槲皮素对人早幼粒白血病细胞核转录活性和细胞周期的影响*
作者：黄迪南 侯 敢 祝其锋
单位：广东医学院医用生化研究所(湛江 524023)
关键词：槲皮素；白血病，早幼粒；细胞周期；细胞核；转录
肿瘤990119 以往的研究表明，槲皮素可抑制多种肿瘤细胞的生长及加强某些抗癌 药物的抗癌细胞生长作用[1]，并可抑制癌细胞DNA的生物合成[2]。因而，槲皮素被认为是颇具应用前景的抗癌药物或抗癌辅助药物。然而，槲皮素抗癌细胞增殖的机理尚未阐明。本文研究了槲皮素对培养的人早幼粒白血病细胞(HL-60)在体外核转录活性和细胞周期的影响及其相互关系，以期探讨槲皮素抑制HL-60细胞增殖的作用机理。
材料和方法
一、材料
, http://www.100md.com
1.HL-60细胞株 由军事医学科学院惠赠。
2.主要试剂 RPMI-1640培养基(Gibco)，槲皮素(Guercetin,Sigma),Nonidet P-40(Sigma),HEPES(Aldrich),3H-UTP(740 MBq/mmol,中科院上海原子能研究所)，余为国产分析纯试剂。
二、方法
1.药物处理 取对数生长期细胞以1×105/ml 细胞于大培养瓶中培养，按所需量加入槲皮素(DMSO溶解)或等量DMSO作空白对照(DMSO终浓度均<0.01%)，培养至实验所需时间后，取细胞进行细胞周期分析或制备细胞核。
2.细胞核的制备 参照Stallcup和Washington方法[3]进行。分离的核涂片，要求在相差显微镜下检查无细胞质污染。按二苯胺法测定细胞核的DNA含量，并以1 μg/ml DNA浓度将核悬于0.34 mol/L蔗糖溶液中备用。
, 百拇医药
3.体外核转录活性测定 参照Goodland方法[4]进行。在IS 6000C型液闪仪测cpm值。体外核转录活性以参入RNA的3H-UTP量计算，用cpm/μg DNA表示。
4.细胞周期分析 参照Krishan方法[5]进行。应用EPICSXL型流式细胞仪(美国Coulter公司产品)进行细胞周期分析(软件自动处理)。
5.统计分析 实验数据用
±s表示，采用SYSTAT统计软件进行统计分析。
结 果
一、槲皮素对HL-60细胞体外核转录活性的影响
不同剂量的槲皮素处理HL-60细胞2天，等量DMSO为空白对照，体外核转录活性测定结果见图1。
, 百拇医药
图1 槲皮素浓度对HL-60细胞核转录活性的影响
图1显示，槲皮素处理HL-60细胞后，体外核转录活性降低，呈剂量依赖关系。其中，RNA聚合酶Ⅱ活性较总RNA聚合酶活性受抑制程度更高。
二、槲皮素对HL-60细胞细胞周期的影响
分别用4、20和100 μmol/L槲皮素处理HL-60细胞2天，细胞周期的变化见表1。
表1表明，随槲皮素处理HL-60细胞剂量增加，G1期细胞所占百分比明显增加，且呈剂依赖关系，而其余各期细胞相对减少。提示槲皮素阻断HL-60细胞于G1期。
三、槲皮素作用后HL-60细胞体外核转录活性与细胞周期的关系分析
, 百拇医药 分别以槲皮素作用剂量(对数)为横坐标，以核转录抑制率和G1期细胞增加率为纵坐标作图，如图2所示。
表1 槲皮素浓度对HL-60细胞周期的影响(±s) 剂量(μmol/L)
n
G1(%)
S(%)
G2(%)
G2/G1(DNA 含量比)
对照
, 百拇医药 3
22.6±0.3
59.1±0.6
18.6±0.3
1.919±0.003
4
3
31.5±0.7*
54.5±1.2
14.4±0.4
1.939±0.007
20
, 百拇医药
3
35.2±1.1*
53.2±1.8
15.5±0.6
1.944±0.003
100
3
38.4±1.5*
54.9±2.6
7.5±1.7
1.956±0.004
*P<0.01，与对照组比较，SNK检验
, http://www.100md.com
图2 不同浓度槲皮素作用HL-60细胞核转录活性与细胞周期的关系
图2表明，槲皮素处理的HL-60细胞，其核转录活性抑制率特别是RNA聚合酶Ⅱ活性抑制率与G1期细胞增加率呈一定的相关性。
讨 论
槲皮素对各种细胞的细胞周期的影响多家报道结果不一，似乎涉及到细胞增殖的各期。Ranellitte等[1]报道，槲皮素阻断HT-29、WiDr、COLO201和LS-174人克隆细胞株于G0/G1期。Hosokawa等[6]的研究表明，槲皮素阻断人克隆癌细胞株(Col0320 DM)于G1/S期交界外。Avila等[7]报道了人乳腺癌细胞(MDA-M13468)可被槲皮素阻断于G1/M期。本文研究结果表明，经槲皮素处理的HL-60细胞，G1期细胞增加并呈剂量依赖关系，说明细胞被阻断于G1期，这与多数报道相一致。
, 百拇医药
目前，各种癌细胞生长抑制剂和分化诱导剂等对HL-60细胞RNA生物合成的影响结果尚无定论。Grosso等[8]将HL-60细胞核用60 mmol/L DMSO处理5天，细胞核run-off实验表明总RNA聚合酶活性无明显改变。Emey等[9]用Calatriol处理HL-60细胞核，总RNA聚合酶和对α-Amanitin敏感的RNA聚合酶Ⅱ活性均显著降低。Tsiftsoglou等[10]发现DMSO和维甲酸处理的HL-60细胞，其3H-UTP参入核和胞浆中的量在48～72小时显著减少。虽然，Uddin等[2]曾报道了槲皮素能抑制HL-60细胞的DNA生物合成，但尚未见有关槲皮素对肿瘤细胞RNA生物合成影响的报道。本文用槲皮素处理培养的HL-60细胞后，分离纯化核进行体外核转录实验，结果表明，体外核转录活性降低，总RNA聚合酶活性尤其是对α-Amanitin敏感的RNA聚合酶Ⅱ活性明显受抑制，并呈剂量依赖关系。
