翼状胬肉的细胞因子检测
作者：张俊华 金威尔 林颖 张国安
单位：张俊华 金威尔 林颖(350004 福州，福建省人民医院眼科)；张国安(中国人民解放军第四七六医院临床免疫研究室)
关键词：翼状胬肉；肿瘤坏死因子；血小板源生长因子
中华眼科杂志990105 【摘要】 目的 研究肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)、血小板源生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)在翼状胬肉发病机制中的作用。方法 采用放射免疫检测技术和细胞生物活性法，检测30例翼状胬肉患者组织的体外培养上清液中TNF-α和PDGF的含量。结果 翼状胬肉组的组织培养上清液中的TNF-α和PDGF含量均明显高于正常球结膜组(t=2.827，P<0.01；t=3.011,P<0.01)，进展期组与静止期组相比差异有显著性(t=2.374，P<0.05；t=2.712，P<0.05)。结论 翼状胬肉的发生、发展可能与TNF-α和PDGF的异常分泌有关。
, 百拇医药
Cytokine assays for pterygium
ZHANG Junhua*, JIN Wei'er, LIN Ying, et al.
*Department of Ophthalmology, Fujian Provincial People's Hospital, Fuzhou 350004
【Abstract】 Objective To study the roles of tumor necrosis factor (TNF-α) and platelet-derived growth factor (PDGF) in pathogenesis of pterygium. Methods Radioimmunoassay and bioactivity assay were used to measure the levels of TNF-α and PDGF in tissue culture supernatant of pterygium specimens obtained from 30 patients. Results The levels of TNF-α and PDGF in tissue culture supernatant of pterygium were significantly higher than that of normal conjunctival specimens (t=2.827, P<0.01；t=3.011,P<0.01), and there was a significant difference between progressive and quiescent cases (t=2.374, P<0.05;t=2.712,P<0.05). Conclusions The abnormal secretion of TNF-α and PDGF may be related to the pathogenesis of pterygium.
, 百拇医药
【Key words】 Pterygium Tumor necrosis factor Platelet-derived growth factor
翼状胬肉是眼科的常见病之一，但其发病机制尚不清楚。病理学研究表明，翼状胬肉的主要成分为大量增生的成纤维细胞，并由其导致相应的病变[1]。 近年来的研究表明，细胞因子在炎症反应及成纤维细胞增生方面起着重要的作用[2]。我们对翼状胬肉组织在体外培养分泌产生的肿瘤坏死因子(tumor necrosis fator,TNF-α)和血小板源生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)进行检测，探讨其在翼状胬肉发病机制中的作用。
资料与方法
一、对象
, http://www.100md.com 选择我院眼科门诊的初发型翼状胬肉患者30例(30只眼)。按病变局部有无充血、肥厚和浸润，将其分为2组：(1)进行期组19例(19只眼)，男12例，女7例；年龄34～61岁，平均42.7岁。(2)静止期组11例(11只眼)，男7例，女4例；年龄28～69岁，平均47.2岁。所有患者均无其他角、结膜疾患，确诊后均行翼状胬肉单纯切除术，同时剪除患眼角膜上缘上方约3 mm处的正常球结膜组织2 mm×5 mm，作为自身对照。
二、方法
