同种异系抗原门静脉接种诱导特异性免疫耐受的实验研究
作者：周海宽 闵志廉 朱有华
单位：第二军医大学长征医院泌尿外科(上海，200003)
关键词：门静脉接种；免疫抑制；实验研究
肾脏病与透析肾移植杂志990313
1946年Chase和Sultzberger发现预先口服一种抗原，可诱导机体对此抗原产生免疫耐受，这一现象被称为Chase和Sultzberger效应[1]。随后的研究表明，肝脏在免疫调节中发挥重要的作用，经门静脉预先行抗原的接种(portal venous inoculation)也可诱导机体产生对此抗原的特异性免疫无反应[2]。为明确同种异系抗原门静脉接种对受体小鼠免疫状态的影响，我们进行了实验研究，报告如下。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 动物 BALB/C，NIH/q同品系小鼠，雌性，7～10周龄，普通级。购自第一军医大学实验动物中心。
1.2 NIH/q鼠供体脾细胞的制备 NIH/q小鼠在无菌条件下取出脾脏，剪碎后经不锈钢网过滤，以NH4Cl溶液处理去除红细胞，混于Hanks液中，离心洗涤，调整细胞浓度至2×1010/L。
1.3 门静脉注射 BALB/C小鼠用0.7%戊巴比妥钠按0.1 ml/10g体重腹腔注射麻醉，腹壁用碘酒酒精消毒，切开腹壁约1 cm长，向左侧翻开小肠，暴露肠系膜上静脉，用5号针头穿刺肠系膜上静脉，注入供体脾细胞0.5 ml，迅速拔出针头，用盐水纱球压迫穿刺点1～2 min。缝合切口。
1.4 实验分组 实验组，1010NIH/q鼠脾细胞0.5ml行BALB/C鼠门静脉接种，隔一周后用同等数量的NIH/q鼠脾细胞行BALB/C鼠背部皮下接种两次，两次接种的间隔时间为一周。对照组，同等数量的NIH/q鼠脾细胞行BALB/C鼠腔静脉接种，隔一周后背部皮下接种二次。空白组，仅背部皮下接种二次。
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1.5 迟发性超敏反应(DTH)测定 第二次皮下接种后一周用1010NIH/q脾细胞25μl注射于BALB/C鼠后脚掌，24h后测量脚掌厚度的增值。对侧后脚掌注射同系BALB/C鼠脾细胞以作对照。
1.6 混合淋巴细胞培养测定单向增生反应(MLR)按文献[3]方法进行。
1.7 统计学处理 采用t检验，P<0.05为有统计学意义。
2 结果
门静脉注射同种异系脾细胞诱导供体特异性MLR耐受和DTH抑制：NIH/q鼠脾细胞行BALB/C鼠门静脉接种，随后以同系抗原免疫，取供、受体淋巴细胞行混合培养，其增生反应明显受到抑制；随后以同系抗原刺激而引起的DTH也减弱。而对照组和空白组供、受体淋巴细胞培养表现出明显的增生反应；同系供体抗原刺激引起明显的DTH反应。所有数据经统计学处理，表明门静脉接种组与其它两组间的差异非常显著(P<0.001)。对照组与空白组之间差异不显著(P<0.05)，见附表。
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附表 门静脉接种诱导供受体MLR耐受和受体对供体脾细胞DTH抑制 组别
n
MLR
(刺激指数SI)
DTH
(脚掌厚度增值×10-2mm)
实验组
8
3.51±0.55
7.41±0.600*
对照组
, 百拇医药
8
34.83±3.90
23.51±1.69
空白组
8
35.99±3.83
22.39±2.85△
与对照组和空白组比较*P<0.001，与对照组比较△P>0.05
3 讨论
肝脏是一个重要的免疫器官，其所拥有的网状内皮细胞占机体所有网状内皮系统的90%，具有强大的吞噬功能和处理抗原的能力。由于其独特的解剖位置，所有经肠道吸收的抗原物质均通过门静脉进入肝脏。因此认为，门静脉耐受即肝脏耐受，肝脏在免疫调节中发挥重要作用。其中Kupffer细胞对抗原的吞噬和处理起主要作用。预先静脉注射Kupffer细胞阻断剂三氯化钆(Gadolinium chloride，GdCl3)可阻断门静脉耐受的诱导，恢复机体对门静脉输入抗原的DTH反应[2，4].
