抗肿瘤坏死因子抗体对大鼠急性出血坏死性胰腺炎的治疗作用
作者：罗昆仑 何振平 李 昆 段恒春 马宽生
单位：第三军医大学西南医院肝胆外科中心(重庆 400038)
关键词：大鼠；急性出血坏死性胰腺炎；肿瘤坏死因子α单克隆抗体
抗肿瘤坏死因子抗体对大鼠急性出血坏死性 胰腺炎的治疗作用 摘要 采用牛磺胆酸钠复制大鼠急性出血坏死性胰腺炎(AHNP)模型，动态观察其血浆肿瘤坏死因子α(TNFα)含量、血清脂肪酶含量和胰腺病理改变等，以及抗肿瘤坏死因子α单克隆抗体(TNFα MCAb)的治疗对它们的作用，并与假手术组比较。结果显示：假手术组大鼠的各项检测指标无异常改变，无动物死亡。AHNP组腹水量、血清脂肪酶及血浆TNFα水平均较假手术组显著增加，胰腺病理改变明显；经TNFα MCAb治疗后，血浆TNFα水平未见升高，而血清脂肪酶下降，腹水积聚减少，胰腺病理改变减轻，动物死亡率显著下降。由此提示，TNFα在AHNP发病机理中起重要作用，TNFα MCAb对AHNP大鼠有一定的治疗作用。
, 百拇医药
THERAPEUTIC ROLE OF ANTI-TNFα ANTIBODY AGAINST ACUTE HEMOERRHAGIC AND NECROTIZING PANCREATITIS IN RATS
Luo Kunlen, He Zhenping, Li Kun, et al.Clinical Center of Hepatobiliary Surgery, Southwesten Hospital, 3rd Military Medical University, Chongqing 400038
Abstract Acute hemorrhagic and necrotizing pancreatitis (AHNP) was induced by injection of sodium taurocholate into pancreatic and biliary duct of rats. TNFα MCAb was infused intravenously 15 minutes before pancreatitis was induced, and plasm TNFα level, serum lipase level and pancratic pathologic changes were tested.Results: the amount of ascites, serum lipase level and palsm TNFα level were significantly incresed and severe pancreatic pathologic changes was induced after AHNP, as compared with those in the control group .However, plasm TNFα level was not elevated after administration of TNFα MCAb, and the amount of ascites and pathologic damage to the pancreas were markely reduced. The animal fatality was reduced too. Conclusions: these suggest that TNFα play an important role in the pathogenesis of AHNP, and TNFα MCAb have a certain therapeutic effect on AHNP in rats.
, 百拇医药
Key words Rat Acute hemorrhagic and necrotizing pancreatitis Tumor necrosis factor α monoclonal antibody
急性出血坏死性胰腺炎(AHNP)发病凶险，病死率高达30%～50%，寻求有效、合理的治疗手段是临床迫切需要解决的问题〔1〕。我们通过复制AHNP大鼠模型，测定其血浆中肿瘤坏死因子α (TNFα)水平，并与抗TNFα单克隆抗体(TNFα MCAb)治疗组比较，以探讨急性出血坏死性胰腺炎时TNFα与胰腺损害的关系，以及TNFα MCAb的保护作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组
Wistar大鼠88只，体重200±20g，雌雄不拘，由四川省中药研究所提供。随机将大鼠分为假手术组(n＝24)、AHNP组(n＝32)和TNFα MCAb治疗组(n＝32)，各组动物又随机分为1、3、6及12小时4个时相点，即时活杀取材，检测有关指标。另取Wistar大鼠40只，要求同上，随机均分为AHNP组和TNFα MCAb治疗组，模型制作后连续观察24小时，计算其动物死亡率。
