2]。
2 结果
2.1 总RNA
提取的新生小鼠牙胚总RNA电泳[2]，可见28S、18S和5S三条带，其中28S的带最亮，28S带亮度约为18S带的2倍，表明所获得的总RNA无明显的降解。
2.2 RT-PCR
牙胚组织总RNA经RT-PCR扩增后，可见大小约670bp的特异扩增产物(附图)。
2.3 pBS-AMG克隆的酶谱分析(附图
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附图 PCR扩增产物AMG和重组质粒pBS-AMG酶切图谱琼脂糖凝胶电泳
1.λDNA-PstI
2.阴性对照(未加重组质粒模板)
3.以重组质粒为模板的AMG PCR产物
4.重组质粒pBS-AMG经EcoRI和BamHI双酶切
5.pBS- AMG经Hind Ⅲ酶切
6.重组质粒pBS-AMG
7.载体质粒pBS
8.λDNA-Pst1
9.目的产物AMG
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10.阴性产物(未加模板)
重组质粒pBS-AMG经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后为两条带(附图，第4道)，670bp的釉原蛋白和2.96kbp的载体pBS。670bp的釉原蛋白与 PCR的目的产物电泳条带(3、9道)平齐，2.96kbp的pBS与空载体pBS(7道)平齐。重组质粒pBS-AMG经 HindⅢ酶切后的电泳图谱(5道)与预期的完全一致。
2.4 pBS-AMG克隆的序列分析
釉原蛋白成熟蛋白编码区基因测序结果，手动测序可读出的200多个碱基序列与报道的结果完全相同[1]。
3 讨论
釉原蛋白占成釉细胞分泌有机质的绝大部分。目前已克隆了人、鼠、牛和猪等的釉原蛋白基因，除牛为6个外显子外，其余已知物种的基因都是7个外显子编码[3]。翻译过程中选择性剪切是釉原蛋白基因的一大特点，人、鼠和猪等的基因几种转录本大多缺少第4外显子，而牛的主要转录本缺少部分第5外显子。釉原蛋白基因定位于性染色体，人、猿、部分猴、牛和猪等的基因分布于X和Y染色体上，而大鼠、小鼠和部分猴的基因仅定位于X染色体[1]。
, http://www.100md.com
釉质发育不全是累及乳牙和恒牙釉质形成的遗传性疾病，其中部分是性连锁遗传。有学者[4]发现X连锁的釉质发育不全家族中男性患者釉质蛋白基因部分缺失， 初步证实釉原蛋白基因与釉质发育不全之间的关系。
由于釉质蛋白占成釉细胞分泌有机质的绝大部分，在釉质矿化中能够结合钙离子，控制晶体生长速度和维持晶体生长，加之又是部分遗传性釉质发育不全疾病的重要候选基因，因此有关釉质蛋白基因的研究一直是国内外口腔生物学家关注的焦点。本组根据已报道的小鼠釉质蛋白cDNA序列设计PCR引物，通过逆转录PCR从新生的小鼠牙胚总RNA中扩增出了670bp大小的特异片段，经过克隆后，对重组的质粒进行酶切和部分序列分析，证实已克隆了小鼠釉原蛋白成熟肽编码区cDNA片段。目前正在原核系统中表达该cDNA片段，为获取有生物活性的釉原蛋白奠定基础。
(在实验过程中得到第四军医大学口腔医学院肖明振和吴补领教授的指导，特此致谢)。
, 百拇医药
* 国家自然科学基金资助项目 (39700160)；上海市博士后科研资助计划项目和中科院上海细胞生物学研究所开放实验室资助项目
参考文献
1 Sasaki S, Shimokawa H. The amelogenin gene. Int J Dev Biol, 1995，39: 127
2 郝建军, 麻孙恺, 费俭 等. 小鼠牙本质涎蛋白成熟肽编码区cDNA克隆与部分序列分析. 牙体牙髓牙周病学杂志, 1999，9(1)：39
3 Zeichner-David M, Deikwisch T, Fincham A et al. Control of ameloblast differentiation. Int J Dev Biol, 1995，39: 69
4 Lagerstrom M, Pettersson U, Landegren U. Molecular basis and consequences of a deletion in the amelogenin gene, analyzed by capture PCR. Genomics, 1993，17: 89
收稿日期：1998-11-23, 百拇医药
单位：刘 正 郝建军 第二医科大学第九人民医院，上海 200011；郭礼和 费 俭 麻孙恺 中科院上海细胞所基因工程组，上海 200031；江卫民 史俊南 第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)
关键词：釉原蛋白；cDNA；聚合酶链反应；小鼠
