软性角膜接触镜片上蛋白质沉淀洗脱的动态观察*
作者：刘毅 谢培英 褚仁远 瞿佳
单位：刘毅 褚仁远(上海医科大学眼耳鼻喉科医院 200031);谢培英(北京同仁医院隐形眼镜中心 100730)；瞿佳(温州医学院眼视光学院 325027)
关键词：亲水性角膜接触镜；蛋白质沉淀；紫外分光光度法测定
眼视光学杂志990211 摘 要 目的：研究市售的软镜多功能护理系统对镜片上蛋白质沉淀的清洗效果与动力学。方法：使用58%含水的，Etafilcon A材料的角膜接触镜，进行体外人工泪液浸泡和在体戴用实验，A
与B两种多功能护理液作为洗脱液，用紫外分光光度法测定镜片洗脱液在280nm处的吸光度值，换算为蛋白质量后，进行比较分析。结果：A、B二种洗脱液的实验结果均表明，蛋白质沉淀的洗脱量呈动态变化。体外实验中，镜片浸泡6～8小时已接近最大洗脱量。戴用镜片的数据提示，浸泡1周时，尚未达到最大洗脱量。结论：体外实验的数据表明，存在一个最大洗脱时间点，不同的洗脱液，该时间点不同，不同的多功能护理液在角膜接触镜蛋白沉淀的清除效力上存在差异；不使用除蛋白酶片条件下，护理液仅能洗脱掉蛋白质沉淀的一部分。
, 百拇医药
Dynamics of protein deposits on hydrophilic contact lenses
Liu Yi，Xie Peiying，Chu Renyuan，et al. Department of Ophthalmology，Eye and ENT Hospital，Shanghai Medical University，Shanghai 200031
Abstract Objective：To investigate the cleaning efficacy and dynamics of multi-solution on proteins deposited on hydrophilic contact lenses. Methods：New never worn hydrophilic contact lenses (58% water，Etafilcon A) were individually incubated in protein-only artificial tearsolution (ATS)，or were dispensed to volunteers for wearing. Deposits were removed by A and B multi-solution respectively，UV-spectrophotometer was applied to read the absorbance of extract solutions at 280nm. Protein concentration was determined from a standard curve，generated using ATS as a reference. Results：A solution removed more protein deposits than B，for lenses soaked in ATS，the amount of protein extracted increased with time up to 6～8h；for worn lenses，the increased procedure extended to one week. Both multi-solutions removed only part of the deposits without enzymatic treatment. Conclusion：There exists a time threshold at which protein deposits was extracted to the maximum，overpass the threshold，amount of deposits failed to increase，the time point varied with solution.
, 百拇医药
Keywords Hydrophilic contact lenses Protein deposit UV-spectrophotometry
亲水性角膜接触镜(hydrophilic contact lenses)上的蛋白质沉淀一直被认为是引起各种戴镜并发症的主要原因。传统的除蛋白质沉淀的方法是使用冲洗液、表面活性剂、除蛋白酶片，分步骤进行。现今，越来越多的护理系统采用复合配方，将除蛋白质沉淀的成份也加入到护理液中，制成多功能护理液，这种新护理方法给戴用者带来了方便，但是，其对除蛋白质沉淀的影响如何尚需研究。本文旨在通过实验对该简便方法做一比较和评价。
1 材料和方法
