微板核酸杂交-ELISA方法对肝炎病人血清中HBV DNA的定量检测与分析
作者：王虹 王省良 万成松 彭华国 张文炳
单位：王虹 王省良 彭华国 (第一军医大学生物医学诊断研究中心，广州，510515)；成松 张文炳 (第一军医大学微生物学教研室，广州，510515)
关键词：微板核酸杂交；ELISA；HBV；DNA定量
微板核酸杂交 摘要：目的 采用微板核酸杂交-ELISA技术测定肝炎病人血清中HBV DNA含量。方法 用PCR法将病人血清标本扩增后，与两条特异性探针夹心杂交，然后通过酶联显色对69例不同临床表现的肝炎患者血清中HBV DNA进行定量检测。结果 20例急性重型肝炎血清中的DNA含量超过2μg/L，88.24%的急性轻型肝炎患者和54.55%轻度慢性肝炎患者血清中的HBV DNA含量少于2μg/L，66.67%中度慢性肝炎患者血清HBV DNA含量在2～1000 μg/L的范围，75%重度慢性肝炎和45%急性重型肝炎血清中的HBV DNA含量超过1000μg/L。结论 微板核酸杂交-ELISA检测方法能准确、快速进行核酸定量测定，特异性强，灵敏度高，稳定可靠，易自动化，对于研究病毒感染量与临床病程的关系具有较大的现实意义。
, 百拇医药
中图分类号：R446.6
Quantification and analysis of HBV DNA in hepatitis patient serum using sandwich hybridization-ELISA assay on microplate
Wang Hong,Wang Shengliang，Peng Huaguo
(Institute of Molecular Biology Diagnosis，First Military Medical University Guangzhou，510515)
Wan Chengsong Zhang Wenbing
(Department of Microbiology，First Military Medical University，Guangzhou，510515)
, 百拇医药
Abstract：Objective To quantify HBV DNA in hepatitis patient serum using sandwich hybridization on microplate. Methods HBV DNA extracted from 69 hepatitis patients serum by PCR was hybridized to two specific probes，one of which one was capture probe and the other was detector probe labeled with 5’-biotin to quantitatively assay HBV DNA in hepatitis patient serum. Results Serum HBV DNA level was more than 2 μg /L serum in 20(28.98%) heavy acute hepatitis patients，and ess than 2 μg/L in 88.24% light acute hepatitis patients and in 54.55% light chronic hepatitis patients and between 2 μg/L and 1 000 μg/L in 66.67% middle chronic hepatitis patients and in 75% heavy chronic hepatitis patients. Conclusions Sandwich hybridization-ELISA on microplate is a more sensitive and specific clinic method for detecting quantitatively HBV DNA in hepatitis patient serum.
, 百拇医药
Key words：sandwich hybridization on microplate; ELISA; HBV DNA quantification
微板核酸杂交-ELISA定量检测技术将基因扩增、核酸杂交和酶联显色当今3种诊断技术融为一体，具有特异性强、灵敏性高、操作简单、易自动化等特点，在探讨乙型肝炎发病机理、动态监测病情进展和评价药物疗效等方面具有广泛的应用价值。本文介绍采用微板核酸杂交-ELISA技术对69例肝炎患者血清HBV DNA的定量测定与分析。
1 材料与方法
1.1 质粒与标本 质粒pHBV-C由本中心构建；69例乙型肝炎患者血清采自佛山市第一人民医院。
1.2 试剂和仪器 HBV微板核酸杂交-核酸定量试剂盒由本中心研制。PCR仪为美国伯乐公司产品，Taq 酶为上海复华公司产品，M750-B型多功能紫外可见光分光光度计为江苏泰州无线电仪器厂产品，550型酶标仪为BIO-RAD公司产品，生物素、TMB、Taq酶、辣根过氧化氢酶(HRP)购自宝灵曼公司、华粤公司。
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1.3 杂交液主要配方 20×SSC、硫酸葡聚糖、去离子甲酰胺、PEG、SDS等；洗液：1×SSC；封闭剂：1%Ficoll 400、1%PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、1%BSA、HS-DNA、脱脂奶粉、甘氨酸。以上溶液均由本中心自行配制。
