非小细胞肺癌中抑癌基因p16/MTS1的基因突变和表达缺失
作者：石永玉 魏海明 孟 红 李 焱 孙广莲 秦立增 吴惠联 郭进林
单位：山东省医学科学院基础所微生物室(济南250062)
关键词：癌，非小细胞肺；基因p16；突变
肿瘤990109 1994年Kamb等[1]在人染色体9p21发现一个新的抑癌基因p16，由于该基因在多种类型肿瘤细胞株中频繁缺失，成为近年来肿瘤分子生物学的研究热点。在人原发性非小细胞肺癌中，p16基因失活被认为与肿瘤的发生密切相关[2]。作者采用免疫组化技术和PCR-SSCP方法，分析人原发性非小细胞肺癌中p16基因突变和蛋白表达缺失情况，着重探讨p16基因失活与肺癌的分化程度及淋巴结转移的关系。
材料与方法
1.标本 1995～1997年48例非小细胞肺癌病理存档蜡块标本，由山东省医科院病理室提供，其中22例有淋巴结转移，中、高分化者30例，低分化者18例。并用3例支气管扩张症蜡块标本作良性对照。
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2.SABC-免疫组化染色 鼠抗p16蛋白单克隆抗体为Neomarker公司产品，工作效价1：50。SABC免疫组化试剂盒购于武汉博士德公司。常规石蜡切片梯度酒精脱蜡至水，然后按试剂盒说明书进行操作，最后苏木素复染，酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。同时用支气管扩张症手术标本作正常对照，分别以PBS、正常鼠血清代替一抗作为空白对照和替代对照，以细胞核或细胞浆染成棕黄色作为阳性判定标准。
3.DNA提取及PCR扩增，取石蜡切片3～5片置于二甲苯中脱蜡24 h，其间不时摇动并换液3次。然后按照宝灵曼公司提供的DNA提取试剂盒的说明书操作。因p16基因约90%的突变见于Exon2，故本实验选用扩增p16基因第二外显子的上游区和下游区2对引物，由华美公司合成(见图1、表1)。PCR扩增程序：50 μl反应体系，引物200 pmol，dNTP 10 nmol，1%二甲亚砜，样品0.2 μg。95℃预变性5分钟，然后加入taq酶2 U，接着94℃ 50秒，56℃或58℃(表1)40秒，72℃ 50秒，循环30次，最后72℃保温7分钟。
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表1 p16基因Exon 2引物序列 外显子
引物序列
片段大小(bp)
复性温度(℃)
p16上游区1
5’ACAAGCTTCCTTTCCGTCATGC3’
p16上游区2
5’CCAGGCATCGCGCACGTCCA3’
244
58
p16下游区1
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5’TTCCTGGACACGCTGGTGGT3；
p16下游区2
5’TCTGAGCTTTGGAAGCTCT3’
240
56
4.SSCP银染分析：取10 μl PCR扩增产物，加入10 μl甲酰胺变性液，混匀，95℃变性5分钟，冰上骤冷5分钟，上样8%非变性聚丙烯酰胺凝胶(49：1)，1×TBE为电泳缓冲液，5 mA恒电流4℃电泳12～16小时。取下凝胶，于10%乙醇中固定5分钟，然后1%硝酸溶液中脱色3分钟，蒸馏漂洗3×2分钟，置于1%硝酸银染液中摇动染色20分钟，蒸馏水漂洗30秒，30%碳酸钠-0.01%福尔马林显影液显影，最后用10%乙酸溶液适时中止反应。置凝胶于白色背影下拍照。与正常对照相比，有异常泳动条带者判断为基因突变。
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图1 扩增p16基因Exon2片段大小及相应部位示意图
结 果
1 p16蛋白表达情况 阳性表达的肺癌细胞，其棕色颗粒主要分布在核内，亦见部分胞质被染成棕色。支气管扩张症正常肺组织胞质被染成浅黄色，其中尘细胞着色重。(见插页第1页图5)
图5 p16蛋白在NSCLC中免疫组化结果
A：肺鳞癌细胞核阳性着色 B.肺鳞癌中p16蛋白表达缺失
图6 p16基因Exon 2 PCR产物SSCP分析图谱
1～2：支气管扩张症，肺组织标本，SSCP阴性，3～4，6～10：肺癌标本，SSCP阴性
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5：肺癌标本，SSCP阳性 SS：DNA变性单链 ds:DNA变性残留双链
2 p16蛋白表达缺失率与癌细胞分化程度及淋巴结转移的关系。有淋巴结转移的非小细胞肺癌p16蛋白表达缺失率显著高于无淋巴结转移者；低分化肺癌p16蛋白表达缺失率显著高于中、高分化者。腺癌与鳞癌p16蛋白缺失率无显著差异(见表2)。
