内毒素诱导急性肺损伤巨噬细胞炎症蛋白-2的表达
作者：金敬顺 陈正堂 李胜亮
单位：金敬顺 陈正堂 李胜亮 第三军医大学附属新桥医院呼吸内科研究所 重庆，400037
关键词：巨噬细胞炎症蛋白-2；急性肺损伤；内毒素
第三军医大学学报990402 提 要 目的：探讨趋化性细胞因子巨噬细胞炎症蛋白-2(MIP-2)在内毒素诱导急性肺损伤(ALI)中的可能作用。方法：采用斑点杂交及原位杂交技术对ALI大鼠肺组织中MIP-2 mRNA的表达进行定量和定位研究。结果：内毒素性ALI各组大鼠肺组织MIP-2 mRNA表达量显著高于对照组，且在峰值水平与血浆及肺组织匀浆髓过氧化物酶(MPO)活力呈正相关(r=0.729,r=0.885,P<0.05)。原位杂交发现在ALI早期肺内巨噬细胞是MIP-2的主要分泌细胞。结论：肺巨噬细胞释放的MIP-2可能是ALI时多形核白细胞(PMN)在肺内大量浸润并激活的原因之一，因而参与了ALI的早期发病过程。
, 百拇医药
中图法分类号 R563.02;R392.1
Study of macrophage inflammatory protein-2 mRNA expression LSP-induced acute lung injury
Jin Jingsun, Chen Zhengtang, Li Shengliang
(Research Institute of Respiratory Disease, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing,400037)
Abstract Objective: To study the potential role of chemotactic macrophage inflammatory protein-2 (MIP-2) in the development of LPS-induced acute lung injury (ALI). Methods: The amount and distribution of MIP-2 were determined in the lungs with ALI. Results: The expression of MIP-2 mRNA was significantly higher in the lungs of the animals with ALI than those of the control (P<0.01). In addition, The expression level of MIP-2 mRNA was positively correlated to the activity of myeloperoxidase in the plasma and lung homogenate (r=0.729, r=0.885 and P<0.05). It was confirmed with in situ hybridization that pulmonary macrophages were the predominant source of MIP-2 in the early stage of ALI. Conclusion: MIP-2 released mainly from pulmonary macrophages might contribute to the activation and sequestration of polymorphonuclear leucocytes in the lungs challenged with LPS. So MIP-2 might take part in the development of LPS-induced ALI.
, 百拇医药
Key words macrophage inflammatory protein-2; endotoxin; acute lung injury
本研究用内毒素诱导犬急性肺损伤(Acute lung injury, ALI)模型，用斑点杂交及原位杂交技术，观察巨噬细胞炎症蛋白-2(Macrophage inflammatory protein-2,MIP-2)mRNA的表达及细胞来源，并观察其对ALI时肺内多形核白细胞(Polymorphonuclear leukocyte,PMN)浸润的影响，旨在深入探讨ALI发病机制。
1 材料与方法
1.1 主要实验材料 健康Wistar大鼠(第三军医大学实验动物中心提供)，大肠杆菌O111-B4内毒素(LPS)(Sigma)，含MIP-2 cDNA质粒(美国Partricia A. Olson博士惠赠)，地高辛标记及检测试剂盒(宝灵曼公司)。
, http://www.100md.com
1.2 大鼠内毒素性ALI模型的建立
健康Wistar大鼠50只，雌雄不拘，体重180～230 g，随机分为内毒素性ALI 1、3、6、12 h组和对照组。内毒素组静脉注射LPS 5 mg/kg，对照组注射等量的生理盐水。按设计的时相点放血活杀，留取血浆、肺组织，行支气管肺泡灌洗，收取支气管肺泡灌洗液(BALF)待测。
