葡萄糖对血管内皮细胞生长的影响
作者：柴伟栋 陈家伟 崔毓桂 沈 捷
单位：南京医科大学第一附属医院内分泌科 邮政编码：210029
关键词：葡萄糖 糖尿病大血管并发症 内皮细胞
江苏医药990306 摘要 通过内皮细胞(EC)培养，研究高血糖在糖尿病(DM)大血管并发症中所起的作用。结果：(1)高浓度葡萄糖(Glu)造成EC增殖抑制，并与Glu浓度呈正相关；(2)高浓度Glu能促进EC死亡。本文提示高血糖能促进DM大血管病变的形成和发展。
目前对血糖在糖尿病(DM)大血管并发症中的作用存在争论，一种意见认为DM是大血管并发症强烈的危险因素，DM独有的高血糖与过高的大血管病变有关，但也有研究显示控制血糖并不能减少DM者大血管病变的发生。由于血管内皮细胞(EC)异常对血管病变的发生至关重要，因此我们通过对大血管EC体外培养，研究高浓度葡萄糖(Glu)对EC增殖及死亡的影响，明确高血糖是否在DM大血管并发症发生、发展中起作用。
, 百拇医药
材料和方法
一、细胞培养及鉴定：取胎公牛胸主动脉，以0.25%胰酶(美国Sigma公司)消化血管内膜面37℃、25～30分钟。消化下来的EC在20%小牛血清的M199中培养，EC接近融合时用0.125%胰酶消化4～5分钟，传代。细胞鉴定通过EC融合后光镜下为单层鹅卵石状以及间接免疫荧光检测Ⅷ因子相关抗原。
取2～4代细胞，以8×104个细胞/ml接种于24孔培养板上，实验前换入实验用液：Glu5.5mM(对照组)，Glu20mM，Glu30mM，Glu40mM，Glu50mM；甘露醇(Man)40mM。
二、检测方法：
1.细胞增殖率的测定：加入实验用液48hr后，每培养孔加入luci3H-TdR(中国原子能科学研究所)，6小时后消化洗脱细胞，经液闪计数器(Bcckmcn)测定放射活性cpm。DNA合成增殖率(%)＝(实验组cpm值-对照组cpm值)/对照组cpm值×100%。
, 百拇医药
2.采用噻唑兰(MTT)细胞染色法观察EC生长过程：EC接种于24孔培养板24小时后换入实验用液，3天换液一次，分别于此后1～10天检测。每孔加入MTT(5mg/ml，Sigma公司)150μl，37℃4～6小时后，于酶标仪570nm处测OD值。
3.EC死亡率的测定：0.4%台酚蓝染色2分钟，细胞计数板上计数。
4.统计学处理：F检验、t检验和直线相关回归。
结 果
1.不同浓度Glu对EC增殖的影响(见表1)：
表1 不同浓度Glu对EC增殖的影响 组别
组数
cpm值
, 百拇医药
DNA合成增殖率(%)
对 照
10
3433.30±176.45
Glu20mM
10
3512.30±244.04
2.30
Glu30mM
10
3231.30±215.68
- 5.88*△
, 百拇医药
Glu40mM
10
1946.60±128.55
-43.30**△
Glu50mM
10
1544.90±139.23
-55.00**△
Man40mM
10
2608.30±215.74
, http://www.100md.com
-24.03**△＃
注：各组与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与Glu20mM组比较，△P<0.01；与Glu40mM比较，＃P<0.05。
对Glu20mM、30mM、40mM、50mM四点行相关分析发现Glu浓度与EC增殖呈负相关，相关系数γ为-0.97(P<0.05)。
2.高浓度Glu下EC生长过程：从加入实验用液48小时后，Glu40mM条件下生长的EC数就明显低于对照组。对照组细胞在第6～7天已融合，而Glu40mM组至第9～10天融合，明显迟于对照组。EC融合时MTT的OD值分别为：对照组1.1326，Glu组40mM1.1288，Man40mM组1.1525，各组间无显著性差异(P>0.05)。
3.观察高浓度Glu对EC死亡的影响(见表2):