表2 48例非小细胞肺癌中p16基因失活情况 类别
例数
p16蛋白表达
缺失例数(%)
p16基因突变
例数(%)
非小细胞肺癌
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48
25(52.1)
2(4.2)
鳞癌
28
17(60.7)
2(7.1)
腺癌
16
8(50)
0(0)
鳞腺癌
3
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0
0(0)
大细胞癌
1
1
0(0)
转移情况
有淋巴结转移
22
18(81.8)*
2(9.9)
无淋巴结转移
26
, 百拇医药
7(26.9)
0(0)
分化程度
高、中分化
30
12(40)*
1(3.3)
低分化
18
13(72.2)
1(5.5)
年龄
<60岁
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31
14(45.2)
2(6.5)
≥60岁
17
8(47.1)
0(0)
性别
男
32
15(46.9)
1(3.1)
女
, 百拇医药
16
7(43.8)
1(6.3)
*与相应组别比较P<0.05
3. p16基因突变情况 第二外显子上游区扩增产物有1例显示异常泳动条带，下游区有1例异常(见插见第1页图6)。2例标本均为有淋巴结转移的肺癌。p16基因第二外显子突变与肺癌的分化程度及淋巴转移未见显著相关性。
讨 论
抑癌基因p16编码的p16蛋白又称INK4，它与cyclin D竞争结合CDK或CDK6，从而抑制cyclin D-CDK4或cyclin D-CDK6复合物形成，阻碍细胞从G1期到S期的转渡，对细胞周期的运转进行负调控[3]。p16基因失活可导致肿瘤的形成。p16基因失活机制有多种：纯合性缺失、基因突变、5’CpG岛异常甲基化等[4]。本文资料显示，25例非小细胞肺癌p16蛋白表达缺失(25/48)，其中2例发生基因突变，为表达缺失者的8%(2/25)，由此可见，在非小细胞肺癌中，基因突变不是p16表达失活的主要机制。针对p16基因失活的多种方式，相应的分析技术有：Southern blotting，PCR-SSCP，DNA测序以及甲基化-PCR[5]等。这些分子生物学手段多样而繁琐，但仍难以真正判断p16基因的状态和功能。免疫组化方法相对集特异性和敏感性为一体，更全面地、最终地反映p16基因在肿瘤组织中改变的性质。本研究用免疫组化方法可以区分肿瘤细胞和正常细胞p16蛋白的表达，并发现非小细胞肺癌中p16蛋白的表达缺失率基本上与荧光原位杂交结果相吻合[6]。
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本资料显示p16蛋白主要位于细胞核，但也有少部分细胞质着色而胞核不着色，说明胞质也可能存在p16蛋白。以支气管扩张症肺组织作正常对照，染色结果表明正常肺组织p16蛋白表达水平较低，而在某些染色阳性的肺癌组织中则观察到胞核深染，Shapiro认为这是正常组织野生型Rb基因抑制了p16基因的表达[7]。结合目前对p16基因的研究，可解释如下：p16蛋白的表达与细胞周期密切相关。p16基因有三个外显子E1、E2、E3。其中E1又分为E1α和E1β，可分别与E2、E3组成不同的阅读框架，即p16有两种RNA：α-mRNA和β-mRNA。这两种转录子在细胞周期不同时相中比率不同，在G0期β构成低，进入S期β：α上升，p16基因表达水平达到高峰，可高至原来的10倍[8]。β-mRNA在体内可能不翻译，但参与p16蛋白翻译调控。所以，在终末分化的正常肺组织中，p16表达量很低，而在增殖旺盛的癌组织中，野生型p16基因反而可以高度表达。
, 百拇医药
本实验结果发现，p16蛋白表达缺失率与非小细胞肺癌的组织学分型无关，与患者的年龄、性别无关，但是低分化非小细胞肺癌的p16蛋白表达缺失率显著高于中、高分化者。提示p16蛋白表达缺失与癌细胞分化程度相关。有文献报道神经胶质瘤的分化程度与p16基因表达缺失相关[9]，甲状腺癌的恶性程度也与p16基因缺失有一定的联系[9]。这可理解为：p16基因失活导致细胞增殖失控，失去正常分化能力。因此，p16基因失活有可能作为判断肿瘤细胞恶性程度的标志。