, 百拇医药
1.2 AHNP动物模型的制备
参照Milani等〔2〕的模型并稍加改进制作AHNP动物模型。即大鼠术前12小时禁食、不禁水。10%戊巴比妥钠30mg/kg麻醉动物后，正中切口入腹，于肝十二指肠韧带肝门侧用小动脉夹暂时夹闭胆管，由十二指肠前壁进针，经乳头部插管进入胆总管内，夹闭胆胰管出口，以速度0.1ml/min匀速注入5%牛磺胆酸钠(0.1ml/kg,Sigma公司)，10分钟后去除动脉夹，关腹。TNFα MCAb治疗组：在模型制作前15分钟自鼠尾静脉注入TNFα MCAb(8mg/kg，第四军医大学免疫教研室惠赠)，其余步骤同AHNP组。假手术组：除胆管内不注入5%牛磺胆酸钠外，余同AHNP组。
1.3 观察指标
1.3.1 大鼠腹水量、胰腺病理及存活情况 3组大鼠分别于术后4个时相点剖腹，测量腹水量(湿棉球减去干棉球重)，抽取腹腔动脉血检测相关生化指标；取胰腺组织用10%甲醛固定，石蜡包埋切片，光镜观察。记录各组大鼠存活情况。
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1.3.2 血液生化指标 血清脂肪酶测定采用快速比浊法〔3〕；血浆TNFα测定用双抗体夹心ELISA法，试剂盒系第四军医大学免疫教研室产品，按说明书操作。
1.4 统计学处理
采用华西医科大学PEMS医用统计程序包，对实验结果进行χ2检验或方差分析，数据以
±s表示。
2 结果
2.1 大鼠存活情况
假手术组术后长期存活，AHNP组24小时内死亡率为50%(10/20)，TNFα MCAb治疗组则为10%(2/20)，3组间两两比较，有显著性差异(P<0.05)。
, 百拇医药
2.2 大鼠腹水量、脂肪酶及TNFα测定结果
结果见附表。从附表可见，假手术组无明显腹水，TNFα MCAb治疗组各时相腹水量明显少于AHNP组(P<0.05)；各时相血清脂肪酶AHNP组及TNFα MCAb治疗组均明显高于假手术组(P<0.01)，但TNFα MCAb治疗组则明显低于AHNP组(P<0.01)；各时相血浆TNFα水平AHNP组明显高于假手术组及TNFα MCAb治疗组(P<0.01)，后两组之间则无显著性差异(P>0.05)。
附表 3组大鼠腹水量、血清脂肪酶及TNFα测定结果(±s)
时相
假手术组(n=24)
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AHNP组(n=32)
TNFα MCAb组(n=32)
腹水量a
脂肪酶b
TNFαc
腹水量
脂肪酶
TNFα
腹水量
脂肪酶
TNFα
术后 1h
, 百拇医药
(-)
30.2±4.93
1.37±0.84
3.45±1.01
453.1± 52.8△
4.26±1.00△
2.32±1.06*
272.8±82.4**△
1.26±0.58**
术后 3h
, 百拇医药
(-)
26.28±9.18
1.62±0.71
3.86±1.13
536.8± 89.8△
5.78±0.92△
2.59±0.89*
321.7±91.2**△
1.36±0.69**
术后 6h
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(-)
29.35±7.14
1.42±0.50
4.58±1.29
813.7±112.5△
3.71±1.31△
2.77±1.14*
238.5±100.6**△
1.49±0.87**
术后12h
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(-)
19.81±7.62
1.71±0.93
4.22±1.92
762.9±124.6△
3.65±1.27△
2.14±0.78*
165.8±76.9**△
1.31±0.66**
与AHNP组比较，*P<0.05，**P<0.01；与假手术组比较，△P<0.01； a:单位为g； b:单位为IU； c:单位为ng/ml
, 百拇医药
2.3 胰腺病变的形态学观察
假手术组大鼠胰腺腺泡及间质无异常改变。AHNP组1小时即出现胰腺腺泡肿胀、灶性或片状出血坏死灶，间质中性粒细胞浸润、红细胞渗出；3～6小时上述病变进一步加重，且胰腺和胰周组织可见散在皂化斑，伴血性腹水；12小时胰腺病变更为严重，胰腺组织呈大片出血坏死，中性粒细胞大量浸润，胰腺及胰周组织皂化斑进一步增多，伴大量腹水。TNFα MCAb治疗组主要呈胰腺间质充血水肿，少量中性粒细胞浸润及局灶性胰腺小叶内坏死，腹水显著减少。
3 讨论