1.3 鼠源性MIP-2 cDNA探针的制备及标记
含MIP-2 DNA的质粒经电穿孔法[1]导入大肠杆菌HB101中，大量扩增，碱裂解法提取质粒DNA，用EcoR-Ⅰ酶切后，电泳洗脱法回收MIP-2 cDNA片段(1 200 bp)，见图1。地高辛随机引物法标记。
1.4 鼠肺组织总RNA提取
, http://www.100md.com
采用异硫氰酸胍-酚-氯仿/异戊醇一步法[2]。
1.5 斑点印迹杂交
纯化后的目的基因及提取的肺组织总RNA，经紫外分光光度计定量后，将稀释为不同浓度的目的基因及10μg总RNA直接点于经处理的硝酸纤维素膜上，经烤膜、预杂交、洗膜及显色，薄层色谱扫描仪(日本岛津CS-9000型)500μm波长处扫描，以标准品各点的波形面积为纵坐标，浓度为横坐标，在半对数纸上作图，根据各样品点扫描峰面积确定MIP-2 mRNA的相对含量。
1.6 鼠肺组织原位杂交
参照文献[3]方法。取ALI 1 h组及对照组动物肺组织，主要步骤包括固定、切片、消化、预杂交、杂交、漂洗、显色、脱水、封片等。
1.7 血浆及肺组织匀浆髓过氧化物酶(MPO)测定
, 百拇医药
参照罗武生[4]的方法进行。
1.8 数据处理
实验数据以x±s表示。有关数据经方差分析、χ2检验、相关及回归分析法处理。
图1 MIP-2 cDNA质粒酶切电泳鉴定
Fig 1 Identification of plasmid PBR322 containing MIP-2 cDNA by EcoR-Ⅰ digestion
A：PBR322 digested by EcoR-Ⅰ
B：λ/Hind Ⅲ+EcoR-Ⅰ marker
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 内毒素诱导ALI大鼠肺组织病理学变化
ALI大鼠肺组织可见肺间质充血、水肿、出血，肺泡壁增厚，小动脉周围水肿套形成，细支气管粘膜上皮脱落等。除大量PMN外，尚可见到较多巨噬细胞(Macrophage,M
)浸润。
2.2 支气管肺泡灌洗液(BALF)白细胞计数、分类
ALI各组BALF白细胞总数、PMN分类、计数均显著高于对照组(P<0.01)。肺泡巨噬细胞(AM)因PMN所占比例显著增高而比例下降，但其绝对计数在ALI 3 h组及以后各组均显著升高(P<0.05～0.01)，见表1。
表 1 ALI各组及对照组BALF白细胞计数、分类
, http://www.100md.com
Tab 1 The white blood cell count anddifferential count of BALF Group
n
Cell count (×105/ml)
WBC
PMN
AM
Control
8
3.05±0.64
0.026±0.002
0.874±0.023
, http://www.100md.com
1 h
8
5.15±2.37**
0.334±0.054**
0.591±0.062*
3 h
8
8.23±2.53**
0.548±0.063**
0.434±0.065**
, 百拇医药
ALI
6 h
8
10.67±5.57**
0.542±0.072**
0.357±0.054**
12 h
8
9.13±2.68**
0.434±0.053**
0.425±0.058**
, http://www.100md.com
*：P<0.05,* *：P<0.01 vs control
2.3 肺组织MIP-2 mRNA定量分析
内毒素性ALI各组MIP-2 mRNA表达强度均非常显著高于对照组(P<0.01)，于ALI 3 h组达高峰，对照组为(52.6±7.15)pg/10 μg总RNA，峰值为(267.14±34.48)pg/10 μg总RNA，见图2、3。
2.4 肺组织原位杂交 在内毒素性ALI 1 h组大鼠肺组织中，可见位于肺小动、静脉及细支气管周围，疏松结缔组织内的M
MIP-2表达阳性，表现为胞浆内呈蓝紫色颗粒样着色。对照组阴性，见图4、5。
, 百拇医药
图 2 对照组及急性肺损伤各组MIP-2 mRNA表达相对含量
Fig 2 The content of expression of MIP-2 mRNA
图 3 MIP-2 mRNA表达的斑点杂交检测
Fig 3 The expression of MIP-2 mRNA by dot hybridization
图 4 内毒素性ALI 1 h组大鼠，可见位于小气管周围的巨噬细胞MIP-2 mRNA表达阳性 (原位杂交×210)
Fig 4 The positive signals of MIP-2 mRNA in macrophages surrounding the bronchioles of ALI 1 h group (ISH×210)
, 百拇医药
图 5 对照组大鼠肺组织MIP-2 mRNA表达阴性 (原位杂交×210)
Fig 5 Negative expression of MIP-2 mRNA in the lung of control group (ISH×210)