在所检测的非小细胞肺癌中，伴有淋巴结转移者的p16蛋白表达缺失率显著高于无淋巴结转移者，并且2例有基因突变的非小细胞肺癌皆有淋巴结转移。提示p16基因改变与肺癌淋巴结转移有关。Maesawa等[10]发现食管癌中p16基因缺失和甲基化与癌细胞的淋巴结转移和肌层浸润密切相关。Hsu等[11]认为p16基因和nm23基因与肿瘤转移有关。他发现肺癌CH27细胞中p16蛋白表达水平随该细胞转移活性的降低而下调。p16是否是一种肿瘤转移抑制基因?这尚需进一步研究。但有一点勿庸置疑，由于p16基因失活与非小细胞肺癌淋巴结转移密切相关，p16基因状态检测可用来评估肺癌病人的预后。
, 百拇医药
第一作者简介 石永玉，男，硕士，助教。
参 考 文 献
1 Kamb A, Gruis NA, Weaver-Feldhaus J, et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science, 1994, 264:436
2 Hayashi N, Sugimoto Y, Tsuchiya E, et al. Somatic mutations of the MTS (multiple tumor suppressor)1/CDK4I(cyclin-dependent kinase-4 inhibitor) gene in human primary non-small cell lung carcinomas. Biochem Biophys Res Commun, 1994, 202:1426
, 百拇医药
3 Serrano M, Hannon GJ, Beach D. A new regulatory modify in cell cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK. Nature, 1993, 336:704
4 Reed AL, Califano J, Cairns P, et al. High frequency of p16(CDKN2/MTS-1/INK4A)inactivation in head and neck squamons cell carcinoma. Cancer Res, 1996, 56:3630
5 Herman JG, Craff JR,
S, et al. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93:9821
, 百拇医药
6 Xiao S, Li D, Corson JM, et al. Codeletion of P15 and p16 genes in primary non-small cell lung carcinoma. Cancer Res, 1995, 55:2968
7 Shapiro GI, Edwards CD, Kobzik L, et al. Reciprocal Rb inactivation and p16 INK4 expression in primary lung cancers and cell lines. Cancer Res, 1995, 55:505
8 Stone S, Jiang P, Dayananth P, et al. Complex structure and regulation of the p16(MTS1)locus. Cancer Res, 1995, 55:2988
, 百拇医药
9 Tung WS, Shevlin DW, Bartsch D, et al. Infrequent CDKN2 mutation human differentiated thyroid cancer. Mol Carcinog, 1996,15:5
10 Maesawa C, Tamura G, Nishizuka S, et al. Inactivation of the CDKN2 gene by homozygous deletion and de novo methylation is associated with advanced stage esophageal squamous cell carcinoma. Cancer Res, 1996, 56:3875
11 Hsu JW, Hsu SL, Chu JJ, et al. Increased NM23：MTS1 ratio inversely correlated with metastasis behaviour in human lung squamous cell carcinoma. Anticancer Res, 1997, 17:407
(收稿：1998-03-30 修回：1998-06-26), 百拇医药
单位：山东省医学科学院基础所微生物室(济南250062)
关键词：癌，非小细胞肺；基因p16；突变