1.翼状胬肉组织培养上清液的制备：翼状胬肉及正常球结膜组织取材后迅速放入含10%胎牛血清的RPMI1640(美国Gibco公司)培养液(1 ml)中， 将进行期翼状胬肉分为3组：(1)单纯培养液组。(2)加抗TNF-α抗体组：培养液中加入2 μg/ml的抗TNF-α抗体(美国Sigma公司)。(3)加抗 PDGF 抗体组：培养液中加入2 μg/ml的抗PDGF抗体(美国sigma公司)，置37℃孵育24小时，研磨匀浆后离心2 500 r/min，20分钟，收集上清液，于-30℃冰箱中保存待测TNF-α和/或PDGF含量。组织蛋白含量采用改良Lowry法测定。
, 百拇医药
2.TNF-α含量的测定：采用RIA法，试剂盒购自上海长征医学有限公司。
3.PDGF活性的测定：采用细胞生物活性法见文献[3]，以1%胎牛血清促进L 929细胞增殖活性的表达为PDGF的一个活性单位(U/ml)
4.统计学处理：每份标本平行测定3个孔，求其平均值(
±s)，各组间比较采用t检验。
结果
一、翼状胬肉与正常球结膜组织细胞因子体外分泌水平的比较
翼状胬肉和正常球结膜组织在体外培养后，其上清液中均能测到TNF-α和PDGF的活性，但翼状胬肉组均明显高于正常球结膜组(P<0.01)(表1)。
, 百拇医药
表1 30例翼状胬肉患者翼状胬肉和正常球结膜
组织中的细胞因子分泌表达 组别
眼数
TNF-α
(±s，×10-12g/mg蛋白)
PDGF
(±s，U/mg蛋白)
, http://www.100md.com
翼状胬肉
30
43.8±22.1
71.3±12.4
正常球结膜
30
9.4±3.6
8.9±4.7
t值
2.827
3.011
P值
<0.01
, http://www.100md.com
<0.01
二、不同时期的翼状胬肉组织细胞因子分泌水平的比较(表2)表2 30例翼状胬肉患者不同时期的翼状胬肉
组织中细胞因子分泌水平的比较 组别
眼数
TNF-α
(
±s，×10-12g/mg蛋白)
PDGF
(±s，U/mg蛋白)
, http://www.100md.com
进行期
19
56.6±23.8
84.2±9.7
静止期
11
29.2±14.3
35.1±8.5
t值
2.374
2.712
P值
<0.05
, http://www.100md.com
<0.05
进行期翼状胬肉组织中的TNF-α和PDGF体外分泌量均明显高于静止期翼状胬肉组织(P<0.05)。
三、特异性中和抗体对翼状胬肉组织体外分泌TNF-α和PDGF的影响
进行期翼状胬肉，单纯培养液组，培养后检测其上清液中TNF-α和PDGF的含量，结果见表2；加抗TNF-α抗体组，培养后检测其上清液中的PDGF活性为(47.6±7.8)U/ml蛋白，明显低于单纯培养液组的PDGF活性(t＝2.265，P<0.05)；加抗PDGF抗体组，培养后检测其上清液中的TNF-α含量为(30.9±13.3)×10-12g/mg蛋白，明显低于单纯培养液组的TNF-α含量(t＝2.196,P<0.05)。
讨论
一、翼状胬肉形成的原因
, 百拇医药
翼状胬肉的形成是多种因素参与的复杂病理过程。其原因为成纤维细胞、 内皮细胞、淋巴细胞、血小板及多种细胞因子相互作用导致大量增生的成纤维细胞和血管的增生与退变[4]。此外，该病与紫外线照射、风沙、粉尘、 花粉剌激及感染等有关，而这些因素均可导致球结膜的蛋白变性及细胞因子的分泌异常[5]。因此，国内外学者认为，免疫因素在翼状胬肉的发病中起重要作用。
二、细胞因子在翼状胬肉发病机制中的作用
TNF-α和PDGF是一组来源于淋巴细胞、单核巨噬细胞及血管内皮细胞的细胞因子，它们不仅一起构成炎性介质，而且还可以促进纤维母细胞的增殖[6]。本研究中，翼状胬肉组织培养上清液中的TNF-α含量和PDGF活性均明显高于正常球结膜组，且进行期与静止期组间差异有显著性(P<0.05)，表明TNF-α和PDGF 的表达异常可能与翼状胬肉的发生发展有关。有文献报道，翼状胬肉组织中有大量的新生血管、纤维母细胞和纤维增生，并可见大量的淋巴、浆细胞浸润和肥大细胞反应[7，8]，这不仅表明在翼状胬肉发病机制中免疫因素的存在，而且这些因素可导致TNF-α和PDGF的分泌表达增加[9]，促使纤维母细胞、胶原纤维的增生和炎性细胞的浸润，促进翼状胬肉的发展。
, 百拇医药
三、TNF-α和PDGF的相互调控作用
McAvoy等[10]报道，TNF-α和PDGF同属细胞因子网络中核心成员。本研究中，抗TNF-α抗 体对PDGF的产生及抗PDGF抗体对TNF-α的产生均具有负向调节作用，说明TNF-α和PDGF在细胞因子网络中具有相互的调节作用。因此，进一步研究如何对细胞因子的分泌进行有效的调控，对翼状胬肉的预防、治疗及防止其复发均具有重要的意义。
参考文献
[1] Hill JC, Maske R. Pathogenesis of pterygium. Eye,1989,3:218-226.