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肝脏具有独特的生化代谢环境，肝脏内精氨酸酶(arginase)的水平要高出其它器官25倍，所以进入肝脏的精氨酸(arginine)被迅速代谢成鸟氨酸和尿素，使肝脏内精氨酸浓度极低。有实验表明，在Kupffer细胞的激活过程中，如果缺乏精氨酸，将产生高水平的前列腺素E2(PGE2)而足以抑制TNF-α的释放。正因为如此，同种异系抗原经门静脉进入肝脏，经Kupffer细胞吞噬处理，才能产生免疫抑制作用[5，6]
同时，有实验表明，同种异系抗原的门静脉接种还可能诱导机体产生抗原特异性的抑制性免疫活性细胞和起封闭作用的活性抗体[7～9]，但是其具体的确切机制仍然不清楚。Qian等[10]的实验表明，同种异系抗原直接进入肝脏，被Kupffer细胞吞噬处理后呈递给T淋巴细胞，由于肝脏内独特的生化代谢环境，可使抗原特异的T效应细胞在肝脏内被捕获清除，导致外周血中抗原特异的免疫效应细胞的耗竭。
, 百拇医药
本实验结果表明，同种异系抗原的门静脉接种显著抑制随后同系抗原免疫后引起的DTH反应和MLC增生反应。提示同种异系抗原直接经门静脉进入肝脏，避开了对机体免疫活性细胞的激活，产生了抗原特异的免疫抑制信号，诱导出抗原特异的免疫耐受。而同种异系抗原经腔静脉注射的对照组以及空白组，经NIH/q鼠脾细胞免疫后均表现出对NIH/q鼠脾细胞抗原明显的DTH反应和MLC增生反应，说明同种异系抗原经其它途径进入机体，被机体的免疫系统识别为异体抗原。门静脉耐受这一现象确切的细胞和分子水平的机制仍有待进行更深入细致的研究。
参考文献
1 Kamei T，Callery MP，Flye MW.Pretransplant portal venous administration of donor antigen and portal venous allograft drainage synergistically prolong rat cardiac allograft survival.Surgery，1990，108：415
, 百拇医药
2 Kamei T，Callery MP，Flye MW.Kupffer cell blockade prevents prolongation of rat cardiac allografts drained via the portal vein.Hepatology，1989，10：624
3 郑武飞.实用临床免疫学技术.天津：天津科学技术出版社，1991.123～124
4 张永法，张楠伟，池原进.肝脏的捕获效应与门脉耐受的关系.中华微生物学和免疫学杂志，1995，15：23
5 Kamei T，Callery MP，Flye MW.Intravenous and protal venous administration of modified donor antigen prolongs rat parathyroid allograft survival.Surgery，1989，106：1028
, 百拇医药
6 Callery MP，Kamei T，Flye MW.The anatomic site-specificity of tolerance induction to alloantigen.Transplantation，1990，49：230
7 Sano S，Suda T，Qian JH et al.Abrogation of the capacity of delayed-type hypersensitivity responses to alloantigens by intravenous injection of neuraminidase-treated allogeneic cells.J Immunol，1987，139：3652
8 Fujiwara H，Qian JH，Satoh S et al.Studies on the induction of tolerance to alloantigens Ⅱ.The generation of serum factor(s)able to transfer alloantigen-specific tolerane for delayed-type hypersensitivity by portal venous inoculation with allogeneic cells.J Immunol，1986，136：2763
, http://www.100md.com
9 Sato S，Qian JH，Kokudo S et al.Studies on the induction of tolerance to alloantigens Ⅲ.Induction of antibodies directed against alloantigen-specific delayed-type hypersensitivity T cells by a single injection of allogeneic lymphocytes via portal venous route.J Immunol，1988，140：717