1.1 人工泪液(ATS)的配制 溶菌酶(BM，EC 0163-2)，BSA(Sigma，BP 0161)，γ-Globulin(Sigma，BP 0312)，蛋白浓度为2.2mg/ml。溶菌酶：1.9mg/ml，BSA：0.20mg/ml，γ-Globulin：0.1mg/ml，NaCl：9mg/ml，CaCl2.2H2O：0.25mg/ml，Na2HPO4.7H2O：0.28mg/ml。将上述各成份溶解于去离子水中，调节pH值为7.8，4℃冰箱保存备用。
, 百拇医药
1.2 标准曲线的建立 将上述人工泪液进行倍比稀释，采用双管法测定各管的吸光度A值，绘制成标准曲线，C＝0.9478×A+0.0053，R×R＝0.9999
1.3 ATS浸泡实验 12只未戴过的Etafilcon A材料镜片，含水量58%，随机分为2组，浸泡在2ml的ATS液中，65小时，37℃。镜片取出后，测出ATS中蛋白质的减少量。镜片用NS冲洗后，分成2组，分别加入5ml的A与B护理液中，室温下浸泡，在2、4、6、24、30、72、96小时和1周时，分别测定上述浸泡液中的A值并据标准曲线计算蛋白量。
1.4 镜片戴用实验 12名志愿者，均无眼部疾病，具角膜接触镜戴镜史，熟悉护理程序，有良好的依从性，其中男2名，女10名，年龄18～25岁，屈光度为-2.00至-6.50度，双眼戴用，使用Oxysept双氧水(Allergan Co.)进行日戴护理，整个戴用期间不使用去蛋白质酶片，戴用8～10小时/天，2周后回收镜片，切成1/2等份，分为2组随机浸泡在5ml的护理液A与B中，在浸泡后的2、4、6、24、48、72小时及1周时对浸泡液中的蛋白质量进行测定。
, 百拇医药
1.5 测试仪器 UV-260Spectrophotometer(SHIMADZU)，以280nm为测定波长，使用光径5mm的石英比色杯，用空白浸泡液调零。
2 结果
人工泪液镜片浸泡液中蛋白量的变化(见表1、2)。经ATS浸泡后，入A液与B液的镜片上的蛋白质沉淀总量分别为1146.25μg、940.42μg。两种护理液所浸泡下的蛋白量随浸泡时间的延长，不断递增，A液在30小时已达到最大洗脱量，而B液达到最大洗脱量的时间能延续到72小时。两种护理液对应的最大洗脱量，A液320±20.9μg(72h时)；B液134±8.8μg(30h时)。若换算成洗脱百分比，A液为27.8%，而B液为27.8%，而B液仅为14.12%。在每一个测定时间点，A液为27.8%，而B的洗脱量几乎是B液为27.8%，而B的2倍，两者的差异经t检验处理，P<0.05。
, 百拇医药
表1 ATS浸泡镜片的洗脱变化量 (μg，
±s) 护理液
n
镜片浸泡时间(h)
2
4
6
24
30
72
1周
A液
, 百拇医药
6
149±16.6
234±21.2
284±19.4
308±18
313±18.3
320±20.9
313±12.2
B液
6
70±8.2
, 百拇医药
104±10.1
130±15.8
132±7.9
134±8.8
126±10.7
125±10.1
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2 ATS镜片经不同时间洗脱变化量的百分比(%)
护理液
n
镜片浸泡时间(h)
2
4
6
24
30
72
1周
, 百拇医药
A液
6
13.0
20.44
24.74
26.74
27.72
27.88
27.33
B液
6
, http://www.100md.com
7.38
11.0
13.83
14.03
14.12
13.36
13.29
人戴用镜片浸泡液中蛋白量的变化在2h到1周期间，两种洗脱液中的蛋白量均随时间递增。在1周内，A液的洗脱量从70.1μg增加到616.7μg；而B液的洗脱量从30.8μg增加到193.3μg(表3)。两者的差异经t检验处理，P<0.05。就洗脱量递增百分比而言，A液与B液均在24h达到最大，分别为79.16%、109.30%。
, 百拇医药
表3 戴用镜片的洗脱变化量 (平均值，μg) 护理液
n
镜片浸泡时间(h)
2
4
6
24
30
72
96
1周
A液
, 百拇医药
24
70.1
100.7
133.4
279.2
364.4
398.3
458.6
616.7
B液
24
30.8
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51.8
69.1
123.8
152.1
170.9
167.5
193.3
P
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3 讨论
泪液中的蛋白质被认为是引起角膜接触镜戴用并发症的主要原因[1，2]。正常泪液的蛋白成份很复杂，大约含有60余种蛋白质，镜片上蛋白沉淀的成份与泪液大致相同，其中溶菌酶占1/3左右。由于临床实验中不可能配制出全部成份的模拟泪液，因此，着重分析溶菌酶的变化，大致可以反映出镜片上蛋白质沉淀的情况。而且，溶菌酶的分子量较低，约14kD，容易穿透镜片的微孔，沉积在镜片的基质内。FDA分类中的第四类镜片，由于其含水量高，镜片表面的离子化程度高，能吸附相当数量的蛋白质，尤其是溶菌酶成份，所以，这一特点使本实验的可测性高。
