应用多中心合成技术合成人乙酰胆碱酯酶的抗原多肽*
作者：张兴梅 刘刚 杨光彩
单位：张兴梅 杨光彩 (第一军医大学生物化学教研室，广州，510515)；刘刚 (军事医学科学院毒物药物研究所，北京，100850)
关键词：多中心合成技术；多肽；人乙酰胆碱酯酶
第一军医大学学报990427 摘要：目的和方法 利用多中心同步多肽合成技术合成人乙酰胆碱酯酶的574个抗原十肽，并且生物素化。结果 电喷雾质谱支持合成肽的准确性。结论 多中心合成技术可以快速、同步合成高纯度及序列正确的多肽，是研究蛋白质和肽的一种重要工具。
中图分类号：Q556;O621
Synthesis of antigenic peptides of human acetylcholinesterase using multipin method
, 百拇医药
Zhang Xingmei，Yang Guangcai
(Department of Biochemistry，First Military Medical University，Guangzhou，510515)
Liu Gang
(Institute of Pharmacology and Toxicology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing，100850)
Abstract：Objective and Method Five hundred and seventy-four antigenic decapeptides were synthesized simultaneously by the multipin method and biotinylated.Results The synthetic decapeptides had been identified for the correctness by ionspray mass spectrometry.Conclusion The multipin method is a powerful technique for protein and peptide research for it can quickly synthesize peptides with high purity and correct sequences simultaneously.
, 百拇医药
Key words：multipin method;polypeptide;human acetylcholinesterase
本实验利用Geysen HM[ 1] 等的多中心同步多肽合成技术按照人乙酰胆碱酯酶(AChE，EC 3.1.1.7)的583个氨基酸全序列[ 2] 由第n至第n+9位氨基酸(n为正整数)顺序合成574个十肽片段，并且生物素化。合成的抗原多肽可用于人AChE抗原决定簇的筛选。
1 材料和方法
1.1 试剂和仪器 多中心多肽合成仪，高密度聚乙烯Macrocrowns(多肽合成反应载体)及PinAID(中心协助系统)，均购自Chiron Mimotopes公司。电喷雾质谱仪，英国VG公司产品。HOBt，DIC，BOP，NMM及所有Na-Fmoc保护氨基酸，均购自Chiron Mimotopes公司。生物素(d-Biotin)，美国Sigma公司产品。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 人AChE的574个抗原十肽的合成 采用Fmoc化学合成法[3] 。具体步骤如下：(1) 制作工作计划：利用多中心多肽合成技术中Gnet软件，将全部人脑AChE的氨基酸序列[ 2] 输入计算机，在PepMaker的执行程序下得到全部574个十肽的合成计划。(2) 按照工作计划，在正确的位置固载Macrocrowns。(3) 以20%哌啶的二甲基甲酰胺(DMF)溶液在室温下脱Fmoc保护基20 min。(4) 以干燥DMF洗涤所有Pin2 min后，再以新鲜的甲醇洗涤3次，每次2 min。(5) 空气干燥30 min。(6) 按工作计划称取氨基酸，缩合剂及添加剂(DIC和HOBt)，并配好氨基酸活化酯溶液。(7) 启动PinAID，按显示正确位置加入深孔的Beckman反应容器中，最后检查所有的反应孔中全部加入活化的氨基酸。反应体积为300 ml。(8) 将Pin放入反应容器中，室温反应2 h。(9) 将Pin从反应容器中去除，用甲醇洗涤5 min，甩去甲醇，晾干2 min，再在干燥的DMF中洗5 min。(10) 观察是否有蓝色Pin显示。如有，则按照(6)～(10)将此Pin重新缩合，直至蓝色消失。(11) 如没有，则重复(3)～(10)，一直到全部氨基酸缩合完毕。
, http://www.100md.com
1.2.2 肽的生物素化 在已合成的每个十肽的末端按照上述多肽合成方法合成一个SGSG(seryl-glycyl-seryl-glycyl)标准序列，这几个氨基酸是依次连接到原肽链上的。生物素化溶液(40 mmol/Ld-biotin，40 mmol/LHOBt，60 mmol/LNMM，40 mmol/LBOP)用重蒸的DMF配制，参见文献[ 4] 进行肽的生物素化。
1.2.3 合成肽的侧链脱保护及提取合成肽 如果合成肽序列中含有甲硫氨酸或半胱氨酸时，进行侧链脱保护可用下述混合试剂：三氟乙酸(TFA)：乙二硫醇(EDT)：苯甲醚：苯甲硫醚：水＝33: 1: 2: 2: 2(体积比)；否则，可用下列混合试剂：三氟乙酸：乙二硫醇：苯甲醚＝38: 1: 1(体积比)。参见文献[ 3] 进行合成肽的侧链脱保护及其提取。
1.2.4 合成肽的鉴定 应用电喷雾质谱仪检测其相对分子质量(MW)。
, 百拇医药 2 结果
利用多中心合成技术完成人AChE的574个抗原十肽的合成，并且生物素化。相邻十肽之间的氨基酸组成只相差一个氨基酸残基。每种肽的产量约为5～10 mg。我们对其中19个生物素化十肽的质谱测定相对分子质量结果见表1，支持合成肽的正确性(每种肽以第一个氨基酸在人AChE一级结构全序列中的位置来命名)。
表1 生物素化十肽的合成情况
Tab.1 Synthetic biotinylated SGSG-decapeptides No.