, http://www.100md.com 众所周知，细胞G1期为DNA和蛋白质合成的准备阶段，细胞RNA生物合成旺盛，各种与复制有关蛋白质mRNA在此期由对α-Amanitin敏感的RNA聚合酶Ⅱ合成。影响细胞周期的因子是多方面的，目前研究最多的有各种周期蛋白。Baserga等[11]曾研究了对温度敏感的Syrian Hamster BHK细胞株，发现温度敏感株较非温度敏感株RNA聚合酶Ⅱ活性降低并阻断于G1期，认为RNA聚合酶Ⅱ是细胞周期通过G1/S期阻断点的主要调控因子。通过对本文结果的进一步分析表明，槲皮素处理HL-60细胞后，其核转录活性特别是RNA聚合酶Ⅱ活性抑制程度与G1期细胞增加程度呈一定的相关性。作者推测，RNA聚合酶Ⅱ活性受抑制可能也是槲皮素阻断HL-60细胞于G1期的影响因素之一。
广东省重点学科重点项目
参 考 文 献
, 百拇医药
1 Ranelletti FO,Ricci R,Larocca LM,et al.Growth-inhibitory effect quercetin and presence of type Ⅱ estrogen-binding sites in human colon-cancer cell lines and primary colonrectal tumors.Int J Cancer,1992,50(3):486
2 Uddin S,and Chaudhry MA.Quercetin,a bioflavonoid,inhibits the DNA synthesis of human leukemia cells.Biochem Mol Biol Int,1995,36(3):545
3 Stallcup MR,and Washington LD.Region specific initiation of mouse mammary tumor virus RNA synthesis by endogenous RNA polymerase Ⅱ in preparation of cell nuclei.J Biol Chem,1983,258:2802
, http://www.100md.com
4 Goodlad GA,and Clark CM,Response of skeletal muscle RNA polymerase Ⅰ and Ⅱ tumour growth.Biochim biophys Acta,1988,950:296
5 Krisham AA.Rapid flow cytometric analysis of mammalian cell cycle by propidium iodide staining.J Cell Biol,1975,66:188
6 Hosokawa N,Hosokawa Y,Sakai M,et al.Inhibitory effect of quercetin on the synthesis of a possibly cell-cycle-related 17-kDa protein in human colon cancer cells.Int J Cancer,1990,45(6):1119
, 百拇医药
7 Avila MA,Velasco JA,Cansado J,et al.Quercetin mediates the down regulation of mutant p53 in human breast cancer cell line MDA-MB468.Cancer Res,1994,54(9):2424
8 Grosso LE,and Pitot HC.Transcriptional regulation of c-myc during chemically induced differentiation of HL-60 cultures.Cancer Res,1985,45:87
9 Emerg H,and Robert US.Effect of calatriol on nuclear transcription during human HL-60 promyelocytie leukemia cell differentiation.Cancer Res,1986,46:4979
10 Tsiftsoglou AS,Wang W,Hyman R,et al.Analysis of commitment of human leukemia HL-60 cells to terminal granulocytic maturation.Cancer Res,1985,45:2334
11 Baserg R,Waechter DE,Soprano KJ,et al.Molecular biology of cell division.Ann NY Acad Sci,1982,397:110