, 百拇医药
表2 不同浓度Glu对EC死亡的影响 组别
组数
EC死亡率(%)
48小时
72小时
对 照
6
23.97
24.85
Glu20mM
6
25.74
30.07*＃
, 百拇医药
Glu40mM
6
29.13*
35.16**△＃
注：各组与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与Glu20mM组比较，△P<0.05；48小时与72小时之间比较，＃P<0.05。讨 论
许多细胞对Glu摄取是通过自身调节细胞膜上特异Glu转运体来进行的，但EC缺乏这种调节[1，2]，因而为高浓度Glu损伤血管内皮创造了条件。我们研究证实高浓度Glu能促进EC死亡，抑制EC的增殖，并使体外培养的EC达到完全融合的时间延长。
高浓度Glu损伤EC机制主要是(1)多元醇途径活性增强，导致细胞生长必需的肌醇减少及胞内山梨醇聚集、高渗透压[3]。我们在其它培养条件不变的情况下加入高浓度Man，模拟高糖所致的高渗环境，发现EC生长同样受到抑制，证明高渗是Glu抑制EC增殖的原因之一。有意义的是在相同浓度下(40mM)Glu对EC增殖的抑制程度明显强于Man，提示除细胞内渗透压增高影响EC生长外，显然还有其它机制；(2)非酶糖基化及糖基化终末产物(AGEs)的形成，AGEs引起EC增殖异常，并促进EC死亡[2，3]；(3)高糖状态下产生过多的氧自由基，其对EC产生严重的毒害作用[4，5]。
, 百拇医药
进一步研究发现Glu浓度与EC增殖呈明显负相关，随着Glu浓度增加对EC增殖的抑制作用就越强，说明Glu浓度越高，对EC损伤作用也越大；此外在高浓度Glu下EC死亡数随培养时间延长而增加，可见Glu对EC损伤呈浓度和时间依赖性。这是因为EC内渗透压高低及AGEs、氧自由基产生量的多少与EC暴露于Glu的浓度和时间呈正相关。
研究结果推测DM患者除高血压、血脂异常、吸烟等因子损伤血管内皮外，高血糖通过抑制EC增殖、促进EC死亡同样也能损伤血管内皮，这就可以解释在无上述致血管病变传统危险因素情况下，DM患者及动物中出现血管内皮损伤、EC丧失以及早期血管病变就具有的EC增殖低下的特征。
近年研究发现在DM大血管并发症形成过程中，氧化的低密度脂蛋白(ox-LDL)对血管内皮损伤起了重要作用，而且正常EC能够清除血管壁的异常脂蛋白[6，7]。在高浓度葡萄糖/DM状态下，ox-LDL及氧化的糖基化LDL(ogLDL)明显增加[7]。因此，高血糖一方面促进EC损伤，导致血管内皮完整性破坏和血管活性物质的分泌异常，EC清除血管壁ox-LDL、ogLDL能力减弱，另一方面致使ox-LDL及ogLDL明显增多，结果是血管内皮受到更严重的损害。DM状况下高血糖与ox-LDL、ogLDL对血管内皮损伤的这种正性协同作用可能是DM患者大血管病发生率高、病情重的重要原因。
, http://www.100md.com
DM大血管病变的发生为多因素所致，其中高血糖也起了重要作用。今后需进一步了解这些致病因素是如何在DM状态下共同作用促发DM大血管病变的。
参考文献
[1] Kaiser N, et al. Diabetes 1993；42(1)：80.
[2] Giardino I, et al. J Clin Invest 1994；94(1)：110.
[3] King GL, et al. Annu Rev Med 1994；45：179.
[4] Graier WF, et al. Diabetes 1996；45：1386.
[5] Kamata K, et al. Br J Pharma 1996；119：583.
[6] Desfaits AC,et al. Metabolism 1997；46(10)：1150.
[7] Kobayashi K, et al. Horm Metab Res 1995；27(8)：356.