10 Qian JH，Hashimoto T，Fujiwara H et al.Studies on the induction of tolerance to alloantigens Ⅰ.The abrogation of potentials for delayed-type-hypersensitivity responses to alloantigens by portal venous inoculation with allogeneic cells.J Immunol，1985，134：3656
(1999-01-11收稿), http://www.100md.com
单位：第二军医大学长征医院泌尿外科(上海，200003)
关键词：门静脉接种；免疫抑制；实验研究
肾脏病与透析肾移植杂志990313
1946年Chase和Sultzberger发现预先口服一种抗原，可诱导机体对此抗原产生免疫耐受，这一现象被称为Chase和Sultzberger效应[1]。随后的研究表明，肝脏在免疫调节中发挥重要的作用，经门静脉预先行抗原的接种(portal venous inoculation)也可诱导机体产生对此抗原的特异性免疫无反应[2]。为明确同种异系抗原门静脉接种对受体小鼠免疫状态的影响，我们进行了实验研究，报告如下。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 动物 BALB/C，NIH/q同品系小鼠，雌性，7～10周龄，普通级。购自第一军医大学实验动物中心。
1.2 NIH/q鼠供体脾细胞的制备 NIH/q小鼠在无菌条件下取出脾脏，剪碎后经不锈钢网过滤，以NH4Cl溶液处理去除红细胞，混于Hanks液中，离心洗涤，调整细胞浓度至2×1010/L。
1.3 门静脉注射 BALB/C小鼠用0.7%戊巴比妥钠按0.1 ml/10g体重腹腔注射麻醉，腹壁用碘酒酒精消毒，切开腹壁约1 cm长，向左侧翻开小肠，暴露肠系膜上静脉，用5号针头穿刺肠系膜上静脉，注入供体脾细胞0.5 ml，迅速拔出针头，用盐水纱球压迫穿刺点1～2 min。缝合切口。
1.4 实验分组 实验组，1010NIH/q鼠脾细胞0.5ml行BALB/C鼠门静脉接种，隔一周后用同等数量的NIH/q鼠脾细胞行BALB/C鼠背部皮下接种两次，两次接种的间隔时间为一周。对照组，同等数量的NIH/q鼠脾细胞行BALB/C鼠腔静脉接种，隔一周后背部皮下接种二次。空白组，仅背部皮下接种二次。
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1.5 迟发性超敏反应(DTH)测定 第二次皮下接种后一周用1010NIH/q脾细胞25μl注射于BALB/C鼠后脚掌，24h后测量脚掌厚度的增值。对侧后脚掌注射同系BALB/C鼠脾细胞以作对照。
1.6 混合淋巴细胞培养测定单向增生反应(MLR)按文献[3]方法进行。
1.7 统计学处理 采用t检验，P<0.05为有统计学意义。
2 结果
门静脉注射同种异系脾细胞诱导供体特异性MLR耐受和DTH抑制：NIH/q鼠脾细胞行BALB/C鼠门静脉接种，随后以同系抗原免疫，取供、受体淋巴细胞行混合培养，其增生反应明显受到抑制；随后以同系抗原刺激而引起的DTH也减弱。而对照组和空白组供、受体淋巴细胞培养表现出明显的增生反应；同系供体抗原刺激引起明显的DTH反应。所有数据经统计学处理，表明门静脉接种组与其它两组间的差异非常显著(P<0.001)。对照组与空白组之间差异不显著(P<0.05)，见附表。
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附表 门静脉接种诱导供受体MLR耐受和受体对供体脾细胞DTH抑制 组别
n
MLR
(刺激指数SI)
DTH
(脚掌厚度增值×10-2mm)
实验组
8
3.51±0.55
7.41±0.600*
对照组
, 百拇医药
8
34.83±3.90
23.51±1.69
空白组
8
35.99±3.83
22.39±2.85△
与对照组和空白组比较*P<0.001，与对照组比较△P>0.05
3 讨论
肝脏是一个重要的免疫器官，其所拥有的网状内皮细胞占机体所有网状内皮系统的90%，具有强大的吞噬功能和处理抗原的能力。由于其独特的解剖位置，所有经肠道吸收的抗原物质均通过门静脉进入肝脏。因此认为，门静脉耐受即肝脏耐受，肝脏在免疫调节中发挥重要作用。其中Kupffer细胞对抗原的吞噬和处理起主要作用。预先静脉注射Kupffer细胞阻断剂三氯化钆(Gadolinium chloride，GdCl3)可阻断门静脉耐受的诱导，恢复机体对门静脉输入抗原的DTH反应[2，4].
