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编号:10245216
干扰素α-2b作为青光眼滤过术后辅助用药的实验研究
http://www.100md.com 《中华眼科杂志》 1999年第1期
     作者:熊新春 杜蜀华 吕源淑 魏厚仁

    单位:熊新春 吕源叔 魏厚仁(430022 武汉,同济医科大学附属协和医院眼科);杜蜀华(附属同济医院眼科)

    关键词:干扰素Alpha-2b;青光眼;受体;表皮生长因子-尿抑胃素

    中华眼科杂志990116 【摘要】 目的 探讨干扰素α-2b(interferon alpha-2b,IFN α- 2b)对结膜下瘢痕形成的抑制作用机理和青光眼滤过术后的应用方式。方法 采用免疫组织化学PAP法检测IFN α-2b对体外培养的牛结膜下成纤维细胞表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)受体的影响,并用IBAS(image biological analysis system)图像分析系统定量分析;观察IFN α-2b对36只兔眼结膜下置线引起的瘢痕中胶原含量的影响及18只兔眼小梁切除术后房水蛋白的变化。结果 IFN α-2b具有减少成纤维细胞表达EGF受体的作用,其量效关系为:Y=2953.8-554.5 lgx(r=-0.98,P<0.01)。4.67×10-5 μmol/L IFN α-2b不仅能够减少缝线引起的瘢痕中胶原含量的1/2左右,且能显著降低小梁切除术后的房水蛋白浓度。结论 IFN α- 2b可望作为青光眼滤过术后辅助用药,并在诸多方面优于抗代谢类药物。
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    A study of interferon alpha-2b as an accessory

    drug after glaucoma filtration surgery

    XIONG Xinchun*, DU Shuhua, Lbu.gif (1618 bytes) Yuanshu, et al. *

    Department of Ophthalmology, Union Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430022

    【Abstract】 Objective To elucidate the inhibitory action of interferon alpha-2b (IFN α-2b) on the cicatrization under conjunctiva and the best way to use it after glaucoma filtration surgery. Methods Immunohistochemical PAP method and image biological system 2000 (IBAS 2000) were utilized to quantitatively analyze the inhibitory effect of IFN α-2b on the expression of epidermal growth factor receptor (EGFR) of cultured calf fibroblasts; the effects of IFN α-2b on collagen contents in suture-caused cicatrization under conjunctiva and changes of aqueous humor protein after trabeculectomy performed on rabbits have also been observed. Results IFN α-2b reduced the expression of EGFR of cultured bovine fibroblasts at a dose-dependent manner. The relationship between the EGFR and the dosage of IFN α-2b is Y=2953.8-554.5 lgx (r=-0.98, P<0.01). With 4.67×10-5 μmol/L IFN α-2b not only reduced about 50% of the collagen in suture-caused cicatrization, but also significantly decreased the protein concentration of aqueous humour 3 and 72 hours after trabeculectomy. Conclusion It is promising that IFN α-2b can be used after glaucoma filtration surgery to reduce excessive cicatrization with many advantages compared with antimetabolites.
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    【Key words】 Interferon Alpha-2b Glaucoma Receptors, epidermal growth factor-urogastrone

    结膜下瘢痕组织增生是抗青光眼滤过术后失败的主要原因,其主要病理过程包括局部成纤维细胞增殖、胶原基质产生及血管新生。其中包括表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)在内的各种细胞因子在瘢痕形成中起着重要作用[1]。降低局部生长因子水平或减少细胞生长因子受体表达是抗瘢痕形成的途径之一。生物制剂干扰素α-2b (interferon alpha-2b,IFN α-2b)具有抗多种细胞增殖、减少瘢痕形成的能力,本实验旨在探讨IFN α-2b作为青光眼滤过术后辅助用药的可能性。