(1997年12月22日收稿 1998年8月10日修回), 百拇医药
单位：南京医科大学第一附属医院内分泌科 邮政编码：210029
关键词：葡萄糖 糖尿病大血管并发症 内皮细胞
江苏医药990306 摘要 通过内皮细胞(EC)培养，研究高血糖在糖尿病(DM)大血管并发症中所起的作用。结果：(1)高浓度葡萄糖(Glu)造成EC增殖抑制，并与Glu浓度呈正相关；(2)高浓度Glu能促进EC死亡。本文提示高血糖能促进DM大血管病变的形成和发展。
目前对血糖在糖尿病(DM)大血管并发症中的作用存在争论，一种意见认为DM是大血管并发症强烈的危险因素，DM独有的高血糖与过高的大血管病变有关，但也有研究显示控制血糖并不能减少DM者大血管病变的发生。由于血管内皮细胞(EC)异常对血管病变的发生至关重要，因此我们通过对大血管EC体外培养，研究高浓度葡萄糖(Glu)对EC增殖及死亡的影响，明确高血糖是否在DM大血管并发症发生、发展中起作用。
, 百拇医药
材料和方法
一、细胞培养及鉴定：取胎公牛胸主动脉，以0.25%胰酶(美国Sigma公司)消化血管内膜面37℃、25～30分钟。消化下来的EC在20%小牛血清的M199中培养，EC接近融合时用0.125%胰酶消化4～5分钟，传代。细胞鉴定通过EC融合后光镜下为单层鹅卵石状以及间接免疫荧光检测Ⅷ因子相关抗原。
取2～4代细胞，以8×104个细胞/ml接种于24孔培养板上，实验前换入实验用液：Glu5.5mM(对照组)，Glu20mM，Glu30mM，Glu40mM，Glu50mM；甘露醇(Man)40mM。
二、检测方法：
1.细胞增殖率的测定：加入实验用液48hr后，每培养孔加入luci3H-TdR(中国原子能科学研究所)，6小时后消化洗脱细胞，经液闪计数器(Bcckmcn)测定放射活性cpm。DNA合成增殖率(%)＝(实验组cpm值-对照组cpm值)/对照组cpm值×100%。
, 百拇医药
2.采用噻唑兰(MTT)细胞染色法观察EC生长过程：EC接种于24孔培养板24小时后换入实验用液，3天换液一次，分别于此后1～10天检测。每孔加入MTT(5mg/ml，Sigma公司)150μl，37℃4～6小时后，于酶标仪570nm处测OD值。
3.EC死亡率的测定：0.4%台酚蓝染色2分钟，细胞计数板上计数。
4.统计学处理：F检验、t检验和直线相关回归。
结 果
1.不同浓度Glu对EC增殖的影响(见表1)：
表1 不同浓度Glu对EC增殖的影响 组别
组数
cpm值
, 百拇医药
DNA合成增殖率(%)
对 照
10
3433.30±176.45
Glu20mM
10
3512.30±244.04
2.30
Glu30mM
10
3231.30±215.68
- 5.88*△
, 百拇医药
Glu40mM
10
1946.60±128.55
-43.30**△
Glu50mM
10
1544.90±139.23
-55.00**△
Man40mM
10
2608.30±215.74
, http://www.100md.com
-24.03**△＃
注：各组与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与Glu20mM组比较，△P<0.01；与Glu40mM比较，＃P<0.05。
对Glu20mM、30mM、40mM、50mM四点行相关分析发现Glu浓度与EC增殖呈负相关，相关系数γ为-0.97(P<0.05)。
2.高浓度Glu下EC生长过程：从加入实验用液48小时后，Glu40mM条件下生长的EC数就明显低于对照组。对照组细胞在第6～7天已融合，而Glu40mM组至第9～10天融合，明显迟于对照组。EC融合时MTT的OD值分别为：对照组1.1326，Glu组40mM1.1288，Man40mM组1.1525，各组间无显著性差异(P>0.05)。
3.观察高浓度Glu对EC死亡的影响(见表2):
, 百拇医药
表2 不同浓度Glu对EC死亡的影响 组别
组数