2.5 血浆及肺组织匀浆MPO活力
血浆MPO活力在ALI 3 h及以后各组均显著高于对照组[0.047±0.017)U/ml]，并在6h达峰[(0.228±0.201)U/ml](P<0.01)。肺组织匀浆MPO活力，ALI各组高于对照组[(1.321±0.699)U/g]，亦于6 h达峰值[(2.764±0.283)U/g](P<0.01)，见表2。
表 2 ALI各组及对照组血浆及肺组织匀浆MPO测定
Tab 2 The MPO activity in plasma and lung homogenate Group
, http://www.100md.com
n
Plasma
Homogenate
Control
8
0.0468±0.0174
1.321±0.699
ALI 1 h
8
0.0498±0.0167
1.851±0.983*
ALI 3 h
, 百拇医药
8
0.1370±0.0340**
2.245±0.385**
ALI 6 h
8
0.2280±0.2010**
2.764±0.283**
ALI 12 h
8
0.1880±0.0186**
, 百拇医药 1.799±0.170**
*：P<0.05，* *：P<0.01 vs control
2.6 MIP-2 mRNA表达和MPO活力的相关性
血浆及肺组织匀浆MPO活力与MIP-2的表达的峰值水平呈正相关(r=0.729,r=0.885,P<0.05)。
3 讨论
已有报道，巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞等可分泌MIP-2，但这些研究多源于体外实验。本实验发现，在ALI 1 h组动物肺组织内，可见位于小气管及小血管周围疏松结缔组织内的M M
IP-2 mRNA表达阳性，表现为胞浆中许多紫蓝色的阳性颗粒；对照组阴性，提示在ALI早期，肺M
是MIP-2主要分泌细胞[5]。
, 百拇医药
MIP-2具有肝素结合位点，可与内皮细胞周围的肝素硫酸葡聚糖相互作用，并能上调PMN表面粘附分子CD11b/CD18的表达。当浓度为1～10 nmol/L时，还可引起PMN呼吸爆发[5]。本实验表明，ALI各组MIP-2 mRNA相对含量均显著高于对照组(P<0.01)，峰值在注射内毒素3 h组，6 h组则开始下降；而ALI组血浆及肺组织匀浆MPO活力亦显著升高，但于6 h方达高峰。MIP-2表达的峰值在前，MPO活力升高峰值在后，且MIP-2 mRNA表达与血浆及肺组织匀浆MPO活力呈正相关。文献报道，MPO是间接反映炎症部位PMN数目的良好指标。本实验结果表明，在内毒素性ALI时，肺巨噬细胞释放的MIP-2可能是引起PMN在肺内聚集并造成肺损伤的重要原因，因而在较早阶段参与了ALI的发病。
基金项目:国家自然科学基金资助项目,No.39670311
作者简介:金敬顺,35岁,主治医师,硕士,现在解放军254医院呼吸内科 天津,300142
, http://www.100md.com
参考文献
1 Dower W J, Miuer J F, Ragsdale C W, et al. High efficiency transformation of E. coli by high voltage eletroporation. Nucleic Acids Res,1988,16(13):6127
2 Chomozynske P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinum thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analyt Biochem,1987,162(1):156
3 蔡文琴，王伯
主编.实用免疫化学与核酸分子杂交技术.成都：四川科学技术出版社，1994.495～496
, 百拇医药
4 罗武生，郭兆贵.用髓过氧化物酶法定量测定心肌组织中的中性粒细胞.中国药理学通报，1990，6(4)：246
5 Xing R, Jordana M, kirpalani H, et al. Cytokine expression by neutrophils and macrophages in vivo: Endotoxin induces TNF-α, MIP-2, IL-1 β and IL-6 but not RANTES or TGF1 mRNA expression in acute lung inflammation. Am J Respir Cell Mol Bio,1994，10(2)：148
6 Driscoll K E. Macrophage inflammatory proteins:biology and role in pulmonary inflammatory. Exp lung Res,1994,20(6):473
收稿：1998-06-23
修回：1998-12-09, 百拇医药
单位：金敬顺 陈正堂 李胜亮 第三军医大学附属新桥医院呼吸内科研究所 重庆，400037