1.4 引物与探针 采用Primer软件设计引物，选取HBV DNA C区的保守序列作引物与探针[1]，由上海生工公司合成。其序列分别为：引物W1 TGGACGTCGCATGGAGACCACCGTGAA(1608-1634)，引物W2 GAAAGCTTCTGCGACGCCG-TGATTGAGA (2429-2402)，捕捉探针GATCCAGCATCCGCGGATCTAGTAGTCAATTATGTTAACACCAACATGGGCCTAAAGATCAGGCAAC(2132-2198)，信号探针 GGAATTAATGAC-TCTAGCTACCTGGGTGGGTAATAATTTGGAAG(1785-1845)。
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1.5 标本处理 取上清液10μl加入990μl双蒸水于1.5 ml离心管内混匀。取自制处理液50μl于0.5ml离心管内，加待测血清50μl，100℃煮沸15 min，12000r/min离心5 min。
1.6 标准品的构建和定量 把HBV DNA C区基因克隆到质粒中，用大肠杆菌增殖，提取质粒DNA，用微量分光光度计测定质粒DNA浓度(100 mg/L)。采用极限稀释法[2]，将核酸模板1:10倍比稀释，作32次循环的PCR，其阳性最大稀释度为1:105 (相当于1 ng/L)。选择有一定差异的5个浓度：16、8、4、2、0.25 ng/L为横坐标，A260nm值为纵坐标，作直线回归方程Y=aX+b，绘制标准曲线。
1.7 基因扩增 取标本上清液原液及其1:100倍比稀释液各4μl、5种浓度HBV DNA标准品各4μl和阴性对照4 μl于PCR反应管内，弹匀，上机，预变性94℃2min，循环条件：94℃50s、55℃50s、72℃50 s，共循环32次，最后72℃延伸3 min。
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1.8 探针包被与封闭 在37 ℃下，用碳酸盐缓冲液(pH 9.6)等将包被探针在微板孔上包被14h。用封闭剂封闭微板孔非特异性结合位点。
1.9 杂交 取扩增产物在94℃下变性10 min，迅速冰浴10 min。取已变性产物20 μl，杂交液90μl、显色探针10 μl(200 nmol)于反应孔内，轻轻摇动混匀，50℃杂交2 h，甩净液体。在每孔中加入洗液200 μl，置室温3～5 min，甩净，再重复洗二次。然后加入酶抗体100μl，37℃30 min后，甩净，加入洗液200 μl，置室温3～5 min，再重复洗两次。每孔加入底物TMB一滴，置室温8 min后加入2%硫酸溶液两滴终止反应。
1.10 结果判断 肉眼观察显黄色为阳性(+)，不显色为阴性(-)。选取每个阳性血清标本最大稀释度在酶标仪450nm处读数，并根据标准品标准曲线计算阳性标本的HBV DNA浓度(ng/L血清)。
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2 结果
2.1 HBV DNA标准品极限稀释的A260nm值结果和标准曲线 将HBV DNA标准品作极限稀释，核酸杂交显色的最大阳性稀释度为1:105。选线形关系相对好的范围(相当于1～100 ng/L)作标准曲线，其相关系数r可达到0.994。结果如下：
图1 HBV DNA标准品极限稀释的A260nm值结果
Fig.1 Relation between A260 and different Concentration of HBV DNA
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.1:101，2.1:102，3.1:103，4.1:104，5.1:105，6.1:106，7.negative control，8.blank control
2.2 HBV DNA含量与肝炎临床病程的关系 我们对69例不同临床表现的肝炎患者血清中的HBV DNA含量进行了测定，其中急性肝炎37例，慢性肝炎32例。结果如下：17例急性轻型肝炎患者中，15例患者血清中的HBV DNA含量小于2μg/L，2例介于2～1000μg/L之间；20例急性重型肝炎患者中，11例患者血清中的DNA含量介于2～1000 μg/L之间，9例超过1000μg/L。11例轻度慢性肝炎患者中，6例患者血清中的DNA含量小于2 μg/L，5例介于2～1000μg/L之间；9例中度慢性肝炎患者中，6例介于2～1000μg/L之间，3例超过1000μg/L；12例重度慢性肝炎患者中，3例介于2～1000μg/L之间，9例超过1000μg/L。
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3 讨论
HBV呈世界范围流行，我国尤甚，其发病率高，治疗难度大，目前尚没有更好的方法能全面评价病毒感染量与临床病情的关系。血清中HBV DNA是病毒复制活动最直接和最可靠标志，HBV DNA定量检测能客观反映HBV滴度与临床病程的关系。
将基因扩增、核酸杂交和酶联显色当今3种诊断技术融为一体，发挥核酸杂交技术特异性强、PCR技术灵敏度高、ELISA方法信号判断方便的优点，发展了微板核酸杂交-ELISA技术。该方法不仅能对HBV DNA定性检测，而且能检测其含量。采用极限稀释法将核酸模板倍比稀释，构建标准品，选一定的线形范围作标准曲线，其相关系数(r)可达到0.994，其灵敏度最高可达到1ng/L。