TNFα主要由单核巨噬细胞产生，是一类重要的炎症、免疫调节物。作为炎症介质具有双重作用，即适量释放可提高白细胞对病原体清除能力，促进组织修复，但过量释放对机体具有强烈的毒性作用〔1〕。本实验显示：大鼠在诱发AHNP后1小时血浆TNFα水平即显著升高，3小时达高峰，随后有所下降，至12小时仍显著高于假手术组。同步观察胰腺的病理改变，其改变程度随病程延长而加剧，腹水量及血清脂肪酶也逐渐升高。提示TNFα可能作为一种炎症启动因子参与AHNP的发生及发展〔4〕。但血浆TNFα水平仅能提供推测性依据，只有应用阻断TNFα作用途径，观察对组织器官的保护作用，才能更好地证明TNFα对组织的损伤作用。本实验预先应用TNFα MCAb治疗后，大鼠血TNFα水平未出现释放高峰，并维持在基础水平，腹水量显著减少，血清脂肪酶含量明显降低，胰腺病变较AHNP组也有所减轻，TNFα MCAb治疗组大鼠24小时死亡率从AHNP组的50%降至10%。本实验进一步证实，TNFα在AHNP发病机理中起十分重要的作用，是AHNP发生、发展的重要介质。其机理可能是：①促进中性粒细胞等炎症细胞浸润组织，并激活炎症细胞包括中性粒细胞释放大量介质如氧自由基、蛋白酶、花生四烯酸等，介导组织细胞损伤〔5〕；②激活血管内皮细胞，促其表达粘附分子，增加与中性粒细胞的粘附，有助于中性粒细胞释放的大量介质发挥其毒性作用〔6〕；③增加其它细胞因子如IL-1、IL-6、IL-8等产生，形成逐渐放大的炎症瀑布链锁反应，进一步加重组织损伤；④可能是参与AHNP连锁损伤机理的启动因子。本实验预先应用TNFα MCAb中和TNFα作用后，减轻了胰腺病理改变，动物生存率也明显提高，提示早期应用TNFα MCAb抑制TNFα早期爆发的生物学活性具有重要意义。
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值得指出的是，本实验中TNFα MCAb治疗组未能完全防止AHNP的发生，其原因可能是AHNP的发生是多种因素参与的结果，介质是其中之一。此外，TNFα MCAb治疗AHNP是否适用于临床，还有待今后作进一步的研究。
参 考 文 献
1 Grewal HP, FRCS, Koth M, et al. Induction of tumor necrosis factor in severe acute pancreatitis and it's subsequent reduction after hepatic passage. Surgery, 1994; 115(2)∶213
2 Milani R, Pereira MP, Dolhnikoff M, et al. Respiratory mechanics and lung morphometry in severe pancreatitis-associated acute lung injury in rats. Crit Care Med, 1995; 23(11)∶1882
, http://www.100md.com
3 Verduin PA, Punt JMHM, Kreutzer HH. Studies on the determination of lipase activity. Clinica Chimica Acta, 1973; 46(1)∶11
4 Grewal HP, Mohey el-Din AB, Gaber L, et al. Amelioration of the physiological and biochemical changes of acute pancreatitis using an anti-TNF polyclonal antibody. Am J Surg, 1994; 167(1)∶214
5 Lorant DE, Patel KP, Mclntyre TM, et al. Coexpression of GMP-140 and PAF by endothelium stimulated by histamine of thrombin: a juxtacrine system for adhesion and activation of neutrophils. J Cell Biol, 1991; 115(1)∶223
6 Smith CW. Chemotactic factor regulate lectin adhesion molecule-1 (LECAM-l) dependent neutrophil adhesion to cytokine stimulated endothelium cell in vitro. J Clin Invest, 1991; 87(2)∶609
(1997-11-12收稿，1998-09-26修回), http://www.100md.com
单位：第三军医大学西南医院肝胆外科中心(重庆 400038)
关键词：大鼠；急性出血坏死性胰腺炎；肿瘤坏死因子α单克隆抗体
