Ⅰ期非小细胞肺癌中p16基因及其产物的表达
作者：包国良 冯久贤 董强刚 江晓丰 沙慧芳 王恩忠
单位：上海市胸科医院胸部肿瘤研究所(上海 200030)
关键词：
肿瘤990127 P16基因是一个新近发现的抑癌基因，其表达异常被认为与癌细胞的失控性增殖密切相关[1～3]。近年来，关于非小细胞肺癌(NSCLC)中P16基因及其产物的异常表达，国内外均有报道[4～8]，但单独研究早期NSCLC的文献报道极少。为此，作者应用免疫组织化学和PCR-SSCP方法，分析P16蛋白及其基因在Ⅰ期NSCLC中的表达及其二者的相互关系。
材料与方法
1.组织标本 本院胸外科手术切除并经病理证实为Ⅰ期(T1-2N0M0)NSCLC标本共28例。其中腺癌10例、鳞癌14例、混合型鳞腺癌4例，男性23例、女性5例，年龄43～75岁，平均60.7岁，手术标本分别经液氮冻存或用甲基纤维素包埋,-20℃保存.
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2.免疫组织化学方法 肺癌手术标本用甲基纤维包埋,5μm冰冻切片.采用免疫人多克隆抗体P16(C-20,San-ta、Cruz.美国)抗体(1:50稀释)作一坑试剂盒(Vector LAB.)显色.阴性对照用PBS替代一抗.判断结果以阳性细胞大于30%为阳性标准.
3.DNA提取 液氮保存的标本经蛋白K消化-饱和酚-氯仿提取法提取DNA,用紫光分光光度仪定量.
4.扩增 p16基因exon2引物由中科院上海细胞生物学研究所分子生物学实验室合成。引物序列为5’-TGGCTCTGACCATTCTGT(Sense,S)；5’-AGCTTTGGAAGCTCTCAG(Antisense,As)。PCR反应总体积为25 μl，样本DNA量为1 μg，以人外周血白细胞作对照。在PCR仪上(P.E.-TC1)上，94℃变性5 min后，按94 ℃，45s；55 ℃，45 s；72 ℃，1 min，35个循环。72 ℃延伸10 min。采用2%琼脂糖凝胶电泳，以100 V电压，电泳30 min，分析PCR扩增产物，电泳扩增条带P16 exon 2为400 bp。同时用β-actin 作内参照，其引物序列为：5’-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA(S.)；5’-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA(As).β-actin 扩增条带为300 bp。
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5.单链构象多态性(SSCP)分析 取10 μl PCR扩增产物，加入10 μl变性液(98%甲酰胺、10 mmol/L EDTANa2、0.025%溴酚蓝，0.025%二甲苯氰)混匀后，97℃变性10分钟，立即转入冰浴中。然后用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压100 V，电泳3小时，温度为25℃。电泳完毕后，取凝胶用银染色方法观察单链构象多态性。
结 果
一、免疫组织化学结果 见附表。
二、PCR-SSCP结果 见附表及附图。
三、p16基因和蛋白表达的相互关系 在12例p16蛋白染色阴性的病例中，8例p16基因改变，其中5例纯合性缺失，3例点突变。p16基因结构改变与蛋白染色阴性之间的吻合率为66.7%。16例p16蛋白染色阳性的病例，p16基因均未发现异常表达。
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附表 p16基因及蛋白Ⅰ期非小细胞肺癌中的表达 组织类型
例数
p16蛋白
p16基因
阳性(%)
阴性(%)
缺失
突变
鳞癌
14
7(50%)
7(50%)
, 百拇医药 3
3
腺癌
10
7(70%)
3(30%)
1
0
混合型鳞腺癌
4
2(50%)
2(50%)
1
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合计
28
16(57%)
12(42%)
5
3
附图 p16基因外显子-2 PCR扩增产物(2%琼脂糖凝胶电泳)
除肺癌标本编号134和136 p16基因外显子2缺失外，其它肺癌标本p16基因外显子2均表达，PBL为人外周血白细胞，M为PGEM-3zf(+)/HaeⅢDNA Marker
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讨 论
p16基因对细胞生长起着十分重要的负调节作用。一旦p16基因发生改变而不能正常表达时，细胞增殖的负调控机制失效，从而为癌细胞失控性增殖提供了一个有利条件。
在NSCLC中，国内外报道p16基因的改变频率为30%左右，其中主要为纯合性缺失和点突变，但这两种机制何者为主各家报道不一[4，6]。国内钟晓松等报道62例中18例为p16基因纯合性缺失。至于p16蛋白表达，Kratzke等报道在59例Ⅰ期NSCLC中，23例p16蛋白染色阴性(39%)，提示p16蛋白免疫组化染色阴性率高于PCR所见。本组28例Ⅰ期NSCLC中，有12例p16蛋白染色阴性(42.9%)，其中8例具有p16基因改变，5例是纯合性缺失，3例是点突变，两者的吻合率为66.7%，提示在Ⅰ期NSCLC中，p16基因除了纯合性缺失和点突变外，还可能存在其它的失活机制，如p16基因的异常甲基化。其作用是使p16基因表达下调，表现为p16蛋白不能被检出[9]。对此问题作者正在进一步研究之中。阐明这些机制对进一步了解p16抑癌基因在NSCLC发生发展过程中的作用，具有十分重要的意义。