(收稿：1997-07-22 修回：1997-06-29), 百拇医药
单位：广东医学院医用生化研究所(湛江 524023)
关键词：槲皮素；白血病，早幼粒；细胞周期；细胞核；转录
肿瘤990119 以往的研究表明，槲皮素可抑制多种肿瘤细胞的生长及加强某些抗癌 药物的抗癌细胞生长作用[1]，并可抑制癌细胞DNA的生物合成[2]。因而，槲皮素被认为是颇具应用前景的抗癌药物或抗癌辅助药物。然而，槲皮素抗癌细胞增殖的机理尚未阐明。本文研究了槲皮素对培养的人早幼粒白血病细胞(HL-60)在体外核转录活性和细胞周期的影响及其相互关系，以期探讨槲皮素抑制HL-60细胞增殖的作用机理。
材料和方法
一、材料
, http://www.100md.com
1.HL-60细胞株 由军事医学科学院惠赠。
2.主要试剂 RPMI-1640培养基(Gibco)，槲皮素(Guercetin,Sigma),Nonidet P-40(Sigma),HEPES(Aldrich),3H-UTP(740 MBq/mmol,中科院上海原子能研究所)，余为国产分析纯试剂。
二、方法
1.药物处理 取对数生长期细胞以1×105/ml 细胞于大培养瓶中培养，按所需量加入槲皮素(DMSO溶解)或等量DMSO作空白对照(DMSO终浓度均<0.01%)，培养至实验所需时间后，取细胞进行细胞周期分析或制备细胞核。
2.细胞核的制备 参照Stallcup和Washington方法[3]进行。分离的核涂片，要求在相差显微镜下检查无细胞质污染。按二苯胺法测定细胞核的DNA含量，并以1 μg/ml DNA浓度将核悬于0.34 mol/L蔗糖溶液中备用。
, 百拇医药
3.体外核转录活性测定 参照Goodland方法[4]进行。在IS 6000C型液闪仪测cpm值。体外核转录活性以参入RNA的3H-UTP量计算，用cpm/μg DNA表示。
4.细胞周期分析 参照Krishan方法[5]进行。应用EPICSXL型流式细胞仪(美国Coulter公司产品)进行细胞周期分析(软件自动处理)。
5.统计分析 实验数据用
±s表示，采用SYSTAT统计软件进行统计分析。结 果
一、槲皮素对HL-60细胞体外核转录活性的影响
不同剂量的槲皮素处理HL-60细胞2天，等量DMSO为空白对照，体外核转录活性测定结果见图1。
, 百拇医药
图1 槲皮素浓度对HL-60细胞核转录活性的影响
图1显示，槲皮素处理HL-60细胞后，体外核转录活性降低，呈剂量依赖关系。其中，RNA聚合酶Ⅱ活性较总RNA聚合酶活性受抑制程度更高。
二、槲皮素对HL-60细胞细胞周期的影响
分别用4、20和100 μmol/L槲皮素处理HL-60细胞2天，细胞周期的变化见表1。
表1表明，随槲皮素处理HL-60细胞剂量增加，G1期细胞所占百分比明显增加，且呈剂依赖关系，而其余各期细胞相对减少。提示槲皮素阻断HL-60细胞于G1期。
三、槲皮素作用后HL-60细胞体外核转录活性与细胞周期的关系分析
, 百拇医药 分别以槲皮素作用剂量(对数)为横坐标，以核转录抑制率和G1期细胞增加率为纵坐标作图，如图2所示。
表1 槲皮素浓度对HL-60细胞周期的影响(
±s) 剂量(μmol/L)n
G1(%)
S(%)
G2(%)
G2/G1(DNA 含量比)
对照
, 百拇医药 3
22.6±0.3
59.1±0.6
18.6±0.3
1.919±0.003
4
3
31.5±0.7*
54.5±1.2
14.4±0.4
1.939±0.007
20
, 百拇医药
3
35.2±1.1*
53.2±1.8
15.5±0.6
1.944±0.003
100
3
38.4±1.5*
54.9±2.6
7.5±1.7
1.956±0.004
*P<0.01，与对照组比较，SNK检验
, http://www.100md.com
图2 不同浓度槲皮素作用HL-60细胞核转录活性与细胞周期的关系
图2表明，槲皮素处理的HL-60细胞，其核转录活性抑制率特别是RNA聚合酶Ⅱ活性抑制率与G1期细胞增加率呈一定的相关性。
讨 论
槲皮素对各种细胞的细胞周期的影响多家报道结果不一，似乎涉及到细胞增殖的各期。Ranellitte等[1]报道，槲皮素阻断HT-29、WiDr、COLO201和LS-174人克隆细胞株于G0/G1期。Hosokawa等[6]的研究表明，槲皮素阻断人克隆癌细胞株(Col0320 DM)于G1/S期交界外。Avila等[7]报道了人乳腺癌细胞(MDA-M13468)可被槲皮素阻断于G1/M期。本文研究结果表明，经槲皮素处理的HL-60细胞，G1期细胞增加并呈剂量依赖关系，说明细胞被阻断于G1期，这与多数报道相一致。
, 百拇医药
目前，各种癌细胞生长抑制剂和分化诱导剂等对HL-60细胞RNA生物合成的影响结果尚无定论。Grosso等[8]将HL-60细胞核用60 mmol/L DMSO处理5天，细胞核run-off实验表明总RNA聚合酶活性无明显改变。Emey等[9]用Calatriol处理HL-60细胞核，总RNA聚合酶和对α-Amanitin敏感的RNA聚合酶Ⅱ活性均显著降低。Tsiftsoglou等[10]发现DMSO和维甲酸处理的HL-60细胞，其3H-UTP参入核和胞浆中的量在48～72小时显著减少。虽然，Uddin等[2]曾报道了槲皮素能抑制HL-60细胞的DNA生物合成，但尚未见有关槲皮素对肿瘤细胞RNA生物合成影响的报道。本文用槲皮素处理培养的HL-60细胞后，分离纯化核进行体外核转录实验，结果表明，体外核转录活性降低，总RNA聚合酶活性尤其是对α-Amanitin敏感的RNA聚合酶Ⅱ活性明显受抑制，并呈剂量依赖关系。