, http://www.100md.com
肝脏具有独特的生化代谢环境，肝脏内精氨酸酶(arginase)的水平要高出其它器官25倍，所以进入肝脏的精氨酸(arginine)被迅速代谢成鸟氨酸和尿素，使肝脏内精氨酸浓度极低。有实验表明，在Kupffer细胞的激活过程中，如果缺乏精氨酸，将产生高水平的前列腺素E2(PGE2)而足以抑制TNF-α的释放。正因为如此，同种异系抗原经门静脉进入肝脏，经Kupffer细胞吞噬处理，才能产生免疫抑制作用[5，6]
同时，有实验表明，同种异系抗原的门静脉接种还可能诱导机体产生抗原特异性的抑制性免疫活性细胞和起封闭作用的活性抗体[7～9]，但是其具体的确切机制仍然不清楚。Qian等[10]的实验表明，同种异系抗原直接进入肝脏，被Kupffer细胞吞噬处理后呈递给T淋巴细胞，由于肝脏内独特的生化代谢环境，可使抗原特异的T效应细胞在肝脏内被捕获清除，导致外周血中抗原特异的免疫效应细胞的耗竭。
, 百拇医药
本实验结果表明，同种异系抗原的门静脉接种显著抑制随后同系抗原免疫后引起的DTH反应和MLC增生反应。提示同种异系抗原直接经门静脉进入肝脏，避开了对机体免疫活性细胞的激活，产生了抗原特异的免疫抑制信号，诱导出抗原特异的免疫耐受。而同种异系抗原经腔静脉注射的对照组以及空白组，经NIH/q鼠脾细胞免疫后均表现出对NIH/q鼠脾细胞抗原明显的DTH反应和MLC增生反应，说明同种异系抗原经其它途径进入机体，被机体的免疫系统识别为异体抗原。门静脉耐受这一现象确切的细胞和分子水平的机制仍有待进行更深入细致的研究。
参考文献
1 Kamei T，Callery MP，Flye MW.Pretransplant portal venous administration of donor antigen and portal venous allograft drainage synergistically prolong rat cardiac allograft survival.Surgery，1990，108：415
, 百拇医药
2 Kamei T，Callery MP，Flye MW.Kupffer cell blockade prevents prolongation of rat cardiac allografts drained via the portal vein.Hepatology，1989，10：624
3 郑武飞.实用临床免疫学技术.天津：天津科学技术出版社，1991.123～124
4 张永法，张楠伟，池原进.肝脏的捕获效应与门脉耐受的关系.中华微生物学和免疫学杂志，1995，15：23
5 Kamei T，Callery MP，Flye MW.Intravenous and protal venous administration of modified donor antigen prolongs rat parathyroid allograft survival.Surgery，1989，106：1028
, 百拇医药
6 Callery MP，Kamei T，Flye MW.The anatomic site-specificity of tolerance induction to alloantigen.Transplantation，1990，49：230
7 Sano S，Suda T，Qian JH et al.Abrogation of the capacity of delayed-type hypersensitivity responses to alloantigens by intravenous injection of neuraminidase-treated allogeneic cells.J Immunol，1987，139：3652
8 Fujiwara H，Qian JH，Satoh S et al.Studies on the induction of tolerance to alloantigens Ⅱ.The generation of serum factor(s)able to transfer alloantigen-specific tolerane for delayed-type hypersensitivity by portal venous inoculation with allogeneic cells.J Immunol，1986，136：2763
, http://www.100md.com
9 Sato S，Qian JH，Kokudo S et al.Studies on the induction of tolerance to alloantigens Ⅲ.Induction of antibodies directed against alloantigen-specific delayed-type hypersensitivity T cells by a single injection of allogeneic lymphocytes via portal venous route.J Immunol，1988，140：717
10 Qian JH，Hashimoto T，Fujiwara H et al.Studies on the induction of tolerance to alloantigens Ⅰ.The abrogation of potentials for delayed-type-hypersensitivity responses to alloantigens by portal venous inoculation with allogeneic cells.J Immunol，1985，134：3656
(1999-01-11收稿), http://www.100md.com