非小细胞肺癌中3p14的杂合性丢失的研究
作者：陆明华 许凯黎 关赛芳 周 瑾 陈复华
单位：上海市肿瘤研究所(上海 200032)
关键词：肺肿瘤；癌，非小细胞肺；染色体缺失；染色体，人，3对
肿瘤990102 目的 探讨非小细胞肺癌(NSCLC)细胞中3p14位点等位基因的杂合性丢失(loss of heterozygosity,LOH)与NSCLC发生及发展之间的相关性。 方法 采用PCR结合二核苷酸重复序列多态性方法并经LOH-银染法检测74例非小细胞肺癌新鲜手术切除标本。 结果 74例NSCLC组织中31例出现3p14 LOH，总丢失率为43.2%；其中鳞癌的杂合性丢失为14例(38.9%，14/36)，腺癌为13例(44.8%，13/29)，3p14杂合性丢失在Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ期NSCLC中分别为31.6%(6/19)，42.9%(9/21)，47.4%(16/34)，而正常肺组织未见3p14 LOH。结论 3p14杂合性丢失普遍出现于NSCLC中，提示该位点可能存在着一个或多个抑癌基因，因此3p14丢失可能与肺癌的发生及发展相关。
, http://www.100md.com
STUDY ON LOSS OF HETEROZYGOSITY OF 3p14
IN NON-SMALL CELL LUNG CANCER
Lu Minghua,Xu Kaili,Guan Saifang,et al.
Shanghai Cancer Institute,Shanghai 200032
Objective：To investigate the relationship between loss of heterozygosity (LOH) of the allele gene at 3p14 and the pathogenesis of NSCLC.Methods：Using polymerase chain reaction-based assays for dinucleotide repeat polymorphisms and silver stain to analyze allele loss of 3p14 in 74 cases of NSCLC tissue samples.Results：31 out of 74 cases (43.2%) with NSCLC had LOH at 3p14 locus including 14 out of 36 (38.9%) with squamous carcinoma and 13 out of 29(44.8%) with adenocarcinoma,while none was detected in normal lung tissue.The rates of 3p14 LOH in patients with stage Ⅰ,Ⅱ and Ⅲ were 31.6%(6/19),42.9%(9/21) and 47.4%(16/34) respectively.Conclusion：Since deletion at 3p14 occurs commonly in human NSCLC,it seems that there is one or more tumor suppressor gene at 3p14 locus.The LOH of 3p14 may be associated with the pathogenesis of NSCLC。
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Key words Lung neoplasms Carcinoma，non-small cell lung Chromosomes deletion Chromosomes human,pair 3
肿瘤的分子生物学研究表明肺癌的发生发展是一多因子多步骤的复杂生物学过程，其与癌基因的激活与抑癌基因的失活相关，其中以抑癌基因的失活在肺癌癌变过程前期阶段所起的作用尤为突出。近年的研究表明，非小细胞肺癌中常出现染色体区域中等位基因的杂合性丢失(loss of heterozygosity,LOH),其中包括2p,3p,9p,11p,17p及19p，而3p的部分遗传物质的丢失则是肺癌中最常见的分子变化现象，因此普遍认为在这些丢失区域中可能存在抑癌基因(tumor suppressor gene,TSG)。由于3p丢失的主要区域为3p25，3p21.3及3p14-cen[1]，故推测这几个区域都分别存在一个或多个抑癌基因。Hung等[2]曾采用PCR结合二核苷酸重复排列多态性的方法，通过肺癌组织显微解剖技术来分析癌组织，癌旁组织及间质正常组织中各部位的3p杂合丢失情况，结果发现3p等位基因的丢失在肺癌发生的癌前期最为常见。显然,3p等位基因杂合性丢失可作为一种重要的肿瘤生物标志，对其研究将有助于揭示人体肺癌发生发展的分子机理，并可结合临床应用以作为治疗预后的指标。为此本文采用PCR-LOH银染技术检测，拟探讨经病理证实的74例不同类型和不同分期的NSCLC组织中3p14的LOH。