Sequence
MW*
MW
(found)
, 百拇医药
(calculated)
111
Biotin-SGSGPTPVLVWIYG-OH
1658.6
1658.84
121
Biotin-SGSGGGFYSGASSL-OH
1458.6
1459.46
143
Biotin-SGSGRTVLVSMNYR-OH
, 百拇医药
1752.0
1752.94
172
Biotin-SGSGGLLDQRLALQ-OH
1640.1
1640.78
173
Biotin-SGSGLLDQRLALQW-OH
1769.3
1769.93
234
Biotin-SGSGPWATVGMGE-OH
, 百拇医药
1549.2
1549.34
244
Biotin-SGSGARRRATQLAH-OH
1692.5
1693.81
245
Biotin-SGSGRRRATQLAHL-OH
1735.3
1735.89
246
Biotin-SGSGRRATQLAHLV-OH
, http://www.100md.com
1678.3
1678.84
293
Biotin-SGSGSVFRFSFVPV-OH
1698.0
1698.87
294
Biotin-SGSGVFRFSFVPVV-OH
1710.1
1710.93
301
Biotin-SGSGPVVDGDFLSD-OH
, http://www.100md.com
1576.9
1577.09
418
Biotin-SGSGLAAQGARVYA-OH
1532.8
1533.63
421
Biotin-SGSGQGARVYAYVF-OH
1687.1
1687.81
423
Biotin-SGSGARVYAYVFEH-OH
, 百拇医药
1768.2
1768.88
424
Biotin-SGSGRVYAYVFEHR-OH
1853.3
1853.99
430
Biotin-SGSGFEHRASTLSW-OH
1747.2
1748.80
555
Biotin-SGSGAEFHRWSSYM-OH
, http://www.100md.com
1829.0
1828.89
558
Biotin-SGSGHRWSSYMVHW-OH
1903.4
1903.03
*MW found were determined by ionspray mass spectrometry of VG spectrometer (UK).Samples were dissolved in mixture of 0.1% TFA/water and acetonitrile.The No.is dominated by the position of the first amino acid of the decapeptide.
, 百拇医药
3 讨论
Geysen 等[ 1] 建立的多中心多肽合成技术具有操作简单、费用低及适用于工业化大规模生产等优点。我们应用多中心多肽合成技术在20 d内完成人AChE的574个生物素化肽的合成和提取。实验过程中不需要特殊的设备和空间，也不使用氟化氢等有毒物质。合成的肽可与人AChE的抗体进行酶联免疫吸附实验(ELISA)，从而筛选出人AChE的抗原决定簇的位置和组成[5] 。肽的生物素化的目的是在进行ELISA实验中，可以与包被在酶联板上的链亲和素结合，提高肽的包被效率及酶联反应的灵敏度。
*总后95重点招标课题(96Z017)
作者简介：张兴梅,女,1971年出生,1997年毕业于军事医学科学院,硕士,助教,电话85148356
参考文献
, 百拇医药
1 Geysen HM，Meloen RH，Barteling SJ.Use of peptide synthesis to probe viral antigen for epitopes to a resolution of a single amino acid.PNAS USA，1984，81(1): 3998
2 Soreq H，Ben-Aziz R，Prody CA et al.Molecular cloning and construction of the coding region for human acetylcholinesterase reveals a G+C-rich attenuating structure.Proc Natl Acad Sci USA，1990，87(6): 9688
3 Liu G，Wang JX，Guo L et al.Simultaneous multiple peptide synthesis using the multipin method.Acta Pharmaceutica Sinica，1996，31(8): 591
4 Rodda SJ，Maeji NT，Tribbick G.Epitope mapping using multipin peptide synthesis.Methods Mol Biol，1996，66(2): 137
5 Geysen HM，Rodda SJ，Mason TJ et al.Strategies for epitope analysis using peptide synthesis.J Immunol Methods，1987，102(3): 259
(收稿日期：1997-12-07), 百拇医药
单位：张兴梅 杨光彩 (第一军医大学生物化学教研室，广州，510515)；刘刚 (军事医学科学院毒物药物研究所，北京，100850)
关键词：多中心合成技术；多肽；人乙酰胆碱酯酶
第一军医大学学报990427 摘要：目的和方法 利用多中心同步多肽合成技术合成人乙酰胆碱酯酶的574个抗原十肽，并且生物素化。结果 电喷雾质谱支持合成肽的准确性。结论 多中心合成技术可以快速、同步合成高纯度及序列正确的多肽，是研究蛋白质和肽的一种重要工具。
中图分类号：Q556;O621
Synthesis of antigenic peptides of human acetylcholinesterase using multipin method
, 百拇医药
Zhang Xingmei，Yang Guangcai
(Department of Biochemistry，First Military Medical University，Guangzhou，510515)
Liu Gang
(Institute of Pharmacology and Toxicology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing，100850)
Abstract：Objective and Method Five hundred and seventy-four antigenic decapeptides were synthesized simultaneously by the multipin method and biotinylated.Results The synthetic decapeptides had been identified for the correctness by ionspray mass spectrometry.Conclusion The multipin method is a powerful technique for protein and peptide research for it can quickly synthesize peptides with high purity and correct sequences simultaneously.