[2] Thoratoay SC. Interaction of immune and connective tissue cells the effect of lymphokines and monokines on fibroblast growth. J Leuko Biol,1990,47:312-316.
, http://www.100md.com
[3] Heldin CH, Westermark B, Wasteson A. Platelet-derived growth factor: isolation by a large-scale procedure and analysis of subunit composition.Biochem J, 1981,193:907-913.
[4] Kria L, Ohira A, Amemiya T. Immunohistochemical localization of basic fibroblast growth factor, platalet derived growth factor, transforming growth factor-β and tumor necrosis factor-α in the pterygium. Acta Histochem,1996,98:195-201.
[5] Coroneo MT. Pterygium as an early indictor of ultraviolet insolation:a hypothesis. Br J Ophthalmol,1993,77:734-739.
, 百拇医药
[6] Gospodaroicz D,Neufeld G,Schweigerer L. Fibroblast growth factor. Mol Cell Endocrinol,1986,46:187-204.
[7] Xu GX, Tong Y, Lin FS, et al. Pathological study of pterygium. Invest Ophthalmol Vis Sci,1995,36:1027-1031.
[8] 柳林，杨德旺，牟贤龙，等.翼状胬肉的免疫病理学研究. 中华眼科杂志,1993,29 :141-143.
[9] Kohase M, May LT, Tamm I, et al. A cytokine network in human diploid fibrolast interactions of β-interferons, tumor necrosis factor, platelet-derived growth factor and interleukin-1.Mol Cell Biol,1997,7 :273-281.
[10] McAvoy JW,Chamberlain CG. Growth factors in the eye. Prog Growth Factor Res, 1990,2:29-43.
(收稿：1998-06-22 修回：1998-09-28), 百拇医药
单位：张俊华 金威尔 林颖(350004 福州，福建省人民医院眼科)；张国安(中国人民解放军第四七六医院临床免疫研究室)
关键词：翼状胬肉；肿瘤坏死因子；血小板源生长因子
中华眼科杂志990105 【摘要】 目的 研究肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)、血小板源生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)在翼状胬肉发病机制中的作用。方法 采用放射免疫检测技术和细胞生物活性法，检测30例翼状胬肉患者组织的体外培养上清液中TNF-α和PDGF的含量。结果 翼状胬肉组的组织培养上清液中的TNF-α和PDGF含量均明显高于正常球结膜组(t=2.827，P<0.01；t=3.011,P<0.01)，进展期组与静止期组相比差异有显著性(t=2.374，P<0.05；t=2.712，P<0.05)。结论 翼状胬肉的发生、发展可能与TNF-α和PDGF的异常分泌有关。
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Cytokine assays for pterygium
ZHANG Junhua*, JIN Wei'er, LIN Ying, et al.
*Department of Ophthalmology, Fujian Provincial People's Hospital, Fuzhou 350004
【Abstract】 Objective To study the roles of tumor necrosis factor (TNF-α) and platelet-derived growth factor (PDGF) in pathogenesis of pterygium. Methods Radioimmunoassay and bioactivity assay were used to measure the levels of TNF-α and PDGF in tissue culture supernatant of pterygium specimens obtained from 30 patients. Results The levels of TNF-α and PDGF in tissue culture supernatant of pterygium were significantly higher than that of normal conjunctival specimens (t=2.827, P<0.01；t=3.011,P<0.01), and there was a significant difference between progressive and quiescent cases (t=2.374, P<0.05;t=2.712,P<0.05). Conclusions The abnormal secretion of TNF-α and PDGF may be related to the pathogenesis of pterygium.