采用微板核酸杂交-ELISA技术对69例不同临床表现的肝炎患者血清中的HBV DNA含量的测定表明，88.24%的急性轻型肝炎患者和54.55%轻度慢性肝炎患者血清HBV DNA含量少于2 μg/L,在66.67%中度慢性肝炎患者的HBV DNA含量分布2～1000μg/L范围，75%重度慢性肝炎和45%急性重型肝炎患者的HBV DNA含量分布在1000 μg/L以上的范围。
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作者简介：王虹,男,1958年出生,1982年毕业于中山医科大学,硕士,副教授,电话85147269
参考文献
1 Ono Y，Ondo H，Sasada R et al. The complete nucleotide sequences of the cloned hepatitis B virus DNA subtype adr and adw. Nucleic Acids Res,1983,11:1747
2 Cross N. Quantitative PCR techniques and applications. Br J Heamatol,1995,89:693.
(收稿日期：1999-05-15), 百拇医药
单位：王虹 王省良 彭华国 (第一军医大学生物医学诊断研究中心，广州，510515)；成松 张文炳 (第一军医大学微生物学教研室，广州，510515)
关键词：微板核酸杂交；ELISA；HBV；DNA定量
微板核酸杂交 摘要：目的 采用微板核酸杂交-ELISA技术测定肝炎病人血清中HBV DNA含量。方法 用PCR法将病人血清标本扩增后，与两条特异性探针夹心杂交，然后通过酶联显色对69例不同临床表现的肝炎患者血清中HBV DNA进行定量检测。结果 20例急性重型肝炎血清中的DNA含量超过2μg/L，88.24%的急性轻型肝炎患者和54.55%轻度慢性肝炎患者血清中的HBV DNA含量少于2μg/L，66.67%中度慢性肝炎患者血清HBV DNA含量在2～1000 μg/L的范围，75%重度慢性肝炎和45%急性重型肝炎血清中的HBV DNA含量超过1000μg/L。结论 微板核酸杂交-ELISA检测方法能准确、快速进行核酸定量测定，特异性强，灵敏度高，稳定可靠，易自动化，对于研究病毒感染量与临床病程的关系具有较大的现实意义。
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中图分类号：R446.6
Quantification and analysis of HBV DNA in hepatitis patient serum using sandwich hybridization-ELISA assay on microplate
Wang Hong,Wang Shengliang，Peng Huaguo
(Institute of Molecular Biology Diagnosis，First Military Medical University Guangzhou，510515)
Wan Chengsong Zhang Wenbing
(Department of Microbiology，First Military Medical University，Guangzhou，510515)
, 百拇医药
Abstract：Objective To quantify HBV DNA in hepatitis patient serum using sandwich hybridization on microplate. Methods HBV DNA extracted from 69 hepatitis patients serum by PCR was hybridized to two specific probes，one of which one was capture probe and the other was detector probe labeled with 5’-biotin to quantitatively assay HBV DNA in hepatitis patient serum. Results Serum HBV DNA level was more than 2 μg /L serum in 20(28.98%) heavy acute hepatitis patients，and ess than 2 μg/L in 88.24% light acute hepatitis patients and in 54.55% light chronic hepatitis patients and between 2 μg/L and 1 000 μg/L in 66.67% middle chronic hepatitis patients and in 75% heavy chronic hepatitis patients. Conclusions Sandwich hybridization-ELISA on microplate is a more sensitive and specific clinic method for detecting quantitatively HBV DNA in hepatitis patient serum.