无论何种护理液系统，都不能使洗脱下的蛋白质数量无限增加，在某一特定的时间点，洗脱量将达到最大极限，此后，洗脱量的增加出现波动。由此，浸泡镜片所用的护理液应该定期更换，否则，镜片上的蛋白质沉淀会“反跳”。这一最大洗脱时间点，在不同的护理液是不同的，可以作为衡量护理液除蛋白能力的一项指标。
, 百拇医药
在ATS浸泡实验中，镜片上的蛋白质沉淀主要是溶菌酶，其他成份少，相互作用也小，溶菌酶就比较容易在早期被洗脱下来，所以，最大洗脱量出现较早。一般地，在体外实验中，浸泡6h左右，可接近最大洗脱效果，6h以后，洗脱量增加不显著，1周时，已出现下趋势，所以，临床上进行护理液洗脱效果的体外实验时，可以将6h作为测试点。
在戴用镜片的实验结果中，其最大洗脱量出现时间相对延迟，在1周时尚未出现洗脱效率的下降，其与ATS浸泡实验的这种差异可能是因为：①尽管戴用者每日清洗、护理，但镜片戴用长达2周，相当于重复多次的ATS浸泡，镜片沉淀中的蛋白质数量产生累加效应，部分可能渗透到镜片的基质中，基质中的蛋白质需要相对长的洗脱时间[5，6]。②由于戴用镜片上蛋白质成份相对复杂，除溶菌酶外，尚有大量的非溶菌酶蛋白质成份，以及脂质等非蛋白质成份，上述成分之间相互作用[7]，对溶菌酶产生牵制作用，使得溶菌酶产生缓慢脱离的效应。③某些沉淀蛋白质本身结构及其理化性质特殊，这些成份与镜片结合较紧密，早期不容易被洗下，而随浸泡时间的延长，当溶菌酶大部分洗脱下来后，才不断地从镜片上脱离下来。④在洗脱后期，部分非蛋白质成份被洗脱下来。分析洗脱量的递增百分比发现，A液与B液均在4h达到最高值，因此，当以戴用镜片为测试对象来比较护理液的洗脱效果时，24h可作为测试时间点。
, 百拇医药
本实验表明，在不使用除蛋白酶片情况下，无论何种护理系统，都不能将镜片上的蛋白质沉淀全部洗下，大部分仍然存在于镜片上，所以，在目前情况下，除蛋白酶片的使用依然是重要的护理步骤之一。
致谢：感谢北京同仁隐形眼镜中心的全体工作人员协助收集镜片，及北京眼科研究所的孙旭光、王智群、宋丽红对实验工作的帮助。
本文受卫生部临床重点课题资助
参考文献
[1] Richard NR，Anderson JA，Tasveska ZG，et al. Evaluation of tear deposits on contact lenses from patients with and without giant papillary conjunctivites. CLAO J，1992，18：143
, http://www.100md.com
[2] McClellan BH，Whitney CR，Newman LP，et al. Immunoglobulins in tears. Am J Ophthalmol，1973，76：89
[3] Gachon AM，Verrelle P，Betail G，et al. Immunologial and electrophoretic studies of human tear proteins. Exp Eye Res，1979，29：539
[4] Gudmundsson GO，Woodward FD，Fowler SA，et al. Identification of proteins in contact lens surface deposits by immunofluorescence microscopy. Arch Ophthalmol，1985，103：196
, 百拇医药 [5] Hu J，Tartaglia L，Kohler J，et al. Gentle touch TM，a lens material resistant to protein deposition. CLAO，1995，21：93
[6] Baines MG，Cai F，Backman HA，et al. Adsorption and removal of protein bound to hydrogel contact lenses. Optom Vis Sci，1990，67：807
[7] Bontempo AR，Rapp J. Protein-lipid interaction on the surface of a rigid gas permeable contact lens in vitro. Curr Eye Tes，1997，16：776
(收稿：1999-04-10，修回：1999-04-22), 百拇医药
单位：刘毅 褚仁远(上海医科大学眼耳鼻喉科医院 200031);谢培英(北京同仁医院隐形眼镜中心 100730)；瞿佳(温州医学院眼视光学院 325027)