, 百拇医药
【Key words】 Pterygium Tumor necrosis factor Platelet-derived growth factor
翼状胬肉是眼科的常见病之一，但其发病机制尚不清楚。病理学研究表明，翼状胬肉的主要成分为大量增生的成纤维细胞，并由其导致相应的病变[1]。 近年来的研究表明，细胞因子在炎症反应及成纤维细胞增生方面起着重要的作用[2]。我们对翼状胬肉组织在体外培养分泌产生的肿瘤坏死因子(tumor necrosis fator,TNF-α)和血小板源生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)进行检测，探讨其在翼状胬肉发病机制中的作用。
资料与方法
一、对象
, http://www.100md.com 选择我院眼科门诊的初发型翼状胬肉患者30例(30只眼)。按病变局部有无充血、肥厚和浸润，将其分为2组：(1)进行期组19例(19只眼)，男12例，女7例；年龄34～61岁，平均42.7岁。(2)静止期组11例(11只眼)，男7例，女4例；年龄28～69岁，平均47.2岁。所有患者均无其他角、结膜疾患，确诊后均行翼状胬肉单纯切除术，同时剪除患眼角膜上缘上方约3 mm处的正常球结膜组织2 mm×5 mm，作为自身对照。
二、方法
1.翼状胬肉组织培养上清液的制备：翼状胬肉及正常球结膜组织取材后迅速放入含10%胎牛血清的RPMI1640(美国Gibco公司)培养液(1 ml)中， 将进行期翼状胬肉分为3组：(1)单纯培养液组。(2)加抗TNF-α抗体组：培养液中加入2 μg/ml的抗TNF-α抗体(美国Sigma公司)。(3)加抗 PDGF 抗体组：培养液中加入2 μg/ml的抗PDGF抗体(美国sigma公司)，置37℃孵育24小时，研磨匀浆后离心2 500 r/min，20分钟，收集上清液，于-30℃冰箱中保存待测TNF-α和/或PDGF含量。组织蛋白含量采用改良Lowry法测定。
, 百拇医药
2.TNF-α含量的测定：采用RIA法，试剂盒购自上海长征医学有限公司。
3.PDGF活性的测定：采用细胞生物活性法见文献[3]，以1%胎牛血清促进L 929细胞增殖活性的表达为PDGF的一个活性单位(U/ml)
4.统计学处理：每份标本平行测定3个孔，求其平均值(
±s)，各组间比较采用t检验。结果
一、翼状胬肉与正常球结膜组织细胞因子体外分泌水平的比较
翼状胬肉和正常球结膜组织在体外培养后，其上清液中均能测到TNF-α和PDGF的活性，但翼状胬肉组均明显高于正常球结膜组(P<0.01)(表1)。
, 百拇医药
表1 30例翼状胬肉患者翼状胬肉和正常球结膜
组织中的细胞因子分泌表达 组别
眼数
TNF-α
(
±s，×10-12g/mg蛋白)PDGF
(
±s，U/mg蛋白), http://www.100md.com
翼状胬肉
30
43.8±22.1
71.3±12.4
正常球结膜
30
9.4±3.6
8.9±4.7
t值
2.827
3.011
P值
<0.01
, http://www.100md.com
<0.01
二、不同时期的翼状胬肉组织细胞因子分泌水平的比较(表2)表2 30例翼状胬肉患者不同时期的翼状胬肉
组织中细胞因子分泌水平的比较 组别
眼数
TNF-α
(
±s，×10-12g/mg蛋白)PDGF
(
±s，U/mg蛋白), http://www.100md.com
进行期
19
56.6±23.8
84.2±9.7
静止期
11
29.2±14.3
35.1±8.5
t值
2.374
2.712
P值
<0.05
, http://www.100md.com
<0.05
进行期翼状胬肉组织中的TNF-α和PDGF体外分泌量均明显高于静止期翼状胬肉组织(P<0.05)。
三、特异性中和抗体对翼状胬肉组织体外分泌TNF-α和PDGF的影响
进行期翼状胬肉，单纯培养液组，培养后检测其上清液中TNF-α和PDGF的含量，结果见表2；加抗TNF-α抗体组，培养后检测其上清液中的PDGF活性为(47.6±7.8)U/ml蛋白，明显低于单纯培养液组的PDGF活性(t＝2.265，P<0.05)；加抗PDGF抗体组，培养后检测其上清液中的TNF-α含量为(30.9±13.3)×10-12g/mg蛋白，明显低于单纯培养液组的TNF-α含量(t＝2.196,P<0.05)。
讨论
一、翼状胬肉形成的原因
, 百拇医药
翼状胬肉的形成是多种因素参与的复杂病理过程。其原因为成纤维细胞、 内皮细胞、淋巴细胞、血小板及多种细胞因子相互作用导致大量增生的成纤维细胞和血管的增生与退变[4]。此外，该病与紫外线照射、风沙、粉尘、 花粉剌激及感染等有关，而这些因素均可导致球结膜的蛋白变性及细胞因子的分泌异常[5]。因此，国内外学者认为，免疫因素在翼状胬肉的发病中起重要作用。