    材料与方法

    1.用免疫组织化学PAP法测定细胞EGF受体:将体外培养的牛结膜下成纤维细胞按2×105个/瓶接种入置有载玻片的15 ml培养瓶中,共18瓶。准确加入RPMI-1 640培养液(美国Gibco公司产品)4 ml,37℃下保存18小时后,将细胞瓶分为6组,每组3瓶,加入IFN α-2b使终浓度分别为0,1.55×10-5、1.55×10-4、1.55×10-3、1.55×10-2及2.33×10-2 μmol/L;继续培养48小时后取出载玻片,冰丙酮固定,过氧化氢甲醇阻断内源性过氧化物酶。采用PAP法检测EGF受体,Ⅰ抗为鼠抗EGF受体单抗(军事医学科学院产品),Ⅱ抗为羊抗鼠IgG和鼠PAP(同济医院临床免疫室产品)。分别用鼠肝切片和PBS液代替Ⅰ抗作阳性和阴性对照。
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    2.用生物图像分析系统IBAS 2000(image biological analysis system 2000,德国Opton公司产品)定量分析EGF受体:组织培养切片放大250倍,彩色摄像镜头将随机选取的5个视野输入计算机,计算每个视野中5个边界较清晰的成纤维细胞表面棕黄色光点的面积。每种浓度重复检测3次。采用直线回归法分析IFN α-2b与EGF受体间的关系。

    3.测定缝线引起的结膜下瘢痕中胶原含量:体重约3 kg大耳白兔18只(36只眼),随机分为3组,氯胺酮麻醉,于12点钟处距角巩缘3 mm处剪开球结膜,放置已消毒的长0.5 cm 7号丝线,9-0尼龙线缝合1针。(1)1组6只兔(12只眼)置线后作为对照;(2)2组6只兔(12只眼)置线后立即线下注射4.67×10-5 μmol/L IFN α-2b 0.05 ml 1次;(3)3组6只兔(12只眼)置线后线旁3 mm处注射4.67×10-5 μmol/L IFN α-2b 0.05 ml 1次。7天后处死每组兔半数,其余兔14天全部处死。取线周组织用Bouin液固定,石蜡切片,Masson's三色染色,IBAS 2000真彩色系统定量检测其蓝色胶原纤维含量[2]。统计学处理采用t检验。用免疫组织化学PAP法检测组织切片中EGF受体。
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    4.IFN α-2b对小梁切除术后房水蛋白的影响:大耳白兔9只(18只眼),随机分为3组,于氯胺酮麻醉下行小梁切除术。(1)1组3只兔(6只眼)术后立即于滤过泡下注射生理盐水0.05 ml 1次,作为对照;(2)2组3只兔(6只眼)术后立即滤过泡下注射IFN α-2b 4.67×10-5 μmol/L 0.05 ml 1次;(3)3组3只兔(6只眼)术前24小时于术区注射IFN α-2b 4.67×10-5μmol/L 0.05 ml 1次。各组术后3,24,72,240小时前房穿刺抽取房水0.05 ml;另抽取3只正常兔(6只眼)房水0.05 ml,3小时后再次抽取房水0.05 ml。双缩脲法测蛋白,并观察术后反应。统计学处理采用t检验方法。

    结果

    1.IFN α-2b浓度的对数与EGF受体面积:见表1。其直线对应关系为:Y=2 953.8-554.5 lgx(r=-0.98,P<0.01)。IFN α-2b对该细胞受体的半数抑制量IC50为5.60×10-4μmol/L,当细胞在1.55×10-2μmol/L以上IFN α-2b浓度中培养48小时,EGF受体表达明显减少(图1,2)。
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    表1 IFN α-2b浓度与EGF受体面积 IFN α-2b浓度

    (μmol/L)

    EGF受体面积

    (bx.gif (856 bytes)±s,μm2)

    0

    2 297.5±167.2

    1.55×10-5

    2 146.6±53.9

    1.55×10-4
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    1 316.4±245.5

    1.55×10-3

    774.8±189.6

    1.55×10-2

    530.1±81.5

    2.33×10-2

    203.3±7.452-1.gif (33918 bytes)