关键词：亲水性角膜接触镜；蛋白质沉淀；紫外分光光度法测定
眼视光学杂志990211 摘 要 目的：研究市售的软镜多功能护理系统对镜片上蛋白质沉淀的清洗效果与动力学。方法：使用58%含水的，Etafilcon A材料的角膜接触镜，进行体外人工泪液浸泡和在体戴用实验，A
与B两种多功能护理液作为洗脱液，用紫外分光光度法测定镜片洗脱液在280nm处的吸光度值，换算为蛋白质量后，进行比较分析。结果：A、B二种洗脱液的实验结果均表明，蛋白质沉淀的洗脱量呈动态变化。体外实验中，镜片浸泡6～8小时已接近最大洗脱量。戴用镜片的数据提示，浸泡1周时，尚未达到最大洗脱量。结论：体外实验的数据表明，存在一个最大洗脱时间点，不同的洗脱液，该时间点不同，不同的多功能护理液在角膜接触镜蛋白沉淀的清除效力上存在差异；不使用除蛋白酶片条件下，护理液仅能洗脱掉蛋白质沉淀的一部分。, 百拇医药
Dynamics of protein deposits on hydrophilic contact lenses
Liu Yi，Xie Peiying，Chu Renyuan，et al. Department of Ophthalmology，Eye and ENT Hospital，Shanghai Medical University，Shanghai 200031
Abstract Objective：To investigate the cleaning efficacy and dynamics of multi-solution on proteins deposited on hydrophilic contact lenses. Methods：New never worn hydrophilic contact lenses (58% water，Etafilcon A) were individually incubated in protein-only artificial tearsolution (ATS)，or were dispensed to volunteers for wearing. Deposits were removed by A
and B multi-solution respectively，UV-spectrophotometer was applied to read the absorbance of extract solutions at 280nm. Protein concentration was determined from a standard curve，generated using ATS as a reference. Results：A solution removed more protein deposits than B，for lenses soaked in ATS，the amount of protein extracted increased with time up to 6～8h；for worn lenses，the increased procedure extended to one week. Both multi-solutions removed only part of the deposits without enzymatic treatment. Conclusion：There exists a time threshold at which protein deposits was extracted to the maximum，overpass the threshold，amount of deposits failed to increase，the time point varied with solution., 百拇医药
Keywords Hydrophilic contact lenses Protein deposit UV-spectrophotometry
亲水性角膜接触镜(hydrophilic contact lenses)上的蛋白质沉淀一直被认为是引起各种戴镜并发症的主要原因。传统的除蛋白质沉淀的方法是使用冲洗液、表面活性剂、除蛋白酶片，分步骤进行。现今，越来越多的护理系统采用复合配方，将除蛋白质沉淀的成份也加入到护理液中，制成多功能护理液，这种新护理方法给戴用者带来了方便，但是，其对除蛋白质沉淀的影响如何尚需研究。本文旨在通过实验对该简便方法做一比较和评价。
1 材料和方法
1.1 人工泪液(ATS)的配制 溶菌酶(BM，EC 0163-2)，BSA(Sigma，BP 0161)，γ-Globulin(Sigma，BP 0312)，蛋白浓度为2.2mg/ml。溶菌酶：1.9mg/ml，BSA：0.20mg/ml，γ-Globulin：0.1mg/ml，NaCl：9mg/ml，CaCl2.2H2O：0.25mg/ml，Na2HPO4.7H2O：0.28mg/ml。将上述各成份溶解于去离子水中，调节pH值为7.8，4℃冰箱保存备用。