抗肿瘤坏死因子抗体对大鼠急性出血坏死性 胰腺炎的治疗作用 摘要 采用牛磺胆酸钠复制大鼠急性出血坏死性胰腺炎(AHNP)模型，动态观察其血浆肿瘤坏死因子α(TNFα)含量、血清脂肪酶含量和胰腺病理改变等，以及抗肿瘤坏死因子α单克隆抗体(TNFα MCAb)的治疗对它们的作用，并与假手术组比较。结果显示：假手术组大鼠的各项检测指标无异常改变，无动物死亡。AHNP组腹水量、血清脂肪酶及血浆TNFα水平均较假手术组显著增加，胰腺病理改变明显；经TNFα MCAb治疗后，血浆TNFα水平未见升高，而血清脂肪酶下降，腹水积聚减少，胰腺病理改变减轻，动物死亡率显著下降。由此提示，TNFα在AHNP发病机理中起重要作用，TNFα MCAb对AHNP大鼠有一定的治疗作用。
, 百拇医药
THERAPEUTIC ROLE OF ANTI-TNFα ANTIBODY AGAINST ACUTE HEMOERRHAGIC AND NECROTIZING PANCREATITIS IN RATS
Luo Kunlen, He Zhenping, Li Kun, et al.Clinical Center of Hepatobiliary Surgery, Southwesten Hospital, 3rd Military Medical University, Chongqing 400038
Abstract Acute hemorrhagic and necrotizing pancreatitis (AHNP) was induced by injection of sodium taurocholate into pancreatic and biliary duct of rats. TNFα MCAb was infused intravenously 15 minutes before pancreatitis was induced, and plasm TNFα level, serum lipase level and pancratic pathologic changes were tested.Results: the amount of ascites, serum lipase level and palsm TNFα level were significantly incresed and severe pancreatic pathologic changes was induced after AHNP, as compared with those in the control group .However, plasm TNFα level was not elevated after administration of TNFα MCAb, and the amount of ascites and pathologic damage to the pancreas were markely reduced. The animal fatality was reduced too. Conclusions: these suggest that TNFα play an important role in the pathogenesis of AHNP, and TNFα MCAb have a certain therapeutic effect on AHNP in rats.
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Key words Rat Acute hemorrhagic and necrotizing pancreatitis Tumor necrosis factor α monoclonal antibody
急性出血坏死性胰腺炎(AHNP)发病凶险，病死率高达30%～50%，寻求有效、合理的治疗手段是临床迫切需要解决的问题〔1〕。我们通过复制AHNP大鼠模型，测定其血浆中肿瘤坏死因子α (TNFα)水平，并与抗TNFα单克隆抗体(TNFα MCAb)治疗组比较，以探讨急性出血坏死性胰腺炎时TNFα与胰腺损害的关系，以及TNFα MCAb的保护作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组
Wistar大鼠88只，体重200±20g，雌雄不拘，由四川省中药研究所提供。随机将大鼠分为假手术组(n＝24)、AHNP组(n＝32)和TNFα MCAb治疗组(n＝32)，各组动物又随机分为1、3、6及12小时4个时相点，即时活杀取材，检测有关指标。另取Wistar大鼠40只，要求同上，随机均分为AHNP组和TNFα MCAb治疗组，模型制作后连续观察24小时，计算其动物死亡率。
