快速扩张额部皮瓣全鼻再造术
作者：王晋煌 司徒朴 熊明根 陈兵 梁刘萍
单位：第一军医大学珠江医院整形外科，广州，510282
关键词：皮瓣；扩张；鼻再造
第二军医大学学报980423 摘要 目的： 获取新生隐球菌总RNA。方法： 异硫氰酸胍一步法。结果： 成功地获得了高质量的[(1.23±0.03)μg/105细胞]新生隐球菌总RNA。结论： 将异硫氰酸胍一步法应用于新生隐球菌总RNA的抽提，适用于大样本或小样本量的新生隐球菌RNA的分离，可以满足各种分子生物学研究的需要。
中国图书资料分类法分类号 R379.5
Rapid extraction of RNA of Cryptococcus neoformans
, 百拇医药
Chen Jianghan，Liao Wanqing，Wen Hai，Wu Jianhua， Yao Zhirong, Li Zhigang (Department of Dermatology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200003)
Abstract Objective: To obtain high yields of RNA of good purity from Cryptococcus neoformans. Methods: A single-step method of RNA isolation from Cryptococcus neoformans by isoguanidine thiocyanate extraction. Results: High yields of RNA of good purity [(1.23±0.03) μg of RNA from 105 cells] were obtained successfully. Conclusion: The RNA extracted from Cryptococcus neoformans by this method is suitable for use in various molecular applications.
, 百拇医药
Key words Cryptococcus neoformans; ribonucleotides
新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)是一种危害人类健康的重要病原真菌。在目前的治疗条件下，死亡率高达30%～40%，并且发病率逐渐增高,常有10%的艾滋病患者继发新生隐球菌性脑膜炎。目前对其研究特别是分子生物学的研究越来越受到重视。从新生隐球菌中分离RNA的纯度和完整性至关重要。国外虽有人获得了新生隐球菌RNA,但方法较为繁琐，且未对所获得的RNA的质量进行分析，而国内尚未开展这方面的工作。我们利用异硫氰酸胍一步法成功地从新生隐球菌中分离获得了高质量的RNA，方法简便，现报告如下。
1 材料和方法
1.1 菌株和试剂 菌株由我院中国医学真菌保藏管理中心隐球菌专业实验室提供。编号CCCC0112为临床分离菌株。保存于沙堡固体培养基斜面上，液体培养基YEPD由1%酵母抽提物、2%蛋白胨、2%的葡萄糖组成。溶液D为4 mol/L异硫氰酸胍(Sigma公司)、25 mmol/L柠檬酸钠pH7.0, 0.5% Sarcosyl, 0.1 mol/L β-巯基乙醇组成，饱和酚贮存在冰箱中。
, 百拇医药
1.2 方法 保藏之菌株接种到固体沙堡培养基斜面上，活化3 d后移种一整环菌株于100 ml液体YEPD培养基中，30℃振荡培养(200 r/min )过夜，取1 ml菌液离心收集菌体(4 000 r/min, 5 min)，无菌生理盐水清洗后重新离心收集菌体(4 000 r/min, 5 min)，并以1 ml溶液D悬浮菌体，转移到电动匀浆器中，室温下匀浆3 min后转移到4 ml的Eppendorf管中，余按文献[1]方法抽提总RNA。
取10 μl RNA溶液与2 μl溴酚蓝混匀后，琼脂糖凝胶电泳检测RNA，同时取4 μl RNA样品，加水至1 ml混匀后，转入分光光度计的石英比色杯中，先用1 ml水校正零点，测260 nm和280 nm下光密度，检测RNA的纯度和浓度。重复10次后计算其平均数并与同样方法获得的小鼠肝细胞RNA均数进行t检验。
2 结 果
2.1 墨汁涂片 匀浆新生隐球菌菌体时，每隔1 min进行墨汁涂片检查和培养，在第3分钟时镜检和培养均未见菌体或其生长，重复试验时也未查见。
, 百拇医药
2.2 电泳检测 电泳检测RNA时，紫外光照射下可见清晰的3条泳带，以啤酒酵母和小鼠肝细胞RNA作为对照，显示其大小分别为25 S，18 S和5 S(图1)。
图 1 RNA凝胶电泳图
Fig 1 RNA of 3 bands by electrophoresis
1: RNA of Saccharomyces cerevisiae; 2: RNA of Cryptococcus
neoformans; 3: RNA of mouse liver cells
2.3 分光光度计检测 分光光度计检测结果表明，新生隐球菌D260/D280为1.85±0.05，与对照组(小鼠肝细胞RNA)的值(1.86±0.04)比较无显著差异。RNA的浓度和纯度显示，其中未见明显蛋白质、DNA和酚的污染，且具有较高的浓度。