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第一作者简介 包国良，男，大学本科，助理研究员。
参 考 文 献
1 Kamb A,Guris NA,Weaver-Feldhaus J，et al.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types.Science.1994，264：436
2 Nobori T,Miura K,Wu DJ,et al.Deletions of the cyclein-dependent kinase-4 inhibitor gene in multiple human cancer.Nature(Lond.),1994,368:753
3 Nagaraja Rao R,Targets for cancer therapy in the cell cycle pathway.Current Opinion in Oncology.1996,8:516
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4 Hayashi N,Sugimoto Y,Tsuchiya E,et al.Somatic mutations of the MST(multiple tumor suppressor) 1/CDKI(cyclin-dependent kinase-4 inhibitor) gene in human primary non-small lung carcinoma.Biochem Biophys Res Commun，1994,202:1426
5 Washimi O,Nagatake M,Osada H,et al.In vivo occurrence of p16 (MST1) and p15 (MST2) alterations preferentially in non-small cell lung cancer.Cancer Res.1994,55(3):514
6 Nakagawa K,Conrad NK,Williams JP,et al.Mechanism of inactivation of CDKN2 and MST2 in non-small cell lung cancer and association with advanced stage.Oncogene,1995,11(9):1843
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7 Wiest JS,Franklin WA,Otstot JT,et al.Identification of a novel region of homozygous deletion on chromosome 9p in squamous cell carcinoma of the lung:The location of a putative tumor suppressor gene.Cancer Res,1997,57:1
8 钟晓松，许凯黎，廖美琳，等.原发性非小细胞性肺癌p16基因丢失研究.肿瘤，1997，17(2)：81
9 Shapiro GO,Rollins BJ,p16INK4A as a human tumor suppressor,Biochimica et Biophysica Acta.1996,1242:165
(收稿：1997-11-26 修回：1998-02-09), 百拇医药
单位：上海市胸科医院胸部肿瘤研究所(上海 200030)
关键词：
肿瘤990127 P16基因是一个新近发现的抑癌基因，其表达异常被认为与癌细胞的失控性增殖密切相关[1～3]。近年来，关于非小细胞肺癌(NSCLC)中P16基因及其产物的异常表达，国内外均有报道[4～8]，但单独研究早期NSCLC的文献报道极少。为此，作者应用免疫组织化学和PCR-SSCP方法，分析P16蛋白及其基因在Ⅰ期NSCLC中的表达及其二者的相互关系。
材料与方法
1.组织标本 本院胸外科手术切除并经病理证实为Ⅰ期(T1-2N0M0)NSCLC标本共28例。其中腺癌10例、鳞癌14例、混合型鳞腺癌4例，男性23例、女性5例，年龄43～75岁，平均60.7岁，手术标本分别经液氮冻存或用甲基纤维素包埋,-20℃保存.
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2.免疫组织化学方法 肺癌手术标本用甲基纤维包埋,5μm冰冻切片.采用免疫人多克隆抗体P16(C-20,San-ta、Cruz.美国)抗体(1:50稀释)作一坑试剂盒(Vector LAB.)显色.阴性对照用PBS替代一抗.判断结果以阳性细胞大于30%为阳性标准.
3.DNA提取 液氮保存的标本经蛋白K消化-饱和酚-氯仿提取法提取DNA,用紫光分光光度仪定量.