关键词：巨噬细胞炎症蛋白-2；急性肺损伤；内毒素
第三军医大学学报990402 提 要 目的：探讨趋化性细胞因子巨噬细胞炎症蛋白-2(MIP-2)在内毒素诱导急性肺损伤(ALI)中的可能作用。方法：采用斑点杂交及原位杂交技术对ALI大鼠肺组织中MIP-2 mRNA的表达进行定量和定位研究。结果：内毒素性ALI各组大鼠肺组织MIP-2 mRNA表达量显著高于对照组，且在峰值水平与血浆及肺组织匀浆髓过氧化物酶(MPO)活力呈正相关(r=0.729,r=0.885,P<0.05)。原位杂交发现在ALI早期肺内巨噬细胞是MIP-2的主要分泌细胞。结论：肺巨噬细胞释放的MIP-2可能是ALI时多形核白细胞(PMN)在肺内大量浸润并激活的原因之一，因而参与了ALI的早期发病过程。
, 百拇医药
中图法分类号 R563.02;R392.1
Study of macrophage inflammatory protein-2 mRNA expression LSP-induced acute lung injury
Jin Jingsun, Chen Zhengtang, Li Shengliang
(Research Institute of Respiratory Disease, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing,400037)
Abstract Objective: To study the potential role of chemotactic macrophage inflammatory protein-2 (MIP-2) in the development of LPS-induced acute lung injury (ALI). Methods: The amount and distribution of MIP-2 were determined in the lungs with ALI. Results: The expression of MIP-2 mRNA was significantly higher in the lungs of the animals with ALI than those of the control (P<0.01). In addition, The expression level of MIP-2 mRNA was positively correlated to the activity of myeloperoxidase in the plasma and lung homogenate (r=0.729, r=0.885 and P<0.05). It was confirmed with in situ hybridization that pulmonary macrophages were the predominant source of MIP-2 in the early stage of ALI. Conclusion: MIP-2 released mainly from pulmonary macrophages might contribute to the activation and sequestration of polymorphonuclear leucocytes in the lungs challenged with LPS. So MIP-2 might take part in the development of LPS-induced ALI.
, 百拇医药
Key words macrophage inflammatory protein-2; endotoxin; acute lung injury
本研究用内毒素诱导犬急性肺损伤(Acute lung injury, ALI)模型，用斑点杂交及原位杂交技术，观察巨噬细胞炎症蛋白-2(Macrophage inflammatory protein-2,MIP-2)mRNA的表达及细胞来源，并观察其对ALI时肺内多形核白细胞(Polymorphonuclear leukocyte,PMN)浸润的影响，旨在深入探讨ALI发病机制。
1 材料与方法
1.1 主要实验材料 健康Wistar大鼠(第三军医大学实验动物中心提供)，大肠杆菌O111-B4内毒素(LPS)(Sigma)，含MIP-2 cDNA质粒(美国Partricia A. Olson博士惠赠)，地高辛标记及检测试剂盒(宝灵曼公司)。
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1.2 大鼠内毒素性ALI模型的建立
健康Wistar大鼠50只，雌雄不拘，体重180～230 g，随机分为内毒素性ALI 1、3、6、12 h组和对照组。内毒素组静脉注射LPS 5 mg/kg，对照组注射等量的生理盐水。按设计的时相点放血活杀，留取血浆、肺组织，行支气管肺泡灌洗，收取支气管肺泡灌洗液(BALF)待测。
1.3 鼠源性MIP-2 cDNA探针的制备及标记