, 百拇医药
3 讨 论
RNA特别是mRNA的纯度和完整性是进行新生隐球菌分子生物学研究的前提条件之一，本实验所获得的RNA D260/D280比值为1.85±0.05，表明具有较高的纯度，而RNA的量为(1.23±0.03) μg/105个细胞，接近于哺乳动物细胞的含量[2]，电泳条带也显示所得RNA基本无降解。
与其他微生物比较，如细菌、病毒甚至于同属真菌界的白色念珠菌相比，获取新生隐球菌RNA并对其进行研究则显得远远落后。国外虽有人获得了新生隐球菌的RNA，但尚未对影响RNA产量和纯度的有关因素进行深入细致的研究,不利于更好地开展相关的研究。我们在国内率先应用异硫氰酸胍一步法获得了高质量的新生隐球菌RNA，测得新生隐球菌的总RNA含量为(1.23±0.03) μg/105个细胞，接近于哺乳动物细胞的含量。
, 百拇医药
实验中发现所获得的新生隐球菌RNA的含量和纯度及其完整性主要取决于以下几个方面的因素：(1)不同生长期和生长条件下的新生隐球菌。本实验是指数生长期新生隐球菌的总RNA，一般而言，250 ml烧瓶中在100 ml培养基内接种1个菌环的菌量，以YEPD为液体培养基30℃孵育过夜，每1 ml液体中菌数可达108个。我们的实验，经孵育过夜后，每1 ml的菌量为8.6×107个。当然，为了获得足够的目的mRNA的产量，还需要改变相应的生长条件。(2)新生隐球菌RNA的全部释放,为此彻底匀浆新生隐球菌是重要的。实验表明，电动匀浆后3 min，均能彻底破坏新生隐球菌的结构，使得其RNA获得满意的释放。(3)实验过程中避免RNA的降解和丢失。其中最主要的是避免外源性RNase的污染和抑制内源性RNase的活力。
值得一提的是该方法抽提新生隐球菌RNA只需不足3 h的时间，并且操作步骤大大减少，操作也很方便。更为重要的是该方法可以微量或大量抽提RNA，这是其他RNA的分离方法所无法比拟的。因此，该方法抽提的RNA可以满足新生隐球菌各种分子生物学研究的需要[3]。
, 百拇医药
参 考 文 献
1 Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 1987, 162(1):156
2 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning. A laboratory manual.2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989:7.3～7.23
3 Williamson PR. Biochemical and molecular characterization of the diphenol oxidase of Cryptococcus neoformans: identification as a laccase. J Bacteriol, 1994,176(3): 656
(1997-10-16收稿, 1998-03-17修回), 百拇医药
单位：第一军医大学珠江医院整形外科，广州，510282
关键词：皮瓣；扩张；鼻再造
第二军医大学学报980423 摘要 目的： 获取新生隐球菌总RNA。方法： 异硫氰酸胍一步法。结果： 成功地获得了高质量的[(1.23±0.03)μg/105细胞]新生隐球菌总RNA。结论： 将异硫氰酸胍一步法应用于新生隐球菌总RNA的抽提，适用于大样本或小样本量的新生隐球菌RNA的分离，可以满足各种分子生物学研究的需要。
中国图书资料分类法分类号 R379.5
Rapid extraction of RNA of Cryptococcus neoformans
, 百拇医药
Chen Jianghan，Liao Wanqing，Wen Hai，Wu Jianhua， Yao Zhirong, Li Zhigang (Department of Dermatology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200003)
Abstract Objective: To obtain high yields of RNA of good purity from Cryptococcus neoformans. Methods: A single-step method of RNA isolation from Cryptococcus neoformans by isoguanidine thiocyanate extraction. Results: High yields of RNA of good purity [(1.23±0.03) μg of RNA from 105 cells] were obtained successfully. Conclusion: The RNA extracted from Cryptococcus neoformans by this method is suitable for use in various molecular applications.