    图1 体外培养的牛结膜下成纤维细胞表达EGFR(箭头示) 苏木素衬染PAP×50052-2.gif (33687 bytes)
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    图2 细胞在含2.33×10-2 μmol/L IFN α-2b培养液中培养48小时,EGFR表达减少(箭头示) 苏木素衬染PAP×500

    2.置线后应用IFN α-2b对瘢痕中胶原含量的影响:见表2。4.67×10-5 μmol/L IFN α-2b无论是线下注射还是线旁注射均能降低其胶原含量(图3,4),与对照组相比,差异有非常显著性(P<0.01)。IFN α-2b同时能减少缝线周围结膜上皮、成纤维细胞及小血管内皮EGF受体表达(图5,6)。表2 4.67×10-5μmol/L IFN α-2b对

    瘢痕胶原含量的影响 组别

    用药7天

    用药14天

    胶原含量
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    (bx.gif (856 bytes)±s)

    抑制率

    (%)

    胶原含量

    (bx.gif (856 bytes)±s)

    抑制率

    (%)

    对照组
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    56.76±10.5

    -

    48.96±6.72

    -

    线下注射*

    25.65±9.87△△

    54.81

    23.03±10.07△△

    52.97

    线旁注射**

    29.20±13.07△△
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    48.55

    27.91±10.44△△

    42.99

    *线下注射IFN α-2b **线旁3 mm处注射IFN α-2b 抑制率=(对照组-实验组)/对照组×100% △△与对照组相比P<0.0152-3.gif (38675 bytes) 52-4.gif (35839 bytes)

    图3,4 线下注射4.67×10-5 μmol/L IFNα-2b,可见对照组(图3)
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    胶原纤维减少(箭头示) Masson′s三色染色×50052-5.gif (35477 bytes) 52-6.gif (36143 bytes)

    图5,6 线下注射4.67×10-5 μmol/L IFNα-2b,7天后,与对照

    组(图5)比较,可见结膜上皮(大箭头示)、小血管内皮(细箭头示)

    的EGFR表达减少(小箭头示) 苏木素衬染PAP×500

    3.IFN α-2b对小梁切除术后房水蛋白的影响:见表3。本实验测得正常兔房水蛋白为(0.31±0.12) g/L,3小时后再次房水蛋白测定为(22.61±10.32) g/L。术后立即滤过泡下注射4.67×10-5 μmol/L IFN α-2b组与对照组比较,房水蛋白浓度明显降低,3小时、72小时(P<0.01)及240小时房水蛋白测定值间差异均有显著性(P<0.05)。术前24小时手术区注射IFN α-2b组与对照组相比差异无显著性(P>0.05)。表3 4.67×10-5 μmol/L IFN α-2b对
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    小梁切除术后房水蛋白的影响 组别

    用药后不同时间房水蛋白含量(g/L)

    3h

    24h

    72h

    240h

    对照组

    45.69±9.44

    6.23±4.01

    4.19±2.38

    1.41±0.72

    术后滤过泡下注射*
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    5.02±3.30**

    3.92±1.88

    1.01±0.76**

    0.74±0.12***

    术前24h术区注射*

    42.92±8.10

    10.13±4.24

    3.08±1.13

    0.77±0.49

    *注射IFN α-2b **与对照组相比P<0.01 ***与对照组相比P<0.05
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    讨论