4.扩增 p16基因exon2引物由中科院上海细胞生物学研究所分子生物学实验室合成。引物序列为5’-TGGCTCTGACCATTCTGT(Sense,S)；5’-AGCTTTGGAAGCTCTCAG(Antisense,As)。PCR反应总体积为25 μl，样本DNA量为1 μg，以人外周血白细胞作对照。在PCR仪上(P.E.-TC1)上，94℃变性5 min后，按94 ℃，45s；55 ℃，45 s；72 ℃，1 min，35个循环。72 ℃延伸10 min。采用2%琼脂糖凝胶电泳，以100 V电压，电泳30 min，分析PCR扩增产物，电泳扩增条带P16 exon 2为400 bp。同时用β-actin 作内参照，其引物序列为：5’-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA(S.)；5’-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA(As).β-actin 扩增条带为300 bp。
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5.单链构象多态性(SSCP)分析 取10 μl PCR扩增产物，加入10 μl变性液(98%甲酰胺、10 mmol/L EDTANa2、0.025%溴酚蓝，0.025%二甲苯氰)混匀后，97℃变性10分钟，立即转入冰浴中。然后用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压100 V，电泳3小时，温度为25℃。电泳完毕后，取凝胶用银染色方法观察单链构象多态性。
结 果
一、免疫组织化学结果 见附表。
二、PCR-SSCP结果 见附表及附图。
三、p16基因和蛋白表达的相互关系 在12例p16蛋白染色阴性的病例中，8例p16基因改变，其中5例纯合性缺失，3例点突变。p16基因结构改变与蛋白染色阴性之间的吻合率为66.7%。16例p16蛋白染色阳性的病例，p16基因均未发现异常表达。
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附表 p16基因及蛋白Ⅰ期非小细胞肺癌中的表达 组织类型
例数
p16蛋白
p16基因
阳性(%)
阴性(%)
缺失
突变
鳞癌
14
7(50%)
7(50%)
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3
腺癌
10
7(70%)
3(30%)
1
0
混合型鳞腺癌
4
2(50%)
2(50%)
1
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合计
28
16(57%)
12(42%)
5
3
附图 p16基因外显子-2 PCR扩增产物(2%琼脂糖凝胶电泳)
除肺癌标本编号134和136 p16基因外显子2缺失外，其它肺癌标本p16基因外显子2均表达，PBL为人外周血白细胞，M为PGEM-3zf(+)/HaeⅢDNA Marker
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讨 论
p16基因对细胞生长起着十分重要的负调节作用。一旦p16基因发生改变而不能正常表达时，细胞增殖的负调控机制失效，从而为癌细胞失控性增殖提供了一个有利条件。
在NSCLC中，国内外报道p16基因的改变频率为30%左右，其中主要为纯合性缺失和点突变，但这两种机制何者为主各家报道不一[4，6]。国内钟晓松等报道62例中18例为p16基因纯合性缺失。至于p16蛋白表达，Kratzke等报道在59例Ⅰ期NSCLC中，23例p16蛋白染色阴性(39%)，提示p16蛋白免疫组化染色阴性率高于PCR所见。本组28例Ⅰ期NSCLC中，有12例p16蛋白染色阴性(42.9%)，其中8例具有p16基因改变，5例是纯合性缺失，3例是点突变，两者的吻合率为66.7%，提示在Ⅰ期NSCLC中，p16基因除了纯合性缺失和点突变外，还可能存在其它的失活机制，如p16基因的异常甲基化。其作用是使p16基因表达下调，表现为p16蛋白不能被检出[9]。对此问题作者正在进一步研究之中。阐明这些机制对进一步了解p16抑癌基因在NSCLC发生发展过程中的作用，具有十分重要的意义。
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第一作者简介 包国良，男，大学本科，助理研究员。
参 考 文 献
1 Kamb A,Guris NA,Weaver-Feldhaus J，et al.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types.Science.1994，264：436
2 Nobori T,Miura K,Wu DJ,et al.Deletions of the cyclein-dependent kinase-4 inhibitor gene in multiple human cancer.Nature(Lond.),1994,368:753
3 Nagaraja Rao R,Targets for cancer therapy in the cell cycle pathway.Current Opinion in Oncology.1996,8:516
, http://www.100md.com
4 Hayashi N,Sugimoto Y,Tsuchiya E,et al.Somatic mutations of the MST(multiple tumor suppressor) 1/CDKI(cyclin-dependent kinase-4 inhibitor) gene in human primary non-small lung carcinoma.Biochem Biophys Res Commun，1994,202:1426
5 Washimi O,Nagatake M,Osada H,et al.In vivo occurrence of p16 (MST1) and p15 (MST2) alterations preferentially in non-small cell lung cancer.Cancer Res.1994,55(3):514
6 Nakagawa K,Conrad NK,Williams JP,et al.Mechanism of inactivation of CDKN2 and MST2 in non-small cell lung cancer and association with advanced stage.Oncogene,1995,11(9):1843
, http://www.100md.com
7 Wiest JS,Franklin WA,Otstot JT,et al.Identification of a novel region of homozygous deletion on chromosome 9p in squamous cell carcinoma of the lung:The location of a putative tumor suppressor gene.Cancer Res,1997,57:1
8 钟晓松，许凯黎，廖美琳，等.原发性非小细胞性肺癌p16基因丢失研究.肿瘤，1997，17(2)：81
9 Shapiro GO,Rollins BJ,p16INK4A as a human tumor suppressor,Biochimica et Biophysica Acta.1996,1242:165
(收稿：1997-11-26 修回：1998-02-09), 百拇医药