牙体牙髓牙周病学杂志CHINESE JOURNAL OF CONSERVATIVE DENTISTRY1999年 第9卷 第1期 Vol 摘要 目的：克隆小鼠釉原蛋白(AMG)成熟肽编码区基因。方法：用异硫氰酸胍一步法从昆明新生小鼠磨牙牙胚组织中抽提总RNA，用Oligo(dt)作引物逆转录合成牙胚cDNA，然后利用PCR方法，从cDNA中扩增出小鼠釉原蛋白成熟区的基因片段(约670 bp)，将所得基因片段插入pBS质粒载体，转化到大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆，提取重组质粒DNA，通过限制性酶切和部分核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果：重组质粒pBS-AMG的酶切图谱和序列分析结果与国外文献报道一致。结论：克隆到小鼠釉原蛋白成熟肽编码区基因。
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中图号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1005-2593(1999)01-0045-02
[牙体牙髓牙周病学杂志，1999，9(1)：45]
Cloning and partially sequencing of mouse
amelogenin encoding mature protei
Hao Jianjun, Jiang Weimin, Fei Jian et al
School of Stomatology, The Shanghai Secondary Medical University, Shanghai 200011
Abstract Aim: Cloning and partially sequencing of mouse amelogenin encoding mature protein. Methods: In the study, total RNA was extracted from the tooth germs of newborn mouse by acid guanidinium thiocyanata-phenol-chloroform method, the desired DNA product was obtained from the total RNA by RT-PCR with the primers including Oligo(dt) and two gene specific primers. The segment (about 670 bp) was inserted into pBluescript vector， and the interesting plasmid was transformed into E. Coli host strain DH5α. The double-stranded DNA of the positive clone was analyzed by restriction endonuclease mapping and DNA sequencing. Results: The restriction endonuclease map and sequence of mouse amelogenin encoding mature protein were consistent with those of the references appeared. Conclusion: the mouse amelogenin cDNA encoding mature protein was obtained for further study.
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Key Words amelogenin；cDNA；PCR；mice
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 1999,9(1):45]
成熟釉质中无机物占总重量的98%以上，是人体组织中矿化程度最高的组织。但发育中的釉质富含蛋白质和水，蛋白含量高达25%～30%。这些釉质基质蛋白中可分为两大类：釉原蛋白(amelogenin，AMG)和非釉原蛋白(non-amelogenin)。其中釉原蛋白占90%，是发育中釉质基质蛋白的主要成分，在釉质矿化和成熟中发挥着重要的作用[1]。本文采用逆转录PCR技术克隆小鼠釉原蛋白成熟肽编码区cDNA，为表达该蛋白和研究其生物学效应打下基础。
1 材料和方法
