p53基因突变检测方法的评价
作者：薛 涛 王申五 祝学光
单位：薛 涛(徐州医学院附属医院(徐州221002)；王申五 祝学光(北京医科大学人民医院)
关键词：
肿瘤990130 p53基因的缺失、重排等改变，可通过Southern印迹杂交等技术检测。而单个碱基的置换、一个或数个核苷酸的缺失、插入等，因突变位置多不在限制性内切酶的切割位点上，上述方法不易检测到，可采用如下检测方法：
1.等位基因特异的寡核苷酸探针杂交法 用长20 bp的寡核苷酸作为探针，与结合在尼龙膜上的基因组DNA或PCR扩增片段进行杂交，根据杂交信号的有无确定是否有点突变存在。理论上只要有一个错配的碱基就不能形成杂交分子。该法可用同位素或非同位素标记探针，对杂交的条件非常敏感，需要严格控制实验条件，且只能检测已知基因的突变。现已较少应用。
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2.RNase错配切割法 使用标记RNA与基因组DNA或PCR扩增片段杂交，突变位置上形成单链RNA，经聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)后，可检测到断片，根据断片的长度估计碱基置换的位置。该方法简便，易于操作，但需要特异性探针，灵敏度偏低，检出率仅达60～70%。
3.错配碱基的化学断裂法 应用同位素标记的野生型p53探针与细胞中DNA或RNA杂交，若靶DNA或RNA的一个碱基发生置换，与探针结合时，局部将形成单链DNA；此处的T、C残基可在四氧化锇存在下被修饰，C残基亦可在羟基胺存在下被修饰，用哌啶处理时，被修饰的残基处可被切断，通过电泳和放射自显影即可确定突变是否存在。该法比RNase错配切割法敏感，理论上能检测到100%的突变，并能检测较大的片段(1～2 kb)。但不能完全确定突变的部位和类型，且使用同位素和剧毒化学试剂，限制了此法的应用。
4.变性梯度凝胶电泳法 待测DNA在由上至下变性剂(如尿素)浓度或温度逐渐增高的聚丙烯酰胺凝胶内电泳，在特定区域发生部分变性，变性的位置由碱基序列决定，变性后的DNA迁移率明显降低；而单个碱基置换，往往会改变其发生变性的位置，从而影响DNA的迁移率。根据迁移率的变化，即可得知有无碱基的置换。此方法自建立起，不断得到发展，另一个重要的改进是通过PCR方法在DNA片段的一端加上一高解链度、长40 bp、富含GC的序列，从而进一步提高了检测的灵敏度。但该法必须在检测不同的DNA片段前先进行预试验，需要使用特殊仪器。
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5.免疫组化法 p53基因点突变(错义突变)伴有细胞内p53蛋白增加，检测p53蛋白过度表达基本可作为p53基因点突变的间接指标。用特异性抗体与p53蛋白产生抗原抗体反应，根据显色斑点的有无判断p53基因点突变，推测p53基因错义突变。此方法简便、快速、易于操作；但也不能确定点突变的位置和类型，尚可能发生假阳性和假阴性错误。
6.单链构象多态性分析法 单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中泳动时，迁移率受单链DNA空间构象的影响，而此空间构象决定于DNA分子中的减基序列。因而根据DNA迁移率的改变，即可得知DNA是否有突变。该法是一种敏感的检测基因点突变的方法，单个碱基置换即能检测出来，且仅需极微量的DNA或RNA就可进行分析。小片段DNA的缺失、插入亦可用该法检测。该法检出率极高，当待测DNA片段长100～300 bp时，检出突变的效率可达95%。
自Qrita等报道单链构象多态性(SSCP)分析法后，很快得到推广应用。银染技术是根据核酸分子带有多个氨基和亚氨基，一定条件下可以与银离子结合，在甲醛等还原剂的作用下，生成黑或褐色的银沉淀条带。SSCP银染技术除具备灵敏度高等优点外，尚存在多个优点：如周期短；成本低；重复性好；安全；适于大样本筛选和群体研究。因而具有广泛的应用前景。
7.序列分析法 是检测基因点突变最直接可靠的方法。但操作复杂、耗时耗资，检测靶基因整个区域内的核苷酸序列时，工作十分艰巨。
目前，PCR-SSCP简便、快速、敏感，应用广泛。对该法检测到的阳性病例再进行序列测定，使得实验更加完善。
第一作者简介 薛 涛，男，硕士，副教授，硕士生导师。
(收稿：1996-11-19), http://www.100md.com