    1.IFN α-2b抑制结膜下成纤维细胞EGF受体表达:(1)IFN α-2b是重组的人白细胞干扰素,临床上已被用于抗多种细胞增殖,抗肝、肺纤维化[3]。本实验结果首先证明了IFN α-2b能够抑制结膜下成纤维细胞EGF受体表达,从而抑制其分裂增殖,并用图像分析的方法确定了其量效关系,为临床应用剂量的选择提供了依据。(2)EGF受体是一种糖蛋白,广泛存在于上皮细胞和成纤维细胞膜表面、胞浆甚至核内。每个成纤维细胞大约有4~10万个受体,其主要功能是接受EGF刺激,促进蛋白质、DNA合成,使细胞功能活跃,分裂加速。在青光眼滤过术后,已证明EGF参与了滤过道的损伤修复过程,且泪液和房水中均可检出高于血浓度的EGF[4,5]。应用IFN α-2b可阻断成纤维细胞EGF受体表达,无凝将减少EGF的刺激,使细胞分裂减慢或停止,有利于保持滤过道通畅。

    2.IFN α-2b能减少瘢痕中胶原形成:在动物活体实验中,我们已证明4.67×10-5 μmol/L的IFN α-2b能减少结膜下置线引起的瘢痕中胶原的含量。约相当于成人(60 kg体重)全身用量(9.32×10-4 μmol/L)的1/2,未见角膜上皮缺损等并发症。胶原减少的主要机理:(1)合成减少:EGF不仅刺激表达EGF受体的细胞分裂,而且也加速其胶原蛋白合成。IFN α-2b抑制EGF受体表达,导致合成胶原的细胞减少及合成能力下降[6],从而减少胶原含量。(2)分解增加:IFN α-2b能够增加胶原酶的生成,使胶原分解增加[1]。(3)血供减少:本实验中观察到应用IFN α-2b后,局部始终未见到粗大血管。最近越来越多的报道证明IFN α-2b不仅能抑制老年黄斑变性的新生血管形
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    成[7],而且使虹膜新生血管消退,使来自血液的生长因子或营养物质均减少,故瘢痕形成不明显。

    3.IFN α-2b降低房水蛋白的机理:(1)小梁切除术后由于血-房水屏障的破坏、炎性因子的刺激、血流变慢等导致眼内纤维素渗出、房水蛋白浓度升高,如不及时清除,也可促进细胞趋化、增殖、机化,导致滤过道的阻塞。最近报道,已应用于临床的5-氟尿嘧啶和丝裂霉素均可破坏血-房水屏障,导致房水蛋白浓度升高,对滤过术后的眼前节恢复不利[8]。IFN α-2b本身是蛋白质,如果于滤过泡下直接注射是否将导致房水蛋白进一步升高?结果发现IFN α-2b能够显著降低房水蛋白,早期效果尤为明显(5.02±3.3)g/L,(P<0.01)。IFN α-2b显著降低房水蛋白的作用国内外尚未见报道,可能系其加强了血-房水屏障的作用。在术后早期,房水蛋白主要由毛细血管渗漏而来,IFN α-2b可能加强了术区、虹膜、睫状体和脉络膜毛细血管的内屏障功能。最近Gillies
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    等[9]的体外实验证实:3.11×10-4 μmol/L IFN α-2b能够选择性地增加体外培养的牛视网膜血管内皮细胞的电阻,降低该细胞的通透系数。此外也可能与其减轻炎性反应、减少细胞坏死的药理作用有关。(2)IFN α-2b加强血-房水屏障作用,不仅减轻了眼前节反应,有利于眼前节恢复,且减少了血液中生长因子进入房水,抑制了成纤维细胞EGF受体的表达,同时对抑制瘢痕形成也有利。具有抗增殖、抗纤维化,抑制人眼内新生血管的α干扰素,对牛、兔细胞具有交叉属性。本实验中选用的4.67×10-5 μmol/L IFN α-2b相当于EGF受体半数抑制量的25倍,是因为已有实验证明即使玻璃体内一次注射3.11×10-4 μmol/L IFN α-2b对眼组织也无不良影响[10],临床上可根据情况选用(3.11~4.67)×10-5 μmol/L滤过泡下注射,尤其对于新生血管性青光眼将有更大的作用。
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    参考文献

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    (收稿:1998-05-25 修回:1998-10-18), 百拇医药