含MIP-2 DNA的质粒经电穿孔法[1]导入大肠杆菌HB101中，大量扩增，碱裂解法提取质粒DNA，用EcoR-Ⅰ酶切后，电泳洗脱法回收MIP-2 cDNA片段(1 200 bp)，见图1。地高辛随机引物法标记。
1.4 鼠肺组织总RNA提取
, http://www.100md.com
采用异硫氰酸胍-酚-氯仿/异戊醇一步法[2]。
1.5 斑点印迹杂交
纯化后的目的基因及提取的肺组织总RNA，经紫外分光光度计定量后，将稀释为不同浓度的目的基因及10μg总RNA直接点于经处理的硝酸纤维素膜上，经烤膜、预杂交、洗膜及显色，薄层色谱扫描仪(日本岛津CS-9000型)500μm波长处扫描，以标准品各点的波形面积为纵坐标，浓度为横坐标，在半对数纸上作图，根据各样品点扫描峰面积确定MIP-2 mRNA的相对含量。
1.6 鼠肺组织原位杂交
参照文献[3]方法。取ALI 1 h组及对照组动物肺组织，主要步骤包括固定、切片、消化、预杂交、杂交、漂洗、显色、脱水、封片等。
1.7 血浆及肺组织匀浆髓过氧化物酶(MPO)测定
, 百拇医药
参照罗武生[4]的方法进行。
1.8 数据处理
实验数据以x±s表示。有关数据经方差分析、χ2检验、相关及回归分析法处理。
图1 MIP-2 cDNA质粒酶切电泳鉴定
Fig 1 Identification of plasmid PBR322 containing MIP-2 cDNA by EcoR-Ⅰ digestion
A：PBR322 digested by EcoR-Ⅰ
B：λ/Hind Ⅲ+EcoR-Ⅰ marker
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2 结果
2.1 内毒素诱导ALI大鼠肺组织病理学变化
ALI大鼠肺组织可见肺间质充血、水肿、出血，肺泡壁增厚，小动脉周围水肿套形成，细支气管粘膜上皮脱落等。除大量PMN外，尚可见到较多巨噬细胞(Macrophage,M
)浸润。2.2 支气管肺泡灌洗液(BALF)白细胞计数、分类
ALI各组BALF白细胞总数、PMN分类、计数均显著高于对照组(P<0.01)。肺泡巨噬细胞(AM)因PMN所占比例显著增高而比例下降，但其绝对计数在ALI 3 h组及以后各组均显著升高(P<0.05～0.01)，见表1。
表 1 ALI各组及对照组BALF白细胞计数、分类
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Tab 1 The white blood cell count anddifferential count of BALF Group
n
Cell count (×105/ml)
WBC
PMN
AM
Control
8
3.05±0.64
0.026±0.002
0.874±0.023
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1 h
8
5.15±2.37**
0.334±0.054**
0.591±0.062*
3 h
8
8.23±2.53**
0.548±0.063**
0.434±0.065**
, 百拇医药
ALI
6 h
8
10.67±5.57**
0.542±0.072**
0.357±0.054**
12 h
8
9.13±2.68**
0.434±0.053**
0.425±0.058**
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*：P<0.05,* *：P<0.01 vs control
2.3 肺组织MIP-2 mRNA定量分析
内毒素性ALI各组MIP-2 mRNA表达强度均非常显著高于对照组(P<0.01)，于ALI 3 h组达高峰，对照组为(52.6±7.15)pg/10 μg总RNA，峰值为(267.14±34.48)pg/10 μg总RNA，见图2、3。
2.4 肺组织原位杂交 在内毒素性ALI 1 h组大鼠肺组织中，可见位于肺小动、静脉及细支气管周围，疏松结缔组织内的M
MIP-2表达阳性，表现为胞浆内呈蓝紫色颗粒样着色。对照组阴性，见图4、5。, 百拇医药
图 2 对照组及急性肺损伤各组MIP-2 mRNA表达相对含量
Fig 2 The content of expression of MIP-2 mRNA
图 3 MIP-2 mRNA表达的斑点杂交检测
Fig 3 The expression of MIP-2 mRNA by dot hybridization
图 4 内毒素性ALI 1 h组大鼠，可见位于小气管周围的巨噬细胞MIP-2 mRNA表达阳性 (原位杂交×210)
Fig 4 The positive signals of MIP-2 mRNA in macrophages surrounding the bronchioles of ALI 1 h group (ISH×210)
, 百拇医药
图 5 对照组大鼠肺组织MIP-2 mRNA表达阴性 (原位杂交×210)
Fig 5 Negative expression of MIP-2 mRNA in the lung of control group (ISH×210)