, 百拇医药
Key words：multipin method;polypeptide;human acetylcholinesterase
本实验利用Geysen HM[ 1] 等的多中心同步多肽合成技术按照人乙酰胆碱酯酶(AChE，EC 3.1.1.7)的583个氨基酸全序列[ 2] 由第n至第n+9位氨基酸(n为正整数)顺序合成574个十肽片段，并且生物素化。合成的抗原多肽可用于人AChE抗原决定簇的筛选。
1 材料和方法
1.1 试剂和仪器 多中心多肽合成仪，高密度聚乙烯Macrocrowns(多肽合成反应载体)及PinAID(中心协助系统)，均购自Chiron Mimotopes公司。电喷雾质谱仪，英国VG公司产品。HOBt，DIC，BOP，NMM及所有Na-Fmoc保护氨基酸，均购自Chiron Mimotopes公司。生物素(d-Biotin)，美国Sigma公司产品。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 人AChE的574个抗原十肽的合成 采用Fmoc化学合成法[3] 。具体步骤如下：(1) 制作工作计划：利用多中心多肽合成技术中Gnet软件，将全部人脑AChE的氨基酸序列[ 2] 输入计算机，在PepMaker的执行程序下得到全部574个十肽的合成计划。(2) 按照工作计划，在正确的位置固载Macrocrowns。(3) 以20%哌啶的二甲基甲酰胺(DMF)溶液在室温下脱Fmoc保护基20 min。(4) 以干燥DMF洗涤所有Pin2 min后，再以新鲜的甲醇洗涤3次，每次2 min。(5) 空气干燥30 min。(6) 按工作计划称取氨基酸，缩合剂及添加剂(DIC和HOBt)，并配好氨基酸活化酯溶液。(7) 启动PinAID，按显示正确位置加入深孔的Beckman反应容器中，最后检查所有的反应孔中全部加入活化的氨基酸。反应体积为300 ml。(8) 将Pin放入反应容器中，室温反应2 h。(9) 将Pin从反应容器中去除，用甲醇洗涤5 min，甩去甲醇，晾干2 min，再在干燥的DMF中洗5 min。(10) 观察是否有蓝色Pin显示。如有，则按照(6)～(10)将此Pin重新缩合，直至蓝色消失。(11) 如没有，则重复(3)～(10)，一直到全部氨基酸缩合完毕。
, http://www.100md.com
1.2.2 肽的生物素化 在已合成的每个十肽的末端按照上述多肽合成方法合成一个SGSG(seryl-glycyl-seryl-glycyl)标准序列，这几个氨基酸是依次连接到原肽链上的。生物素化溶液(40 mmol/Ld-biotin，40 mmol/LHOBt，60 mmol/LNMM，40 mmol/LBOP)用重蒸的DMF配制，参见文献[ 4] 进行肽的生物素化。
1.2.3 合成肽的侧链脱保护及提取合成肽 如果合成肽序列中含有甲硫氨酸或半胱氨酸时，进行侧链脱保护可用下述混合试剂：三氟乙酸(TFA)：乙二硫醇(EDT)：苯甲醚：苯甲硫醚：水＝33: 1: 2: 2: 2(体积比)；否则，可用下列混合试剂：三氟乙酸：乙二硫醇：苯甲醚＝38: 1: 1(体积比)。参见文献[ 3] 进行合成肽的侧链脱保护及其提取。
1.2.4 合成肽的鉴定 应用电喷雾质谱仪检测其相对分子质量(MW)。
, 百拇医药 2 结果
利用多中心合成技术完成人AChE的574个抗原十肽的合成，并且生物素化。相邻十肽之间的氨基酸组成只相差一个氨基酸残基。每种肽的产量约为5～10 mg。我们对其中19个生物素化十肽的质谱测定相对分子质量结果见表1，支持合成肽的正确性(每种肽以第一个氨基酸在人AChE一级结构全序列中的位置来命名)。
表1 生物素化十肽的合成情况
Tab.1 Synthetic biotinylated SGSG-decapeptides No.