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材料与方法
一、组织标本
74例手术切除新鲜肺癌组织标本由上海市胸科医院和上海市第一肺科医院提供，其中鳞癌36例，腺癌29例，腺鳞混合癌9例，以及正常胎肺组织4例。
二、提取DNA
按常规方法提取组织中DNA，并经紫外分光光度计测定其含量，取0.3 μg作为模板。
三、PCR
引物由中科院细胞所合成，其序列如下：
sense:TCCTTAACTCTTTCTCTGTGAGTTG
antisense:TCTAGGAAAGGGATTAGGAAGGA
, 百拇医药
反应体积50 μl，其中含25 μmol/L引物，dNTP各200 μmol/L，模板DNA 0.3 μg，Taq酶 2 U。反应程序为94 ℃ 5 min预变性后，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30s，循环35次后，72 ℃延伸5 min，取10 μl PCR产物进行电泳(2.5% Agarose)，紫外灯下观察是否有带，以确证扩增完好。
四、LOH分析
(1)取10 μl PCR产物加等体积变性加样液(95%甲酰胺，20 mmol/L EDTA，5 mmol/L氢氧化钠，0.5%二甲苯蓝，0.05%溴酚蓝)，95 ℃变性8 min，立即于冰浴中骤冷，再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(10%，含5.6 mol/L尿素)，以溴酚蓝为电泳指示剂。
(2)将胶板进行固定，染色，显色。
(3)将凝胶置玻璃纸内，室温干燥保存，分析结果并照相。
, 百拇医药
结 果
一、经PCR-LOH检测74例NSCLC组织，发现有31例出现3p14位置上的LOH，丢失率为43.2%，而4例正常胎肺组织中则均无丢失。附图为PCR产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染后，显示3p14杂合性丢失。
附图 人体非小细胞肺癌3p14杂合性丢失的PCR产物电泳图
1号为正常胎肺组织，2～6号为肺癌组织，其中3～6出现3p14 LOH丢失
二、不同分期NSCLC组织中3p14的LOH(见表1)
表1 不同分期NSCLC患者组织中3p14的杂合性丢失 期 别
例 数
, 百拇医药
3p14 LOH
例 数
%
Ⅰ
19
6
31.6
Ⅱ
21
9
42.9
Ⅲ
34
16
, 百拇医药
47.4
总 计
74
31
43.2
三、不同类型NSCLC组织中3p14的LOH(见表2)表2 不同类型NSCLC患者组织中3p14的杂合性丢失 分 型
例 数
3p14 LOH
例 数
%
腺 癌
29
, 百拇医药
13
44.8
鳞 癌
36
14
38.9
腺鳞混合癌
9
4
44.4
总 计
74
31
, 百拇医药 43.2
讨 论
肿瘤的发生是由于细胞的增殖与分化的失常，一旦细胞分裂增加而分化或死亡减少时，未分化的终极细胞数相应增多，并出现了恶性生长现象。细胞的增殖在正常情况下受许多信息调控，处于增殖与抑制的动态平衡状态，而调控失去平衡则引起不正常增殖。癌基因和抑癌基因直接参与肿瘤的发生，它们的产物对细胞的增殖分别起着正负调节作用。这两类基因中的任何一类或共同作用下，即可导致细胞癌变[3]。
大量资料表明人体非小细胞肺癌与细胞遗传物质异常有关，其中包括染色体的重排，移位及丢失等。Minna[4]首次从分子病理学角度提出肺癌的发生及发展涉及一系列分子变异，首先细胞增生时出现3p等位基因丢失，其次在细胞间变时位于9p的某些基因丢失，最后是ras基因和p53基因突变导致原位癌的发生。目前国际上有多个小组对此进行了研究，且着重点在采用细胞株对3p位置上可能存在的抑癌基因进行克隆。Todd[5]等报道在3p21.3克隆了一个80 kb的片段，它能在体外抑制肿瘤的生长 ；Ong等[6]则在3p14.2位处克隆了新的候选抑癌基因FHIT，并能在肿瘤细胞株中影响转录功能。关赛芳等[7]曾检测了158例NSCLC新鲜手术标本中3p25的杂合性丢失，总丢失率达50.6%。
, 百拇医药