肿瘤990109 1994年Kamb等[1]在人染色体9p21发现一个新的抑癌基因p16，由于该基因在多种类型肿瘤细胞株中频繁缺失，成为近年来肿瘤分子生物学的研究热点。在人原发性非小细胞肺癌中，p16基因失活被认为与肿瘤的发生密切相关[2]。作者采用免疫组化技术和PCR-SSCP方法，分析人原发性非小细胞肺癌中p16基因突变和蛋白表达缺失情况，着重探讨p16基因失活与肺癌的分化程度及淋巴结转移的关系。
材料与方法
1.标本 1995～1997年48例非小细胞肺癌病理存档蜡块标本，由山东省医科院病理室提供，其中22例有淋巴结转移，中、高分化者30例，低分化者18例。并用3例支气管扩张症蜡块标本作良性对照。
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2.SABC-免疫组化染色 鼠抗p16蛋白单克隆抗体为Neomarker公司产品，工作效价1：50。SABC免疫组化试剂盒购于武汉博士德公司。常规石蜡切片梯度酒精脱蜡至水，然后按试剂盒说明书进行操作，最后苏木素复染，酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。同时用支气管扩张症手术标本作正常对照，分别以PBS、正常鼠血清代替一抗作为空白对照和替代对照，以细胞核或细胞浆染成棕黄色作为阳性判定标准。
3.DNA提取及PCR扩增，取石蜡切片3～5片置于二甲苯中脱蜡24 h，其间不时摇动并换液3次。然后按照宝灵曼公司提供的DNA提取试剂盒的说明书操作。因p16基因约90%的突变见于Exon2，故本实验选用扩增p16基因第二外显子的上游区和下游区2对引物，由华美公司合成(见图1、表1)。PCR扩增程序：50 μl反应体系，引物200 pmol，dNTP 10 nmol，1%二甲亚砜，样品0.2 μg。95℃预变性5分钟，然后加入taq酶2 U，接着94℃ 50秒，56℃或58℃(表1)40秒，72℃ 50秒，循环30次，最后72℃保温7分钟。
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表1 p16基因Exon 2引物序列 外显子
引物序列
片段大小(bp)
复性温度(℃)
p16上游区1
5’ACAAGCTTCCTTTCCGTCATGC3’
p16上游区2
5’CCAGGCATCGCGCACGTCCA3’
244
58
p16下游区1
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5’TTCCTGGACACGCTGGTGGT3；
p16下游区2
5’TCTGAGCTTTGGAAGCTCT3’
240
56
4.SSCP银染分析：取10 μl PCR扩增产物，加入10 μl甲酰胺变性液，混匀，95℃变性5分钟，冰上骤冷5分钟，上样8%非变性聚丙烯酰胺凝胶(49：1)，1×TBE为电泳缓冲液，5 mA恒电流4℃电泳12～16小时。取下凝胶，于10%乙醇中固定5分钟，然后1%硝酸溶液中脱色3分钟，蒸馏漂洗3×2分钟，置于1%硝酸银染液中摇动染色20分钟，蒸馏水漂洗30秒，30%碳酸钠-0.01%福尔马林显影液显影，最后用10%乙酸溶液适时中止反应。置凝胶于白色背影下拍照。与正常对照相比，有异常泳动条带者判断为基因突变。
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图1 扩增p16基因Exon2片段大小及相应部位示意图
结 果
1 p16蛋白表达情况 阳性表达的肺癌细胞，其棕色颗粒主要分布在核内，亦见部分胞质被染成棕色。支气管扩张症正常肺组织胞质被染成浅黄色，其中尘细胞着色重。(见插页第1页图5)
图5 p16蛋白在NSCLC中免疫组化结果
A：肺鳞癌细胞核阳性着色 B.肺鳞癌中p16蛋白表达缺失
图6 p16基因Exon 2 PCR产物SSCP分析图谱
1～2：支气管扩张症，肺组织标本，SSCP阴性，3～4，6～10：肺癌标本，SSCP阴性
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5：肺癌标本，SSCP阳性 SS：DNA变性单链 ds:DNA变性残留双链
2 p16蛋白表达缺失率与癌细胞分化程度及淋巴结转移的关系。有淋巴结转移的非小细胞肺癌p16蛋白表达缺失率显著高于无淋巴结转移者；低分化肺癌p16蛋白表达缺失率显著高于中、高分化者。腺癌与鳞癌p16蛋白缺失率无显著差异(见表2)。
表2 48例非小细胞肺癌中p16基因失活情况 类别
例数
p16蛋白表达
缺失例数(%)
p16基因突变
例数(%)
非小细胞肺癌
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48