Sequence
MW*
MW
(found)
, 百拇医药
(calculated)
111
Biotin-SGSGPTPVLVWIYG-OH
1658.6
1658.84
121
Biotin-SGSGGGFYSGASSL-OH
1458.6
1459.46
143
Biotin-SGSGRTVLVSMNYR-OH
, 百拇医药
1752.0
1752.94
172
Biotin-SGSGGLLDQRLALQ-OH
1640.1
1640.78
173
Biotin-SGSGLLDQRLALQW-OH
1769.3
1769.93
234
Biotin-SGSGPWATVGMGE-OH
, 百拇医药
1549.2
1549.34
244
Biotin-SGSGARRRATQLAH-OH
1692.5
1693.81
245
Biotin-SGSGRRRATQLAHL-OH
1735.3
1735.89
246
Biotin-SGSGRRATQLAHLV-OH
, http://www.100md.com
1678.3
1678.84
293
Biotin-SGSGSVFRFSFVPV-OH
1698.0
1698.87
294
Biotin-SGSGVFRFSFVPVV-OH
1710.1
1710.93
301
Biotin-SGSGPVVDGDFLSD-OH
, http://www.100md.com
1576.9
1577.09
418
Biotin-SGSGLAAQGARVYA-OH
1532.8
1533.63
421
Biotin-SGSGQGARVYAYVF-OH
1687.1
1687.81
423
Biotin-SGSGARVYAYVFEH-OH
, 百拇医药
1768.2
1768.88
424
Biotin-SGSGRVYAYVFEHR-OH
1853.3
1853.99
430
Biotin-SGSGFEHRASTLSW-OH
1747.2
1748.80
555
Biotin-SGSGAEFHRWSSYM-OH
, http://www.100md.com
1829.0
1828.89
558
Biotin-SGSGHRWSSYMVHW-OH
1903.4
1903.03
*MW found were determined by ionspray mass spectrometry of VG spectrometer (UK).Samples were dissolved in mixture of 0.1% TFA/water and acetonitrile.The No.is dominated by the position of the first amino acid of the decapeptide.
, 百拇医药
3 讨论
Geysen 等[ 1] 建立的多中心多肽合成技术具有操作简单、费用低及适用于工业化大规模生产等优点。我们应用多中心多肽合成技术在20 d内完成人AChE的574个生物素化肽的合成和提取。实验过程中不需要特殊的设备和空间，也不使用氟化氢等有毒物质。合成的肽可与人AChE的抗体进行酶联免疫吸附实验(ELISA)，从而筛选出人AChE的抗原决定簇的位置和组成[5] 。肽的生物素化的目的是在进行ELISA实验中，可以与包被在酶联板上的链亲和素结合，提高肽的包被效率及酶联反应的灵敏度。
*总后95重点招标课题(96Z017)
作者简介：张兴梅,女,1971年出生,1997年毕业于军事医学科学院,硕士,助教,电话85148356
参考文献
, 百拇医药
1 Geysen HM，Meloen RH，Barteling SJ.Use of peptide synthesis to probe viral antigen for epitopes to a resolution of a single amino acid.PNAS USA，1984，81(1): 3998
2 Soreq H，Ben-Aziz R，Prody CA et al.Molecular cloning and construction of the coding region for human acetylcholinesterase reveals a G+C-rich attenuating structure.Proc Natl Acad Sci USA，1990，87(6): 9688
3 Liu G，Wang JX，Guo L et al.Simultaneous multiple peptide synthesis using the multipin method.Acta Pharmaceutica Sinica，1996，31(8): 591
4 Rodda SJ，Maeji NT，Tribbick G.Epitope mapping using multipin peptide synthesis.Methods Mol Biol，1996，66(2): 137
5 Geysen HM，Rodda SJ，Mason TJ et al.Strategies for epitope analysis using peptide synthesis.J Immunol Methods，1987，102(3): 259
(收稿日期：1997-12-07), 百拇医药