本研究采用PCR结合二核苷酸重复序列多态性方法并经LOH-银染，检测74例NSCLC的3p14位点上等位基因杂合性丢失，结果发现31例出现LOH，总丢失率为43.2%，而正常胎肺均未见LOH，提示中国人NSCLC的发生、发展与3p14位点的杂合性丢失关系密切。本文结果还表明肺腺癌杂合性丢失率为44.8%，高于鳞癌(38.9%)，但两者无显著性差异。3p14杂合性与NSCLC临床分期关系亦不明显，Ⅰ期31.6%，Ⅱ期42.9%，Ⅲ期47.4%，这与国外报道基本相符。本研究说明3p14杂合性普遍存在NSCLC中，并推测该位点存在着抑癌基因，该位点上基因的丢失或失活有可能导致肺癌的发生。3p的LOH不仅在肺癌中存在，在其它肿瘤如乳腺癌及肾癌中也有出现，说明其为广谱的抑癌基因。至于3p基因丢失的机理，已有几种假说，但均未经证实，还有待今后深入探讨。
第一作者简介 陆明华，女，硕士，实习研究员。
参 考 文 献
, 百拇医药
1 Hibi K,Takahashi T,Yamakawa K, et al.Three distinct regions involve in 3p deletion in human lung cancer.Oncogene，1992,7:445
2 Hung T,Kishimoto Y,Sugio K,et al.Allele-specific chromosome 3p deletion occur at an early stage in the pathogenesis of lung carcinoma.JAMA 1995;273(7):558
3 Bishop JM.Molecular themes in the oncogenes.Cell，1991,64:235～248
4 Minna D.Tumor suppressor genes and oncogenes in lung cancer:potential clinical applications.Advan Oncol，1996,12(1):3
, http://www.100md.com
5 Todd MC,Xiang RH,Garcia DK, et al. An 80 kb P1 clone from chromosome 3p21.3 suppresses tumor growth in vivo.Oncogene，1996,13:2387
6 Ong ST,Fong KM,Bader SA, et al. Precise localization of the FHIT gene to the common fragile site at 3p1.2 (FRA3B) and characterization of homozygous deletions within FRA3B that effect FHIT transcription in tumor cell lines.Genes,Chromosome Cancer,1997，20：16
7 关赛芳，许凯黎，廖美琳等.非小细胞肺癌中3p25杂合性丢失研究.肿瘤，1997，17(6)：439
(收稿：1998-06-18 修回：1998-09-17), http://www.100md.com
单位：上海市肿瘤研究所(上海 200032)
关键词：肺肿瘤；癌，非小细胞肺；染色体缺失；染色体，人，3对
肿瘤990102 目的 探讨非小细胞肺癌(NSCLC)细胞中3p14位点等位基因的杂合性丢失(loss of heterozygosity,LOH)与NSCLC发生及发展之间的相关性。 方法 采用PCR结合二核苷酸重复序列多态性方法并经LOH-银染法检测74例非小细胞肺癌新鲜手术切除标本。 结果 74例NSCLC组织中31例出现3p14 LOH，总丢失率为43.2%；其中鳞癌的杂合性丢失为14例(38.9%，14/36)，腺癌为13例(44.8%，13/29)，3p14杂合性丢失在Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ期NSCLC中分别为31.6%(6/19)，42.9%(9/21)，47.4%(16/34)，而正常肺组织未见3p14 LOH。结论 3p14杂合性丢失普遍出现于NSCLC中，提示该位点可能存在着一个或多个抑癌基因，因此3p14丢失可能与肺癌的发生及发展相关。
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STUDY ON LOSS OF HETEROZYGOSITY OF 3p14
IN NON-SMALL CELL LUNG CANCER
Lu Minghua,Xu Kaili,Guan Saifang,et al.