25(52.1)
2(4.2)
鳞癌
28
17(60.7)
2(7.1)
腺癌
16
8(50)
0(0)
鳞腺癌
3
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0
0(0)
大细胞癌
1
1
0(0)
转移情况
有淋巴结转移
22
18(81.8)*
2(9.9)
无淋巴结转移
26
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7(26.9)
0(0)
分化程度
高、中分化
30
12(40)*
1(3.3)
低分化
18
13(72.2)
1(5.5)
年龄
<60岁
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14(45.2)
2(6.5)
≥60岁
17
8(47.1)
0(0)
性别
男
32
15(46.9)
1(3.1)
女
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16
7(43.8)
1(6.3)
*与相应组别比较P<0.05
3. p16基因突变情况 第二外显子上游区扩增产物有1例显示异常泳动条带，下游区有1例异常(见插见第1页图6)。2例标本均为有淋巴结转移的肺癌。p16基因第二外显子突变与肺癌的分化程度及淋巴转移未见显著相关性。
讨 论
抑癌基因p16编码的p16蛋白又称INK4，它与cyclin D竞争结合CDK或CDK6，从而抑制cyclin D-CDK4或cyclin D-CDK6复合物形成，阻碍细胞从G1期到S期的转渡，对细胞周期的运转进行负调控[3]。p16基因失活可导致肿瘤的形成。p16基因失活机制有多种：纯合性缺失、基因突变、5’CpG岛异常甲基化等[4]。本文资料显示，25例非小细胞肺癌p16蛋白表达缺失(25/48)，其中2例发生基因突变，为表达缺失者的8%(2/25)，由此可见，在非小细胞肺癌中，基因突变不是p16表达失活的主要机制。针对p16基因失活的多种方式，相应的分析技术有：Southern blotting，PCR-SSCP，DNA测序以及甲基化-PCR[5]等。这些分子生物学手段多样而繁琐，但仍难以真正判断p16基因的状态和功能。免疫组化方法相对集特异性和敏感性为一体，更全面地、最终地反映p16基因在肿瘤组织中改变的性质。本研究用免疫组化方法可以区分肿瘤细胞和正常细胞p16蛋白的表达，并发现非小细胞肺癌中p16蛋白的表达缺失率基本上与荧光原位杂交结果相吻合[6]。
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本资料显示p16蛋白主要位于细胞核，但也有少部分细胞质着色而胞核不着色，说明胞质也可能存在p16蛋白。以支气管扩张症肺组织作正常对照，染色结果表明正常肺组织p16蛋白表达水平较低，而在某些染色阳性的肺癌组织中则观察到胞核深染，Shapiro认为这是正常组织野生型Rb基因抑制了p16基因的表达[7]。结合目前对p16基因的研究，可解释如下：p16蛋白的表达与细胞周期密切相关。p16基因有三个外显子E1、E2、E3。其中E1又分为E1α和E1β，可分别与E2、E3组成不同的阅读框架，即p16有两种RNA：α-mRNA和β-mRNA。这两种转录子在细胞周期不同时相中比率不同，在G0期β构成低，进入S期β：α上升，p16基因表达水平达到高峰，可高至原来的10倍[8]。β-mRNA在体内可能不翻译，但参与p16蛋白翻译调控。所以，在终末分化的正常肺组织中，p16表达量很低，而在增殖旺盛的癌组织中，野生型p16基因反而可以高度表达。
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本实验结果发现，p16蛋白表达缺失率与非小细胞肺癌的组织学分型无关，与患者的年龄、性别无关，但是低分化非小细胞肺癌的p16蛋白表达缺失率显著高于中、高分化者。提示p16蛋白表达缺失与癌细胞分化程度相关。有文献报道神经胶质瘤的分化程度与p16基因表达缺失相关[9]，甲状腺癌的恶性程度也与p16基因缺失有一定的联系[9]。这可理解为：p16基因失活导致细胞增殖失控，失去正常分化能力。因此，p16基因失活有可能作为判断肿瘤细胞恶性程度的标志。
在所检测的非小细胞肺癌中，伴有淋巴结转移者的p16蛋白表达缺失率显著高于无淋巴结转移者，并且2例有基因突变的非小细胞肺癌皆有淋巴结转移。提示p16基因改变与肺癌淋巴结转移有关。Maesawa等[10]发现食管癌中p16基因缺失和甲基化与癌细胞的淋巴结转移和肌层浸润密切相关。Hsu等[11]认为p16基因和nm23基因与肿瘤转移有关。他发现肺癌CH27细胞中p16蛋白表达水平随该细胞转移活性的降低而下调。p16是否是一种肿瘤转移抑制基因?这尚需进一步研究。但有一点勿庸置疑，由于p16基因失活与非小细胞肺癌淋巴结转移密切相关，p16基因状态检测可用来评估肺癌病人的预后。