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Key words：sandwich hybridization on microplate; ELISA; HBV DNA quantification
微板核酸杂交-ELISA定量检测技术将基因扩增、核酸杂交和酶联显色当今3种诊断技术融为一体，具有特异性强、灵敏性高、操作简单、易自动化等特点，在探讨乙型肝炎发病机理、动态监测病情进展和评价药物疗效等方面具有广泛的应用价值。本文介绍采用微板核酸杂交-ELISA技术对69例肝炎患者血清HBV DNA的定量测定与分析。
1 材料与方法
1.1 质粒与标本 质粒pHBV-C由本中心构建；69例乙型肝炎患者血清采自佛山市第一人民医院。
1.2 试剂和仪器 HBV微板核酸杂交-核酸定量试剂盒由本中心研制。PCR仪为美国伯乐公司产品，Taq 酶为上海复华公司产品，M750-B型多功能紫外可见光分光光度计为江苏泰州无线电仪器厂产品，550型酶标仪为BIO-RAD公司产品，生物素、TMB、Taq酶、辣根过氧化氢酶(HRP)购自宝灵曼公司、华粤公司。
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1.3 杂交液主要配方 20×SSC、硫酸葡聚糖、去离子甲酰胺、PEG、SDS等；洗液：1×SSC；封闭剂：1%Ficoll 400、1%PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、1%BSA、HS-DNA、脱脂奶粉、甘氨酸。以上溶液均由本中心自行配制。
1.4 引物与探针 采用Primer软件设计引物，选取HBV DNA C区的保守序列作引物与探针[1]，由上海生工公司合成。其序列分别为：引物W1 TGGACGTCGCATGGAGACCACCGTGAA(1608-1634)，引物W2 GAAAGCTTCTGCGACGCCG-TGATTGAGA (2429-2402)，捕捉探针GATCCAGCATCCGCGGATCTAGTAGTCAATTATGTTAACACCAACATGGGCCTAAAGATCAGGCAAC(2132-2198)，信号探针 GGAATTAATGAC-TCTAGCTACCTGGGTGGGTAATAATTTGGAAG(1785-1845)。
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1.5 标本处理 取上清液10μl加入990μl双蒸水于1.5 ml离心管内混匀。取自制处理液50μl于0.5ml离心管内，加待测血清50μl，100℃煮沸15 min，12000r/min离心5 min。
1.6 标准品的构建和定量 把HBV DNA C区基因克隆到质粒中，用大肠杆菌增殖，提取质粒DNA，用微量分光光度计测定质粒DNA浓度(100 mg/L)。采用极限稀释法[2]，将核酸模板1:10倍比稀释，作32次循环的PCR，其阳性最大稀释度为1:105 (相当于1 ng/L)。选择有一定差异的5个浓度：16、8、4、2、0.25 ng/L为横坐标，A260nm值为纵坐标，作直线回归方程Y=aX+b，绘制标准曲线。
1.7 基因扩增 取标本上清液原液及其1:100倍比稀释液各4μl、5种浓度HBV DNA标准品各4μl和阴性对照4 μl于PCR反应管内，弹匀，上机，预变性94℃2min，循环条件：94℃50s、55℃50s、72℃50 s，共循环32次，最后72℃延伸3 min。
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1.8 探针包被与封闭 在37 ℃下，用碳酸盐缓冲液(pH 9.6)等将包被探针在微板孔上包被14h。用封闭剂封闭微板孔非特异性结合位点。
1.9 杂交 取扩增产物在94℃下变性10 min，迅速冰浴10 min。取已变性产物20 μl，杂交液90μl、显色探针10 μl(200 nmol)于反应孔内，轻轻摇动混匀，50℃杂交2 h，甩净液体。在每孔中加入洗液200 μl，置室温3～5 min，甩净，再重复洗二次。然后加入酶抗体100μl，37℃30 min后，甩净，加入洗液200 μl，置室温3～5 min，再重复洗两次。每孔加入底物TMB一滴，置室温8 min后加入2%硫酸溶液两滴终止反应。