Shanghai Cancer Institute,Shanghai 200032
Objective：To investigate the relationship between loss of heterozygosity (LOH) of the allele gene at 3p14 and the pathogenesis of NSCLC.Methods：Using polymerase chain reaction-based assays for dinucleotide repeat polymorphisms and silver stain to analyze allele loss of 3p14 in 74 cases of NSCLC tissue samples.Results：31 out of 74 cases (43.2%) with NSCLC had LOH at 3p14 locus including 14 out of 36 (38.9%) with squamous carcinoma and 13 out of 29(44.8%) with adenocarcinoma,while none was detected in normal lung tissue.The rates of 3p14 LOH in patients with stage Ⅰ,Ⅱ and Ⅲ were 31.6%(6/19),42.9%(9/21) and 47.4%(16/34) respectively.Conclusion：Since deletion at 3p14 occurs commonly in human NSCLC,it seems that there is one or more tumor suppressor gene at 3p14 locus.The LOH of 3p14 may be associated with the pathogenesis of NSCLC。
, http://www.100md.com
Key words Lung neoplasms Carcinoma，non-small cell lung Chromosomes deletion Chromosomes human,pair 3
肿瘤的分子生物学研究表明肺癌的发生发展是一多因子多步骤的复杂生物学过程，其与癌基因的激活与抑癌基因的失活相关，其中以抑癌基因的失活在肺癌癌变过程前期阶段所起的作用尤为突出。近年的研究表明，非小细胞肺癌中常出现染色体区域中等位基因的杂合性丢失(loss of heterozygosity,LOH),其中包括2p,3p,9p,11p,17p及19p，而3p的部分遗传物质的丢失则是肺癌中最常见的分子变化现象，因此普遍认为在这些丢失区域中可能存在抑癌基因(tumor suppressor gene,TSG)。由于3p丢失的主要区域为3p25，3p21.3及3p14-cen[1]，故推测这几个区域都分别存在一个或多个抑癌基因。Hung等[2]曾采用PCR结合二核苷酸重复排列多态性的方法，通过肺癌组织显微解剖技术来分析癌组织，癌旁组织及间质正常组织中各部位的3p杂合丢失情况，结果发现3p等位基因的丢失在肺癌发生的癌前期最为常见。显然,3p等位基因杂合性丢失可作为一种重要的肿瘤生物标志，对其研究将有助于揭示人体肺癌发生发展的分子机理，并可结合临床应用以作为治疗预后的指标。为此本文采用PCR-LOH银染技术检测，拟探讨经病理证实的74例不同类型和不同分期的NSCLC组织中3p14的LOH。
, http://www.100md.com
材料与方法
一、组织标本
74例手术切除新鲜肺癌组织标本由上海市胸科医院和上海市第一肺科医院提供，其中鳞癌36例，腺癌29例，腺鳞混合癌9例，以及正常胎肺组织4例。
二、提取DNA
按常规方法提取组织中DNA，并经紫外分光光度计测定其含量，取0.3 μg作为模板。
三、PCR
引物由中科院细胞所合成，其序列如下：
sense:TCCTTAACTCTTTCTCTGTGAGTTG
antisense:TCTAGGAAAGGGATTAGGAAGGA
, 百拇医药
反应体积50 μl，其中含25 μmol/L引物，dNTP各200 μmol/L，模板DNA 0.3 μg，Taq酶 2 U。反应程序为94 ℃ 5 min预变性后，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30s，循环35次后，72 ℃延伸5 min，取10 μl PCR产物进行电泳(2.5% Agarose)，紫外灯下观察是否有带，以确证扩增完好。
四、LOH分析
(1)取10 μl PCR产物加等体积变性加样液(95%甲酰胺，20 mmol/L EDTA，5 mmol/L氢氧化钠，0.5%二甲苯蓝，0.05%溴酚蓝)，95 ℃变性8 min，立即于冰浴中骤冷，再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(10%，含5.6 mol/L尿素)，以溴酚蓝为电泳指示剂。
(2)将胶板进行固定，染色，显色。
(3)将凝胶置玻璃纸内，室温干燥保存，分析结果并照相。
, 百拇医药
结 果
一、经PCR-LOH检测74例NSCLC组织，发现有31例出现3p14位置上的LOH，丢失率为43.2%，而4例正常胎肺组织中则均无丢失。附图为PCR产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染后，显示3p14杂合性丢失。