, 百拇医药
1.2 标准曲线的建立 将上述人工泪液进行倍比稀释，采用双管法测定各管的吸光度A值，绘制成标准曲线，C＝0.9478×A+0.0053，R×R＝0.9999
1.3 ATS浸泡实验 12只未戴过的Etafilcon A材料镜片，含水量58%，随机分为2组，浸泡在2ml的ATS液中，65小时，37℃。镜片取出后，测出ATS中蛋白质的减少量。镜片用NS冲洗后，分成2组，分别加入5ml的A
与B护理液中，室温下浸泡，在2、4、6、24、30、72、96小时和1周时，分别测定上述浸泡液中的A值并据标准曲线计算蛋白量。1.4 镜片戴用实验 12名志愿者，均无眼部疾病，具角膜接触镜戴镜史，熟悉护理程序，有良好的依从性，其中男2名，女10名，年龄18～25岁，屈光度为-2.00至-6.50度，双眼戴用，使用Oxysept
双氧水(Allergan Co.)进行日戴护理，整个戴用期间不使用去蛋白质酶片，戴用8～10小时/天，2周后回收镜片，切成1/2等份，分为2组随机浸泡在5ml的护理液A与B中，在浸泡后的2、4、6、24、48、72小时及1周时对浸泡液中的蛋白质量进行测定。, 百拇医药
1.5 测试仪器 UV-260Spectrophotometer(SHIMADZU)，以280nm为测定波长，使用光径5mm的石英比色杯，用空白浸泡液调零。
2 结果
人工泪液镜片浸泡液中蛋白量的变化(见表1、2)。经ATS浸泡后，入A
液与B液的镜片上的蛋白质沉淀总量分别为1146.25μg、940.42μg。两种护理液所浸泡下的蛋白量随浸泡时间的延长，不断递增，A液在30小时已达到最大洗脱量，而B液达到最大洗脱量的时间能延续到72小时。两种护理液对应的最大洗脱量，A液320±20.9μg(72h时)；B液134±8.8μg(30h时)。若换算成洗脱百分比，A液为27.8%，而B液为27.8%，而B液仅为14.12%。在每一个测定时间点，A液为27.8%，而B的洗脱量几乎是B液为27.8%，而B的2倍，两者的差异经t检验处理，P<0.05。, 百拇医药
表1 ATS浸泡镜片的洗脱变化量 (μg，
±s) 护理液n
镜片浸泡时间(h)
2
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30
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1周
A
液, 百拇医药
6
149±16.6
234±21.2
284±19.4
308±18
313±18.3
320±20.9
313±12.2
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70±8.2
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2 ATS镜片经不同时间洗脱变化量的百分比(%)
护理液
n
镜片浸泡时间(h)
2
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30
72
1周
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A
液6
13.0
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24.74
26.74
27.72
27.88
27.33
B
液6
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7.38
11.0
13.83
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14.12
13.36
13.29
人戴用镜片浸泡液中蛋白量的变化在2h到1周期间，两种洗脱液中的蛋白量均随时间递增。在1周内，A
液的洗脱量从70.1μg增加到616.7μg；而B液的洗脱量从30.8μg增加到193.3μg(表3)。两者的差异经t检验处理，P<0.05。就洗脱量递增百分比而言，A液与B液均在24h达到最大，分别为79.16%、109.30%。, 百拇医药
表3 戴用镜片的洗脱变化量 (平均值，μg) 护理液
n
镜片浸泡时间(h)
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A
液, 百拇医药
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3 讨论