二、细胞因子在翼状胬肉发病机制中的作用
TNF-α和PDGF是一组来源于淋巴细胞、单核巨噬细胞及血管内皮细胞的细胞因子，它们不仅一起构成炎性介质，而且还可以促进纤维母细胞的增殖[6]。本研究中，翼状胬肉组织培养上清液中的TNF-α含量和PDGF活性均明显高于正常球结膜组，且进行期与静止期组间差异有显著性(P<0.05)，表明TNF-α和PDGF 的表达异常可能与翼状胬肉的发生发展有关。有文献报道，翼状胬肉组织中有大量的新生血管、纤维母细胞和纤维增生，并可见大量的淋巴、浆细胞浸润和肥大细胞反应[7，8]，这不仅表明在翼状胬肉发病机制中免疫因素的存在，而且这些因素可导致TNF-α和PDGF的分泌表达增加[9]，促使纤维母细胞、胶原纤维的增生和炎性细胞的浸润，促进翼状胬肉的发展。
, 百拇医药
三、TNF-α和PDGF的相互调控作用
McAvoy等[10]报道，TNF-α和PDGF同属细胞因子网络中核心成员。本研究中，抗TNF-α抗 体对PDGF的产生及抗PDGF抗体对TNF-α的产生均具有负向调节作用，说明TNF-α和PDGF在细胞因子网络中具有相互的调节作用。因此，进一步研究如何对细胞因子的分泌进行有效的调控，对翼状胬肉的预防、治疗及防止其复发均具有重要的意义。
参考文献
[1] Hill JC, Maske R. Pathogenesis of pterygium. Eye,1989,3:218-226.
[2] Thoratoay SC. Interaction of immune and connective tissue cells the effect of lymphokines and monokines on fibroblast growth. J Leuko Biol,1990,47:312-316.
, http://www.100md.com
[3] Heldin CH, Westermark B, Wasteson A. Platelet-derived growth factor: isolation by a large-scale procedure and analysis of subunit composition.Biochem J, 1981,193:907-913.
[4] Kria L, Ohira A, Amemiya T. Immunohistochemical localization of basic fibroblast growth factor, platalet derived growth factor, transforming growth factor-β and tumor necrosis factor-α in the pterygium. Acta Histochem,1996,98:195-201.
[5] Coroneo MT. Pterygium as an early indictor of ultraviolet insolation:a hypothesis. Br J Ophthalmol,1993,77:734-739.
, 百拇医药
[6] Gospodaroicz D,Neufeld G,Schweigerer L. Fibroblast growth factor. Mol Cell Endocrinol,1986,46:187-204.
[7] Xu GX, Tong Y, Lin FS, et al. Pathological study of pterygium. Invest Ophthalmol Vis Sci,1995,36:1027-1031.
[8] 柳林，杨德旺，牟贤龙，等.翼状胬肉的免疫病理学研究. 中华眼科杂志,1993,29 :141-143.
[9] Kohase M, May LT, Tamm I, et al. A cytokine network in human diploid fibrolast interactions of β-interferons, tumor necrosis factor, platelet-derived growth factor and interleukin-1.Mol Cell Biol,1997,7 :273-281.
[10] McAvoy JW,Chamberlain CG. Growth factors in the eye. Prog Growth Factor Res, 1990,2:29-43.
(收稿：1998-06-22 修回：1998-09-28), 百拇医药