单位：薛 涛(徐州医学院附属医院(徐州221002)；王申五 祝学光(北京医科大学人民医院)
关键词：
肿瘤990130 p53基因的缺失、重排等改变，可通过Southern印迹杂交等技术检测。而单个碱基的置换、一个或数个核苷酸的缺失、插入等，因突变位置多不在限制性内切酶的切割位点上，上述方法不易检测到，可采用如下检测方法：
1.等位基因特异的寡核苷酸探针杂交法 用长20 bp的寡核苷酸作为探针，与结合在尼龙膜上的基因组DNA或PCR扩增片段进行杂交，根据杂交信号的有无确定是否有点突变存在。理论上只要有一个错配的碱基就不能形成杂交分子。该法可用同位素或非同位素标记探针，对杂交的条件非常敏感，需要严格控制实验条件，且只能检测已知基因的突变。现已较少应用。
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2.RNase错配切割法 使用标记RNA与基因组DNA或PCR扩增片段杂交，突变位置上形成单链RNA，经聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)后，可检测到断片，根据断片的长度估计碱基置换的位置。该方法简便，易于操作，但需要特异性探针，灵敏度偏低，检出率仅达60～70%。
3.错配碱基的化学断裂法 应用同位素标记的野生型p53探针与细胞中DNA或RNA杂交，若靶DNA或RNA的一个碱基发生置换，与探针结合时，局部将形成单链DNA；此处的T、C残基可在四氧化锇存在下被修饰，C残基亦可在羟基胺存在下被修饰，用哌啶处理时，被修饰的残基处可被切断，通过电泳和放射自显影即可确定突变是否存在。该法比RNase错配切割法敏感，理论上能检测到100%的突变，并能检测较大的片段(1～2 kb)。但不能完全确定突变的部位和类型，且使用同位素和剧毒化学试剂，限制了此法的应用。
4.变性梯度凝胶电泳法 待测DNA在由上至下变性剂(如尿素)浓度或温度逐渐增高的聚丙烯酰胺凝胶内电泳，在特定区域发生部分变性，变性的位置由碱基序列决定，变性后的DNA迁移率明显降低；而单个碱基置换，往往会改变其发生变性的位置，从而影响DNA的迁移率。根据迁移率的变化，即可得知有无碱基的置换。此方法自建立起，不断得到发展，另一个重要的改进是通过PCR方法在DNA片段的一端加上一高解链度、长40 bp、富含GC的序列，从而进一步提高了检测的灵敏度。但该法必须在检测不同的DNA片段前先进行预试验，需要使用特殊仪器。
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5.免疫组化法 p53基因点突变(错义突变)伴有细胞内p53蛋白增加，检测p53蛋白过度表达基本可作为p53基因点突变的间接指标。用特异性抗体与p53蛋白产生抗原抗体反应，根据显色斑点的有无判断p53基因点突变，推测p53基因错义突变。此方法简便、快速、易于操作；但也不能确定点突变的位置和类型，尚可能发生假阳性和假阴性错误。
6.单链构象多态性分析法 单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中泳动时，迁移率受单链DNA空间构象的影响，而此空间构象决定于DNA分子中的减基序列。因而根据DNA迁移率的改变，即可得知DNA是否有突变。该法是一种敏感的检测基因点突变的方法，单个碱基置换即能检测出来，且仅需极微量的DNA或RNA就可进行分析。小片段DNA的缺失、插入亦可用该法检测。该法检出率极高，当待测DNA片段长100～300 bp时，检出突变的效率可达95%。
自Qrita等报道单链构象多态性(SSCP)分析法后，很快得到推广应用。银染技术是根据核酸分子带有多个氨基和亚氨基，一定条件下可以与银离子结合，在甲醛等还原剂的作用下，生成黑或褐色的银沉淀条带。SSCP银染技术除具备灵敏度高等优点外，尚存在多个优点：如周期短；成本低；重复性好；安全；适于大样本筛选和群体研究。因而具有广泛的应用前景。
7.序列分析法 是检测基因点突变最直接可靠的方法。但操作复杂、耗时耗资，检测靶基因整个区域内的核苷酸序列时，工作十分艰巨。
目前，PCR-SSCP简便、快速、敏感，应用广泛。对该法检测到的阳性病例再进行序列测定，使得实验更加完善。
第一作者简介 薛 涛，男，硕士，副教授，硕士生导师。
(收稿：1996-11-19), http://www.100md.com