根据小鼠釉原蛋白的cDNA序列[1]，采用PC Gene 设计PCR扩增的两条引物。5'端引物碱基序列为：5' TGGTTGCACGGACTTCTCCC 3'；3'端的引物序列为5'TAGTGCTCTTAACACCTTCACTGCG3'。载体质粒pBS用 SmaI酶切消化，平端连接目的基因片段和酶切质粒载体，转化大肠杆菌DH5α，蓝白斑筛选阳性克隆pBS-AMG。
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小鼠磨牙牙胚总RNA的提取、逆转录PCR扩增、PCR产物的克隆、酶谱分析和核苷酸序列分析与郝建军等的报道相同[2]。
2 结果
2.1 总RNA
提取的新生小鼠牙胚总RNA电泳[2]，可见28S、18S和5S三条带，其中28S的带最亮，28S带亮度约为18S带的2倍，表明所获得的总RNA无明显的降解。
2.2 RT-PCR
牙胚组织总RNA经RT-PCR扩增后，可见大小约670bp的特异扩增产物(附图)。
2.3 pBS-AMG克隆的酶谱分析(附图
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附图 PCR扩增产物AMG和重组质粒pBS-AMG酶切图谱琼脂糖凝胶电泳
1.λDNA-PstI
2.阴性对照(未加重组质粒模板)
3.以重组质粒为模板的AMG PCR产物
4.重组质粒pBS-AMG经EcoRI和BamHI双酶切
5.pBS- AMG经Hind Ⅲ酶切
6.重组质粒pBS-AMG
7.载体质粒pBS
8.λDNA-Pst1
9.目的产物AMG
, http://www.100md.com
10.阴性产物(未加模板)
重组质粒pBS-AMG经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后为两条带(附图，第4道)，670bp的釉原蛋白和2.96kbp的载体pBS。670bp的釉原蛋白与 PCR的目的产物电泳条带(3、9道)平齐，2.96kbp的pBS与空载体pBS(7道)平齐。重组质粒pBS-AMG经 HindⅢ酶切后的电泳图谱(5道)与预期的完全一致。
2.4 pBS-AMG克隆的序列分析
釉原蛋白成熟蛋白编码区基因测序结果，手动测序可读出的200多个碱基序列与报道的结果完全相同[1]。
3 讨论
釉原蛋白占成釉细胞分泌有机质的绝大部分。目前已克隆了人、鼠、牛和猪等的釉原蛋白基因，除牛为6个外显子外，其余已知物种的基因都是7个外显子编码[3]。翻译过程中选择性剪切是釉原蛋白基因的一大特点，人、鼠和猪等的基因几种转录本大多缺少第4外显子，而牛的主要转录本缺少部分第5外显子。釉原蛋白基因定位于性染色体，人、猿、部分猴、牛和猪等的基因分布于X和Y染色体上，而大鼠、小鼠和部分猴的基因仅定位于X染色体[1]。
, http://www.100md.com
釉质发育不全是累及乳牙和恒牙釉质形成的遗传性疾病，其中部分是性连锁遗传。有学者[4]发现X连锁的釉质发育不全家族中男性患者釉质蛋白基因部分缺失， 初步证实釉原蛋白基因与釉质发育不全之间的关系。
由于釉质蛋白占成釉细胞分泌有机质的绝大部分，在釉质矿化中能够结合钙离子，控制晶体生长速度和维持晶体生长，加之又是部分遗传性釉质发育不全疾病的重要候选基因，因此有关釉质蛋白基因的研究一直是国内外口腔生物学家关注的焦点。本组根据已报道的小鼠釉质蛋白cDNA序列设计PCR引物，通过逆转录PCR从新生的小鼠牙胚总RNA中扩增出了670bp大小的特异片段，经过克隆后，对重组的质粒进行酶切和部分序列分析，证实已克隆了小鼠釉原蛋白成熟肽编码区cDNA片段。目前正在原核系统中表达该cDNA片段，为获取有生物活性的釉原蛋白奠定基础。
(在实验过程中得到第四军医大学口腔医学院肖明振和吴补领教授的指导，特此致谢)。
, 百拇医药
* 国家自然科学基金资助项目 (39700160)；上海市博士后科研资助计划项目和中科院上海细胞生物学研究所开放实验室资助项目
参考文献
1 Sasaki S, Shimokawa H. The amelogenin gene. Int J Dev Biol, 1995，39: 127
2 郝建军, 麻孙恺, 费俭 等. 小鼠牙本质涎蛋白成熟肽编码区cDNA克隆与部分序列分析. 牙体牙髓牙周病学杂志, 1999，9(1)：39
3 Zeichner-David M, Deikwisch T, Fincham A et al. Control of ameloblast differentiation. Int J Dev Biol, 1995，39: 69
4 Lagerstrom M, Pettersson U, Landegren U. Molecular basis and consequences of a deletion in the amelogenin gene, analyzed by capture PCR. Genomics, 1993，17: 89
收稿日期：1998-11-23, 百拇医药