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1.2 AHNP动物模型的制备
参照Milani等〔2〕的模型并稍加改进制作AHNP动物模型。即大鼠术前12小时禁食、不禁水。10%戊巴比妥钠30mg/kg麻醉动物后，正中切口入腹，于肝十二指肠韧带肝门侧用小动脉夹暂时夹闭胆管，由十二指肠前壁进针，经乳头部插管进入胆总管内，夹闭胆胰管出口，以速度0.1ml/min匀速注入5%牛磺胆酸钠(0.1ml/kg,Sigma公司)，10分钟后去除动脉夹，关腹。TNFα MCAb治疗组：在模型制作前15分钟自鼠尾静脉注入TNFα MCAb(8mg/kg，第四军医大学免疫教研室惠赠)，其余步骤同AHNP组。假手术组：除胆管内不注入5%牛磺胆酸钠外，余同AHNP组。
1.3 观察指标
1.3.1 大鼠腹水量、胰腺病理及存活情况 3组大鼠分别于术后4个时相点剖腹，测量腹水量(湿棉球减去干棉球重)，抽取腹腔动脉血检测相关生化指标；取胰腺组织用10%甲醛固定，石蜡包埋切片，光镜观察。记录各组大鼠存活情况。
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1.3.2 血液生化指标 血清脂肪酶测定采用快速比浊法〔3〕；血浆TNFα测定用双抗体夹心ELISA法，试剂盒系第四军医大学免疫教研室产品，按说明书操作。
1.4 统计学处理
采用华西医科大学PEMS医用统计程序包，对实验结果进行χ2检验或方差分析，数据以
±s表示。2 结果
2.1 大鼠存活情况
假手术组术后长期存活，AHNP组24小时内死亡率为50%(10/20)，TNFα MCAb治疗组则为10%(2/20)，3组间两两比较，有显著性差异(P<0.05)。
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2.2 大鼠腹水量、脂肪酶及TNFα测定结果
结果见附表。从附表可见，假手术组无明显腹水，TNFα MCAb治疗组各时相腹水量明显少于AHNP组(P<0.05)；各时相血清脂肪酶AHNP组及TNFα MCAb治疗组均明显高于假手术组(P<0.01)，但TNFα MCAb治疗组则明显低于AHNP组(P<0.01)；各时相血浆TNFα水平AHNP组明显高于假手术组及TNFα MCAb治疗组(P<0.01)，后两组之间则无显著性差异(P>0.05)。
附表 3组大鼠腹水量、血清脂肪酶及TNFα测定结果(
±s)时相
假手术组(n=24)
, 百拇医药
AHNP组(n=32)
TNFα MCAb组(n=32)
腹水量a
脂肪酶b
TNFαc
腹水量
脂肪酶
TNFα
腹水量
脂肪酶
TNFα
术后 1h
, 百拇医药
(-)
30.2±4.93
1.37±0.84
3.45±1.01
453.1± 52.8△
4.26±1.00△
2.32±1.06*
272.8±82.4**△
1.26±0.58**
术后 3h
, 百拇医药
(-)
26.28±9.18
1.62±0.71
3.86±1.13
536.8± 89.8△
5.78±0.92△
2.59±0.89*
321.7±91.2**△
1.36±0.69**
术后 6h
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(-)
29.35±7.14
1.42±0.50
4.58±1.29
813.7±112.5△
3.71±1.31△
2.77±1.14*
238.5±100.6**△
1.49±0.87**
术后12h
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(-)
19.81±7.62
1.71±0.93
4.22±1.92
762.9±124.6△
3.65±1.27△
2.14±0.78*
165.8±76.9**△
1.31±0.66**
与AHNP组比较，*P<0.05，**P<0.01；与假手术组比较，△P<0.01； a:单位为g； b:单位为IU； c:单位为ng/ml
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2.3 胰腺病变的形态学观察
假手术组大鼠胰腺腺泡及间质无异常改变。AHNP组1小时即出现胰腺腺泡肿胀、灶性或片状出血坏死灶，间质中性粒细胞浸润、红细胞渗出；3～6小时上述病变进一步加重，且胰腺和胰周组织可见散在皂化斑，伴血性腹水；12小时胰腺病变更为严重，胰腺组织呈大片出血坏死，中性粒细胞大量浸润，胰腺及胰周组织皂化斑进一步增多，伴大量腹水。TNFα MCAb治疗组主要呈胰腺间质充血水肿，少量中性粒细胞浸润及局灶性胰腺小叶内坏死，腹水显著减少。
3 讨论