1.10 结果判断 肉眼观察显黄色为阳性(+)，不显色为阴性(-)。选取每个阳性血清标本最大稀释度在酶标仪450nm处读数，并根据标准品标准曲线计算阳性标本的HBV DNA浓度(ng/L血清)。
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2 结果
2.1 HBV DNA标准品极限稀释的A260nm值结果和标准曲线 将HBV DNA标准品作极限稀释，核酸杂交显色的最大阳性稀释度为1:105。选线形关系相对好的范围(相当于1～100 ng/L)作标准曲线，其相关系数r可达到0.994。结果如下：
图1 HBV DNA标准品极限稀释的A260nm值结果
Fig.1 Relation between A260 and different Concentration of HBV DNA
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.1:101，2.1:102，3.1:103，4.1:104，5.1:105，6.1:106，7.negative control，8.blank control
2.2 HBV DNA含量与肝炎临床病程的关系 我们对69例不同临床表现的肝炎患者血清中的HBV DNA含量进行了测定，其中急性肝炎37例，慢性肝炎32例。结果如下：17例急性轻型肝炎患者中，15例患者血清中的HBV DNA含量小于2μg/L，2例介于2～1000μg/L之间；20例急性重型肝炎患者中，11例患者血清中的DNA含量介于2～1000 μg/L之间，9例超过1000μg/L。11例轻度慢性肝炎患者中，6例患者血清中的DNA含量小于2 μg/L，5例介于2～1000μg/L之间；9例中度慢性肝炎患者中，6例介于2～1000μg/L之间，3例超过1000μg/L；12例重度慢性肝炎患者中，3例介于2～1000μg/L之间，9例超过1000μg/L。
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3 讨论
HBV呈世界范围流行，我国尤甚，其发病率高，治疗难度大，目前尚没有更好的方法能全面评价病毒感染量与临床病情的关系。血清中HBV DNA是病毒复制活动最直接和最可靠标志，HBV DNA定量检测能客观反映HBV滴度与临床病程的关系。
将基因扩增、核酸杂交和酶联显色当今3种诊断技术融为一体，发挥核酸杂交技术特异性强、PCR技术灵敏度高、ELISA方法信号判断方便的优点，发展了微板核酸杂交-ELISA技术。该方法不仅能对HBV DNA定性检测，而且能检测其含量。采用极限稀释法将核酸模板倍比稀释，构建标准品，选一定的线形范围作标准曲线，其相关系数(r)可达到0.994，其灵敏度最高可达到1ng/L。
采用微板核酸杂交-ELISA技术对69例不同临床表现的肝炎患者血清中的HBV DNA含量的测定表明，88.24%的急性轻型肝炎患者和54.55%轻度慢性肝炎患者血清HBV DNA含量少于2 μg/L,在66.67%中度慢性肝炎患者的HBV DNA含量分布2～1000μg/L范围，75%重度慢性肝炎和45%急性重型肝炎患者的HBV DNA含量分布在1000 μg/L以上的范围。
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作者简介：王虹,男,1958年出生,1982年毕业于中山医科大学,硕士,副教授,电话85147269
参考文献
1 Ono Y，Ondo H，Sasada R et al. The complete nucleotide sequences of the cloned hepatitis B virus DNA subtype adr and adw. Nucleic Acids Res,1983,11:1747
2 Cross N. Quantitative PCR techniques and applications. Br J Heamatol,1995,89:693.
(收稿日期：1999-05-15), 百拇医药