, http://www.100md.com 众所周知，细胞G1期为DNA和蛋白质合成的准备阶段，细胞RNA生物合成旺盛，各种与复制有关蛋白质mRNA在此期由对α-Amanitin敏感的RNA聚合酶Ⅱ合成。影响细胞周期的因子是多方面的，目前研究最多的有各种周期蛋白。Baserga等[11]曾研究了对温度敏感的Syrian Hamster BHK细胞株，发现温度敏感株较非温度敏感株RNA聚合酶Ⅱ活性降低并阻断于G1期，认为RNA聚合酶Ⅱ是细胞周期通过G1/S期阻断点的主要调控因子。通过对本文结果的进一步分析表明，槲皮素处理HL-60细胞后，其核转录活性特别是RNA聚合酶Ⅱ活性抑制程度与G1期细胞增加程度呈一定的相关性。作者推测，RNA聚合酶Ⅱ活性受抑制可能也是槲皮素阻断HL-60细胞于G1期的影响因素之一。
广东省重点学科重点项目
参 考 文 献
, 百拇医药
1 Ranelletti FO,Ricci R,Larocca LM,et al.Growth-inhibitory effect quercetin and presence of type Ⅱ estrogen-binding sites in human colon-cancer cell lines and primary colonrectal tumors.Int J Cancer,1992,50(3):486
2 Uddin S,and Chaudhry MA.Quercetin,a bioflavonoid,inhibits the DNA synthesis of human leukemia cells.Biochem Mol Biol Int,1995,36(3):545
3 Stallcup MR,and Washington LD.Region specific initiation of mouse mammary tumor virus RNA synthesis by endogenous RNA polymerase Ⅱ in preparation of cell nuclei.J Biol Chem,1983,258:2802
, http://www.100md.com
4 Goodlad GA,and Clark CM,Response of skeletal muscle RNA polymerase Ⅰ and Ⅱ tumour growth.Biochim biophys Acta,1988,950:296
5 Krisham AA.Rapid flow cytometric analysis of mammalian cell cycle by propidium iodide staining.J Cell Biol,1975,66:188
6 Hosokawa N,Hosokawa Y,Sakai M,et al.Inhibitory effect of quercetin on the synthesis of a possibly cell-cycle-related 17-kDa protein in human colon cancer cells.Int J Cancer,1990,45(6):1119
, 百拇医药
7 Avila MA,Velasco JA,Cansado J,et al.Quercetin mediates the down regulation of mutant p53 in human breast cancer cell line MDA-MB468.Cancer Res,1994,54(9):2424
8 Grosso LE,and Pitot HC.Transcriptional regulation of c-myc during chemically induced differentiation of HL-60 cultures.Cancer Res,1985,45:87
9 Emerg H,and Robert US.Effect of calatriol on nuclear transcription during human HL-60 promyelocytie leukemia cell differentiation.Cancer Res,1986,46:4979
10 Tsiftsoglou AS,Wang W,Hyman R,et al.Analysis of commitment of human leukemia HL-60 cells to terminal granulocytic maturation.Cancer Res,1985,45:2334
11 Baserg R,Waechter DE,Soprano KJ,et al.Molecular biology of cell division.Ann NY Acad Sci,1982,397:110
(收稿：1997-07-22 修回：1997-06-29), 百拇医药