TNFα主要由单核巨噬细胞产生，是一类重要的炎症、免疫调节物。作为炎症介质具有双重作用，即适量释放可提高白细胞对病原体清除能力，促进组织修复，但过量释放对机体具有强烈的毒性作用〔1〕。本实验显示：大鼠在诱发AHNP后1小时血浆TNFα水平即显著升高，3小时达高峰，随后有所下降，至12小时仍显著高于假手术组。同步观察胰腺的病理改变，其改变程度随病程延长而加剧，腹水量及血清脂肪酶也逐渐升高。提示TNFα可能作为一种炎症启动因子参与AHNP的发生及发展〔4〕。但血浆TNFα水平仅能提供推测性依据，只有应用阻断TNFα作用途径，观察对组织器官的保护作用，才能更好地证明TNFα对组织的损伤作用。本实验预先应用TNFα MCAb治疗后，大鼠血TNFα水平未出现释放高峰，并维持在基础水平，腹水量显著减少，血清脂肪酶含量明显降低，胰腺病变较AHNP组也有所减轻，TNFα MCAb治疗组大鼠24小时死亡率从AHNP组的50%降至10%。本实验进一步证实，TNFα在AHNP发病机理中起十分重要的作用，是AHNP发生、发展的重要介质。其机理可能是：①促进中性粒细胞等炎症细胞浸润组织，并激活炎症细胞包括中性粒细胞释放大量介质如氧自由基、蛋白酶、花生四烯酸等，介导组织细胞损伤〔5〕；②激活血管内皮细胞，促其表达粘附分子，增加与中性粒细胞的粘附，有助于中性粒细胞释放的大量介质发挥其毒性作用〔6〕；③增加其它细胞因子如IL-1、IL-6、IL-8等产生，形成逐渐放大的炎症瀑布链锁反应，进一步加重组织损伤；④可能是参与AHNP连锁损伤机理的启动因子。本实验预先应用TNFα MCAb中和TNFα作用后，减轻了胰腺病理改变，动物生存率也明显提高，提示早期应用TNFα MCAb抑制TNFα早期爆发的生物学活性具有重要意义。
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值得指出的是，本实验中TNFα MCAb治疗组未能完全防止AHNP的发生，其原因可能是AHNP的发生是多种因素参与的结果，介质是其中之一。此外，TNFα MCAb治疗AHNP是否适用于临床，还有待今后作进一步的研究。
参 考 文 献
1 Grewal HP, FRCS, Koth M, et al. Induction of tumor necrosis factor in severe acute pancreatitis and it's subsequent reduction after hepatic passage. Surgery, 1994; 115(2)∶213
2 Milani R, Pereira MP, Dolhnikoff M, et al. Respiratory mechanics and lung morphometry in severe pancreatitis-associated acute lung injury in rats. Crit Care Med, 1995; 23(11)∶1882
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3 Verduin PA, Punt JMHM, Kreutzer HH. Studies on the determination of lipase activity. Clinica Chimica Acta, 1973; 46(1)∶11
4 Grewal HP, Mohey el-Din AB, Gaber L, et al. Amelioration of the physiological and biochemical changes of acute pancreatitis using an anti-TNF polyclonal antibody. Am J Surg, 1994; 167(1)∶214
5 Lorant DE, Patel KP, Mclntyre TM, et al. Coexpression of GMP-140 and PAF by endothelium stimulated by histamine of thrombin: a juxtacrine system for adhesion and activation of neutrophils. J Cell Biol, 1991; 115(1)∶223
6 Smith CW. Chemotactic factor regulate lectin adhesion molecule-1 (LECAM-l) dependent neutrophil adhesion to cytokine stimulated endothelium cell in vitro. J Clin Invest, 1991; 87(2)∶609
(1997-11-12收稿，1998-09-26修回), http://www.100md.com