EC死亡率(%)
48小时
72小时
对 照
6
23.97
24.85
Glu20mM
6
25.74
30.07*＃
, 百拇医药
Glu40mM
6
29.13*
35.16**△＃
注：各组与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与Glu20mM组比较，△P<0.05；48小时与72小时之间比较，＃P<0.05。讨 论
许多细胞对Glu摄取是通过自身调节细胞膜上特异Glu转运体来进行的，但EC缺乏这种调节[1，2]，因而为高浓度Glu损伤血管内皮创造了条件。我们研究证实高浓度Glu能促进EC死亡，抑制EC的增殖，并使体外培养的EC达到完全融合的时间延长。
高浓度Glu损伤EC机制主要是(1)多元醇途径活性增强，导致细胞生长必需的肌醇减少及胞内山梨醇聚集、高渗透压[3]。我们在其它培养条件不变的情况下加入高浓度Man，模拟高糖所致的高渗环境，发现EC生长同样受到抑制，证明高渗是Glu抑制EC增殖的原因之一。有意义的是在相同浓度下(40mM)Glu对EC增殖的抑制程度明显强于Man，提示除细胞内渗透压增高影响EC生长外，显然还有其它机制；(2)非酶糖基化及糖基化终末产物(AGEs)的形成，AGEs引起EC增殖异常，并促进EC死亡[2，3]；(3)高糖状态下产生过多的氧自由基，其对EC产生严重的毒害作用[4，5]。
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进一步研究发现Glu浓度与EC增殖呈明显负相关，随着Glu浓度增加对EC增殖的抑制作用就越强，说明Glu浓度越高，对EC损伤作用也越大；此外在高浓度Glu下EC死亡数随培养时间延长而增加，可见Glu对EC损伤呈浓度和时间依赖性。这是因为EC内渗透压高低及AGEs、氧自由基产生量的多少与EC暴露于Glu的浓度和时间呈正相关。
研究结果推测DM患者除高血压、血脂异常、吸烟等因子损伤血管内皮外，高血糖通过抑制EC增殖、促进EC死亡同样也能损伤血管内皮，这就可以解释在无上述致血管病变传统危险因素情况下，DM患者及动物中出现血管内皮损伤、EC丧失以及早期血管病变就具有的EC增殖低下的特征。
近年研究发现在DM大血管并发症形成过程中，氧化的低密度脂蛋白(ox-LDL)对血管内皮损伤起了重要作用，而且正常EC能够清除血管壁的异常脂蛋白[6，7]。在高浓度葡萄糖/DM状态下，ox-LDL及氧化的糖基化LDL(ogLDL)明显增加[7]。因此，高血糖一方面促进EC损伤，导致血管内皮完整性破坏和血管活性物质的分泌异常，EC清除血管壁ox-LDL、ogLDL能力减弱，另一方面致使ox-LDL及ogLDL明显增多，结果是血管内皮受到更严重的损害。DM状况下高血糖与ox-LDL、ogLDL对血管内皮损伤的这种正性协同作用可能是DM患者大血管病发生率高、病情重的重要原因。
, http://www.100md.com
DM大血管病变的发生为多因素所致，其中高血糖也起了重要作用。今后需进一步了解这些致病因素是如何在DM状态下共同作用促发DM大血管病变的。
参考文献
[1] Kaiser N, et al. Diabetes 1993；42(1)：80.
[2] Giardino I, et al. J Clin Invest 1994；94(1)：110.
[3] King GL, et al. Annu Rev Med 1994；45：179.
[4] Graier WF, et al. Diabetes 1996；45：1386.
[5] Kamata K, et al. Br J Pharma 1996；119：583.
[6] Desfaits AC,et al. Metabolism 1997；46(10)：1150.
[7] Kobayashi K, et al. Horm Metab Res 1995；27(8)：356.
(1997年12月22日收稿 1998年8月10日修回), 百拇医药