附图 人体非小细胞肺癌3p14杂合性丢失的PCR产物电泳图
1号为正常胎肺组织，2～6号为肺癌组织，其中3～6出现3p14 LOH丢失
二、不同分期NSCLC组织中3p14的LOH(见表1)
表1 不同分期NSCLC患者组织中3p14的杂合性丢失 期 别
例 数
, 百拇医药
3p14 LOH
例 数
%
Ⅰ
19
6
31.6
Ⅱ
21
9
42.9
Ⅲ
34
16
, 百拇医药
47.4
总 计
74
31
43.2
三、不同类型NSCLC组织中3p14的LOH(见表2)表2 不同类型NSCLC患者组织中3p14的杂合性丢失 分 型
例 数
3p14 LOH
例 数
%
腺 癌
29
, 百拇医药
13
44.8
鳞 癌
36
14
38.9
腺鳞混合癌
9
4
44.4
总 计
74
31
, 百拇医药 43.2
讨 论
肿瘤的发生是由于细胞的增殖与分化的失常，一旦细胞分裂增加而分化或死亡减少时，未分化的终极细胞数相应增多，并出现了恶性生长现象。细胞的增殖在正常情况下受许多信息调控，处于增殖与抑制的动态平衡状态，而调控失去平衡则引起不正常增殖。癌基因和抑癌基因直接参与肿瘤的发生，它们的产物对细胞的增殖分别起着正负调节作用。这两类基因中的任何一类或共同作用下，即可导致细胞癌变[3]。
大量资料表明人体非小细胞肺癌与细胞遗传物质异常有关，其中包括染色体的重排，移位及丢失等。Minna[4]首次从分子病理学角度提出肺癌的发生及发展涉及一系列分子变异，首先细胞增生时出现3p等位基因丢失，其次在细胞间变时位于9p的某些基因丢失，最后是ras基因和p53基因突变导致原位癌的发生。目前国际上有多个小组对此进行了研究，且着重点在采用细胞株对3p位置上可能存在的抑癌基因进行克隆。Todd[5]等报道在3p21.3克隆了一个80 kb的片段，它能在体外抑制肿瘤的生长 ；Ong等[6]则在3p14.2位处克隆了新的候选抑癌基因FHIT，并能在肿瘤细胞株中影响转录功能。关赛芳等[7]曾检测了158例NSCLC新鲜手术标本中3p25的杂合性丢失，总丢失率达50.6%。
, 百拇医药
本研究采用PCR结合二核苷酸重复序列多态性方法并经LOH-银染，检测74例NSCLC的3p14位点上等位基因杂合性丢失，结果发现31例出现LOH，总丢失率为43.2%，而正常胎肺均未见LOH，提示中国人NSCLC的发生、发展与3p14位点的杂合性丢失关系密切。本文结果还表明肺腺癌杂合性丢失率为44.8%，高于鳞癌(38.9%)，但两者无显著性差异。3p14杂合性与NSCLC临床分期关系亦不明显，Ⅰ期31.6%，Ⅱ期42.9%，Ⅲ期47.4%，这与国外报道基本相符。本研究说明3p14杂合性普遍存在NSCLC中，并推测该位点存在着抑癌基因，该位点上基因的丢失或失活有可能导致肺癌的发生。3p的LOH不仅在肺癌中存在，在其它肿瘤如乳腺癌及肾癌中也有出现，说明其为广谱的抑癌基因。至于3p基因丢失的机理，已有几种假说，但均未经证实，还有待今后深入探讨。
第一作者简介 陆明华，女，硕士，实习研究员。
参 考 文 献
, 百拇医药
1 Hibi K,Takahashi T,Yamakawa K, et al.Three distinct regions involve in 3p deletion in human lung cancer.Oncogene，1992,7:445
2 Hung T,Kishimoto Y,Sugio K,et al.Allele-specific chromosome 3p deletion occur at an early stage in the pathogenesis of lung carcinoma.JAMA 1995;273(7):558
3 Bishop JM.Molecular themes in the oncogenes.Cell，1991,64:235～248
4 Minna D.Tumor suppressor genes and oncogenes in lung cancer:potential clinical applications.Advan Oncol，1996,12(1):3
, http://www.100md.com
5 Todd MC,Xiang RH,Garcia DK, et al. An 80 kb P1 clone from chromosome 3p21.3 suppresses tumor growth in vivo.Oncogene，1996,13:2387
6 Ong ST,Fong KM,Bader SA, et al. Precise localization of the FHIT gene to the common fragile site at 3p1.2 (FRA3B) and characterization of homozygous deletions within FRA3B that effect FHIT transcription in tumor cell lines.Genes,Chromosome Cancer,1997，20：16
7 关赛芳，许凯黎，廖美琳等.非小细胞肺癌中3p25杂合性丢失研究.肿瘤，1997，17(6)：439
(收稿：1998-06-18 修回：1998-09-17), http://www.100md.com