泪液中的蛋白质被认为是引起角膜接触镜戴用并发症的主要原因[1，2]。正常泪液的蛋白成份很复杂，大约含有60余种蛋白质，镜片上蛋白沉淀的成份与泪液大致相同，其中溶菌酶占1/3左右。由于临床实验中不可能配制出全部成份的模拟泪液，因此，着重分析溶菌酶的变化，大致可以反映出镜片上蛋白质沉淀的情况。而且，溶菌酶的分子量较低，约14kD，容易穿透镜片的微孔，沉积在镜片的基质内。FDA分类中的第四类镜片，由于其含水量高，镜片表面的离子化程度高，能吸附相当数量的蛋白质，尤其是溶菌酶成份，所以，这一特点使本实验的可测性高。
无论何种护理液系统，都不能使洗脱下的蛋白质数量无限增加，在某一特定的时间点，洗脱量将达到最大极限，此后，洗脱量的增加出现波动。由此，浸泡镜片所用的护理液应该定期更换，否则，镜片上的蛋白质沉淀会“反跳”。这一最大洗脱时间点，在不同的护理液是不同的，可以作为衡量护理液除蛋白能力的一项指标。
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在ATS浸泡实验中，镜片上的蛋白质沉淀主要是溶菌酶，其他成份少，相互作用也小，溶菌酶就比较容易在早期被洗脱下来，所以，最大洗脱量出现较早。一般地，在体外实验中，浸泡6h左右，可接近最大洗脱效果，6h以后，洗脱量增加不显著，1周时，已出现下趋势，所以，临床上进行护理液洗脱效果的体外实验时，可以将6h作为测试点。
在戴用镜片的实验结果中，其最大洗脱量出现时间相对延迟，在1周时尚未出现洗脱效率的下降，其与ATS浸泡实验的这种差异可能是因为：①尽管戴用者每日清洗、护理，但镜片戴用长达2周，相当于重复多次的ATS浸泡，镜片沉淀中的蛋白质数量产生累加效应，部分可能渗透到镜片的基质中，基质中的蛋白质需要相对长的洗脱时间[5，6]。②由于戴用镜片上蛋白质成份相对复杂，除溶菌酶外，尚有大量的非溶菌酶蛋白质成份，以及脂质等非蛋白质成份，上述成分之间相互作用[7]，对溶菌酶产生牵制作用，使得溶菌酶产生缓慢脱离的效应。③某些沉淀蛋白质本身结构及其理化性质特殊，这些成份与镜片结合较紧密，早期不容易被洗下，而随浸泡时间的延长，当溶菌酶大部分洗脱下来后，才不断地从镜片上脱离下来。④在洗脱后期，部分非蛋白质成份被洗脱下来。分析洗脱量的递增百分比发现，A
液与B液均在4h达到最高值，因此，当以戴用镜片为测试对象来比较护理液的洗脱效果时，24h可作为测试时间点。, 百拇医药
本实验表明，在不使用除蛋白酶片情况下，无论何种护理系统，都不能将镜片上的蛋白质沉淀全部洗下，大部分仍然存在于镜片上，所以，在目前情况下，除蛋白酶片的使用依然是重要的护理步骤之一。
致谢：感谢北京同仁隐形眼镜中心的全体工作人员协助收集镜片，及北京眼科研究所的孙旭光、王智群、宋丽红对实验工作的帮助。
本文受卫生部临床重点课题资助
参考文献
[1] Richard NR，Anderson JA，Tasveska ZG，et al. Evaluation of tear deposits on contact lenses from patients with and without giant papillary conjunctivites. CLAO J，1992，18：143
, http://www.100md.com
[2] McClellan BH，Whitney CR，Newman LP，et al. Immunoglobulins in tears. Am J Ophthalmol，1973，76：89
[3] Gachon AM，Verrelle P，Betail G，et al. Immunologial and electrophoretic studies of human tear proteins. Exp Eye Res，1979，29：539
[4] Gudmundsson GO，Woodward FD，Fowler SA，et al. Identification of proteins in contact lens surface deposits by immunofluorescence microscopy. Arch Ophthalmol，1985，103：196
, 百拇医药 [5] Hu J，Tartaglia L，Kohler J，et al. Gentle touch TM，a lens material resistant to protein deposition. CLAO，1995，21：93
[6] Baines MG，Cai F，Backman HA，et al. Adsorption and removal of protein bound to hydrogel contact lenses. Optom Vis Sci，1990，67：807
[7] Bontempo AR，Rapp J. Protein-lipid interaction on the surface of a rigid gas permeable contact lens in vitro. Curr Eye Tes，1997，16：776
(收稿：1999-04-10，修回：1999-04-22), 百拇医药