2.5 血浆及肺组织匀浆MPO活力
血浆MPO活力在ALI 3 h及以后各组均显著高于对照组[0.047±0.017)U/ml]，并在6h达峰[(0.228±0.201)U/ml](P<0.01)。肺组织匀浆MPO活力，ALI各组高于对照组[(1.321±0.699)U/g]，亦于6 h达峰值[(2.764±0.283)U/g](P<0.01)，见表2。
表 2 ALI各组及对照组血浆及肺组织匀浆MPO测定
Tab 2 The MPO activity in plasma and lung homogenate Group
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n
Plasma
Homogenate
Control
8
0.0468±0.0174
1.321±0.699
ALI 1 h
8
0.0498±0.0167
1.851±0.983*
ALI 3 h
, 百拇医药
8
0.1370±0.0340**
2.245±0.385**
ALI 6 h
8
0.2280±0.2010**
2.764±0.283**
ALI 12 h
8
0.1880±0.0186**
, 百拇医药 1.799±0.170**
*：P<0.05，* *：P<0.01 vs control
2.6 MIP-2 mRNA表达和MPO活力的相关性
血浆及肺组织匀浆MPO活力与MIP-2的表达的峰值水平呈正相关(r=0.729,r=0.885,P<0.05)。
3 讨论
已有报道，巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞等可分泌MIP-2，但这些研究多源于体外实验。本实验发现，在ALI 1 h组动物肺组织内，可见位于小气管及小血管周围疏松结缔组织内的M M
IP-2 mRNA表达阳性，表现为胞浆中许多紫蓝色的阳性颗粒；对照组阴性，提示在ALI早期，肺M是MIP-2主要分泌细胞[5]。, 百拇医药
MIP-2具有肝素结合位点，可与内皮细胞周围的肝素硫酸葡聚糖相互作用，并能上调PMN表面粘附分子CD11b/CD18的表达。当浓度为1～10 nmol/L时，还可引起PMN呼吸爆发[5]。本实验表明，ALI各组MIP-2 mRNA相对含量均显著高于对照组(P<0.01)，峰值在注射内毒素3 h组，6 h组则开始下降；而ALI组血浆及肺组织匀浆MPO活力亦显著升高，但于6 h方达高峰。MIP-2表达的峰值在前，MPO活力升高峰值在后，且MIP-2 mRNA表达与血浆及肺组织匀浆MPO活力呈正相关。文献报道，MPO是间接反映炎症部位PMN数目的良好指标。本实验结果表明，在内毒素性ALI时，肺巨噬细胞释放的MIP-2可能是引起PMN在肺内聚集并造成肺损伤的重要原因，因而在较早阶段参与了ALI的发病。
基金项目:国家自然科学基金资助项目,No.39670311
作者简介:金敬顺,35岁,主治医师,硕士,现在解放军254医院呼吸内科 天津,300142
, http://www.100md.com
参考文献
1 Dower W J, Miuer J F, Ragsdale C W, et al. High efficiency transformation of E. coli by high voltage eletroporation. Nucleic Acids Res,1988,16(13):6127
2 Chomozynske P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinum thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analyt Biochem,1987,162(1):156
3 蔡文琴，王伯
主编.实用免疫化学与核酸分子杂交技术.成都：四川科学技术出版社，1994.495～496, 百拇医药
4 罗武生，郭兆贵.用髓过氧化物酶法定量测定心肌组织中的中性粒细胞.中国药理学通报，1990，6(4)：246
5 Xing R, Jordana M, kirpalani H, et al. Cytokine expression by neutrophils and macrophages in vivo: Endotoxin induces TNF-α, MIP-2, IL-1 β and IL-6 but not RANTES or TGF1 mRNA expression in acute lung inflammation. Am J Respir Cell Mol Bio,1994，10(2)：148
6 Driscoll K E. Macrophage inflammatory proteins:biology and role in pulmonary inflammatory. Exp lung Res,1994,20(6):473
收稿：1998-06-23
修回：1998-12-09, 百拇医药