, 百拇医药
Key words Cryptococcus neoformans; ribonucleotides
新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)是一种危害人类健康的重要病原真菌。在目前的治疗条件下，死亡率高达30%～40%，并且发病率逐渐增高,常有10%的艾滋病患者继发新生隐球菌性脑膜炎。目前对其研究特别是分子生物学的研究越来越受到重视。从新生隐球菌中分离RNA的纯度和完整性至关重要。国外虽有人获得了新生隐球菌RNA,但方法较为繁琐，且未对所获得的RNA的质量进行分析，而国内尚未开展这方面的工作。我们利用异硫氰酸胍一步法成功地从新生隐球菌中分离获得了高质量的RNA，方法简便，现报告如下。
1 材料和方法
1.1 菌株和试剂 菌株由我院中国医学真菌保藏管理中心隐球菌专业实验室提供。编号CCCC0112为临床分离菌株。保存于沙堡固体培养基斜面上，液体培养基YEPD由1%酵母抽提物、2%蛋白胨、2%的葡萄糖组成。溶液D为4 mol/L异硫氰酸胍(Sigma公司)、25 mmol/L柠檬酸钠pH7.0, 0.5% Sarcosyl, 0.1 mol/L β-巯基乙醇组成，饱和酚贮存在冰箱中。
, 百拇医药
1.2 方法 保藏之菌株接种到固体沙堡培养基斜面上，活化3 d后移种一整环菌株于100 ml液体YEPD培养基中，30℃振荡培养(200 r/min )过夜，取1 ml菌液离心收集菌体(4 000 r/min, 5 min)，无菌生理盐水清洗后重新离心收集菌体(4 000 r/min, 5 min)，并以1 ml溶液D悬浮菌体，转移到电动匀浆器中，室温下匀浆3 min后转移到4 ml的Eppendorf管中，余按文献[1]方法抽提总RNA。
取10 μl RNA溶液与2 μl溴酚蓝混匀后，琼脂糖凝胶电泳检测RNA，同时取4 μl RNA样品，加水至1 ml混匀后，转入分光光度计的石英比色杯中，先用1 ml水校正零点，测260 nm和280 nm下光密度，检测RNA的纯度和浓度。重复10次后计算其平均数并与同样方法获得的小鼠肝细胞RNA均数进行t检验。
2 结 果
2.1 墨汁涂片 匀浆新生隐球菌菌体时，每隔1 min进行墨汁涂片检查和培养，在第3分钟时镜检和培养均未见菌体或其生长，重复试验时也未查见。
, 百拇医药
2.2 电泳检测 电泳检测RNA时，紫外光照射下可见清晰的3条泳带，以啤酒酵母和小鼠肝细胞RNA作为对照，显示其大小分别为25 S，18 S和5 S(图1)。
图 1 RNA凝胶电泳图
Fig 1 RNA of 3 bands by electrophoresis
1: RNA of Saccharomyces cerevisiae; 2: RNA of Cryptococcus
neoformans; 3: RNA of mouse liver cells
2.3 分光光度计检测 分光光度计检测结果表明，新生隐球菌D260/D280为1.85±0.05，与对照组(小鼠肝细胞RNA)的值(1.86±0.04)比较无显著差异。RNA的浓度和纯度显示，其中未见明显蛋白质、DNA和酚的污染，且具有较高的浓度。
, 百拇医药
3 讨 论
RNA特别是mRNA的纯度和完整性是进行新生隐球菌分子生物学研究的前提条件之一，本实验所获得的RNA D260/D280比值为1.85±0.05，表明具有较高的纯度，而RNA的量为(1.23±0.03) μg/105个细胞，接近于哺乳动物细胞的含量[2]，电泳条带也显示所得RNA基本无降解。
与其他微生物比较，如细菌、病毒甚至于同属真菌界的白色念珠菌相比，获取新生隐球菌RNA并对其进行研究则显得远远落后。国外虽有人获得了新生隐球菌的RNA，但尚未对影响RNA产量和纯度的有关因素进行深入细致的研究,不利于更好地开展相关的研究。我们在国内率先应用异硫氰酸胍一步法获得了高质量的新生隐球菌RNA，测得新生隐球菌的总RNA含量为(1.23±0.03) μg/105个细胞，接近于哺乳动物细胞的含量。
, 百拇医药
实验中发现所获得的新生隐球菌RNA的含量和纯度及其完整性主要取决于以下几个方面的因素：(1)不同生长期和生长条件下的新生隐球菌。本实验是指数生长期新生隐球菌的总RNA，一般而言，250 ml烧瓶中在100 ml培养基内接种1个菌环的菌量，以YEPD为液体培养基30℃孵育过夜，每1 ml液体中菌数可达108个。我们的实验，经孵育过夜后，每1 ml的菌量为8.6×107个。当然，为了获得足够的目的mRNA的产量，还需要改变相应的生长条件。(2)新生隐球菌RNA的全部释放,为此彻底匀浆新生隐球菌是重要的。实验表明，电动匀浆后3 min，均能彻底破坏新生隐球菌的结构，使得其RNA获得满意的释放。(3)实验过程中避免RNA的降解和丢失。其中最主要的是避免外源性RNase的污染和抑制内源性RNase的活力。
值得一提的是该方法抽提新生隐球菌RNA只需不足3 h的时间，并且操作步骤大大减少，操作也很方便。更为重要的是该方法可以微量或大量抽提RNA，这是其他RNA的分离方法所无法比拟的。因此，该方法抽提的RNA可以满足新生隐球菌各种分子生物学研究的需要[3]。
, 百拇医药
参 考 文 献
1 Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 1987, 162(1):156
2 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning. A laboratory manual.2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989:7.3～7.23
3 Williamson PR. Biochemical and molecular characterization of the diphenol oxidase of Cryptococcus neoformans: identification as a laccase. J Bacteriol, 1994,176(3): 656
(1997-10-16收稿, 1998-03-17修回), 百拇医药