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第一作者简介 石永玉，男，硕士，助教。
参 考 文 献
1 Kamb A, Gruis NA, Weaver-Feldhaus J, et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science, 1994, 264:436
2 Hayashi N, Sugimoto Y, Tsuchiya E, et al. Somatic mutations of the MTS (multiple tumor suppressor)1/CDK4I(cyclin-dependent kinase-4 inhibitor) gene in human primary non-small cell lung carcinomas. Biochem Biophys Res Commun, 1994, 202:1426
, 百拇医药
3 Serrano M, Hannon GJ, Beach D. A new regulatory modify in cell cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK. Nature, 1993, 336:704
4 Reed AL, Califano J, Cairns P, et al. High frequency of p16(CDKN2/MTS-1/INK4A)inactivation in head and neck squamons cell carcinoma. Cancer Res, 1996, 56:3630
5 Herman JG, Craff JR,
S, et al. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93:9821, 百拇医药
6 Xiao S, Li D, Corson JM, et al. Codeletion of P15 and p16 genes in primary non-small cell lung carcinoma. Cancer Res, 1995, 55:2968
7 Shapiro GI, Edwards CD, Kobzik L, et al. Reciprocal Rb inactivation and p16 INK4 expression in primary lung cancers and cell lines. Cancer Res, 1995, 55:505
8 Stone S, Jiang P, Dayananth P, et al. Complex structure and regulation of the p16(MTS1)locus. Cancer Res, 1995, 55:2988
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9 Tung WS, Shevlin DW, Bartsch D, et al. Infrequent CDKN2 mutation human differentiated thyroid cancer. Mol Carcinog, 1996,15:5
10 Maesawa C, Tamura G, Nishizuka S, et al. Inactivation of the CDKN2 gene by homozygous deletion and de novo methylation is associated with advanced stage esophageal squamous cell carcinoma. Cancer Res, 1996, 56:3875
11 Hsu JW, Hsu SL, Chu JJ, et al. Increased NM23：MTS1 ratio inversely correlated with metastasis behaviour in human lung squamous cell carcinoma. Anticancer Res, 1997, 17:407
(收稿：1998-03-30 修回：1998-06-26), 百拇医药