大鼠外周血白细胞糖皮质激素受体的测定*
作者：乐颖影 李晓文
单位：第一军医大学生理学教研室，广州 510515
关键词：受体；糖皮质激素；放射配体测定；白细胞；大鼠
第一军医大学学报990404 摘要：目的 为了测定糖皮质激素受体(GR)的结合参数，以利于今后进一步探讨GR改变在某些疾病发生中的作用及对治疗的指导意义。材料和方法 以[3H]地塞米松(Dex)为配基，建立了大鼠外周血GR的放射配体结合测定方法。结果 Scatchard 作图分析[3H]Dex特异结合呈一直线，表观结合容量(Ro)和平衡解离常数(Kd)分别为(3387±328)位点/细胞和(2.35±1.13)nmol/L(
±s，n=5)，[3H]Dex特异结合有明显的甾体特异性。结论 大鼠外周血白细胞[3H]Dex特异结合部位具备了鉴定受体所必须的基本条件。
, 百拇医药
中图分类号：R966
A method for leukocyte glucocorticoid receptor characterization in rats
Le Yingying，Li Xiaowen
(Department of Physiology，First Military Medical University，Guangzhou，510515)
Abstract：Objective To determine the binding constants of glucocorticoid receptor (GR)，and further study the effects of the changes of glucocorticoid receptor on the pathogenesis and treatment of some diseases.Material and Method A method for measurement of glucocorticoid receptor in rat peripheral leukocytes was established using the radio-ligand binding assay with [3H]dexamethasone (Dex) as the ligand.Results The Scatchard plot analysis of [3H]Dex binding to rat leukocyte showed single class of binding sites.The binding capacity and apparent Kd were 3387±328 sites/cell and 3.35±1.23 nmol/L(±s，n=5) respectively.The binding sites showed higher glucocorticoid specificity.Conclusion The specific binding site of [3H]Dex in rat leukocyte fulfill the basic requirements of receptor.
, 百拇医药
Key words：glucocorticoid；receptors；radioligand assay；leukocytes；rats
受体测定方法的建立，为疾病发生机理的研究、疾病的辅助诊断、治疗及预后提供了有效的手段。已知外周血白细胞是糖皮质激素作用的靶细胞，存在糖皮质激素受体(GR)。本文参照文献方法建立了大鼠外周血白细胞GR的测定方法，以便于进一步探讨GR改变在某些疾病发生中的作用及对治疗的指导意义。
1 材料与方法
1.1 试剂 [1,2,4-3H]地塞米松(Dex)，美国杜邦公司产品，166.5×1010 Bq/mol (45 Ci/mmol)，放化纯度97%，放化浓度37 MBq/mmol，稀释100倍使用。地塞米松(Dex)、皮质醇、醛固酮、雌二醇、孕酮、睾酮均为Sigma产品。葡聚糖T500(Dextran T500，MW 500，5000)，Pharmacia产品，用PBS配成3%使用。Tris-NH4Cl溶液：Tris 2.06 g，NH4Cl7.47 g，KCl2.4 g，加蒸馏水至1000 ml，pH7.4。磷酸生理盐水缓冲液(PBS)：6.7 mmol/LK2HPO4，6.7 mmol/L KH2PO4，150mmol/LNaCl，pH 7.4。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 白细胞的分离 大鼠断头取血，肝素抗凝(每管加2.0%肝素钠0.2 ml)，250 g离心15～20min，弃血浆，加入血细胞2倍体积的PBS，再加入总容积1/2的3% Dextran T500，充分混匀，将试管竖立静置15～20 min。吸出含白细胞的上清液，600 g离心5 min，弃上清。沉淀物内加入8 mlTris-NH4Cl溶液，34℃水浴20 min，600 g离心5 min，弃上清，重复用PBS冲洗2次，用Hanks液制成白细胞悬液。
1.2.2 白细胞[3H]Dex特异结合的测定 将白细胞悬液置于37℃水浴10 min，Hanks液冲洗(去除内源性糖皮质激素)后，用Hanks液调成(1～6)×106个细胞/ml。总结合管加细胞悬液0.5 ml，不同浓度[3H]Dex； 非特异结合管除加等量[3H]Dex外，再加2 000倍浓度Dex，同一浓度[3H]Dex 的特异结合与非特异结合均作3个平行管，24℃孵育4 h，加3 ml冷PBS中止反应，离心，弃上清，再用冷PBS洗2次。沉渣内加甲酸0.1 ml，100℃水浴5 min，以6 ml闪液分3次将样品移入闪瓶内，用Beckman液体闪烁计数仪计数(计数效率55%)，取平行管每分钟计数(min-1)的均值，总结合减去非特异结合即为特异结合。
, 百拇医药
2 结果
2.1 白细胞的存活率 分离白细胞，将细胞悬液放置于24℃水浴4 h，细胞成活率(台盼蓝染色法)为(95.3±2.5)%，说明该孵育条件对细胞的活力无明显影响。
2.2 [3H]Dex特异结合测定条件的选择
2.2.1 孵育时间及温度 将加入12 nmol/L[3H]Dex 及12 nmol/L[3H]Dex+2000倍浓度Dex的白细胞悬液放于24℃水浴，于不同时间取出测定其特异结合量。结果(图1)表明，24℃孵育3 h反应达平衡，5 h内结合稳定。另外还测定了37℃孵育不同时间的[3H]Dex特异结合量，10 min反应达平衡，60 min内结合稳定。由于24℃孵育时的特异结合量大于37℃，因此将孵育条件定为24℃、4h。
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图1 孵育时间对大鼠白细胞 [3H]Dex特异结合量的影响
Fig.1 Effect of time on the specific binding of [3H]Dex to rat leukocytes
2.2.2 [3H]Dex特异结合量与细胞数的关系 将白细胞悬液调成不同浓度，总结合管加入12nmol/L[3H]Dex，非特异结合管加等量[3H]Dex及2000倍浓度的非标记Dex，测定[3H]Dex特异结合量。结果(图2)表明，当白细胞浓度在(1～6)×106范围内时，[3H]Dex特异结合与细胞数之间呈良好的线性关系(相关系数r =0.995，P<0.01)。故以后实验将细胞浓度调至此范围内。
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图2 大鼠白细胞浓度与 [3H]Dex 特异结合量的关系
Fig.2 Relationship between cell number and binding of [3H]Dex to rat leukocytes
2.2.3 饱和曲线与Scatchard 作图 总结合管加入1～16 nmol/L[3H]Dex，非特异结合管除加[3H]Dex外，再加2 000倍浓度的非标记Dex，每管均加细胞悬液0.5 ml，按上述方法测定大鼠白细胞[3H]Dex特异结合量。结果表明，当[3H]Dex浓度达12 nmol/L时，特异结合基本饱和，Scatchard作图呈一直线，表观结合容量(Ro)和平衡解离常数(Kd)分别为(3387±328)位点/细胞和(2.35±1.13)nmol/L(±s，n=5，图3为其中一次实验结果)。
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图3 大鼠白细胞[3H]Dex特异结合的饱和曲线 (A)及Scatchard 作图 (B)
Fig.3 Binding curve(A) and Scatchard analysis (B) of [3H]Dex to rat leukocytes
2.2.4 [3H]Dex结合的甾体特异性 白细胞悬液0.5 ml加入12 nmol/L [3H]Dex，以2000倍浓度的Dex及其它非标记甾体激素作竞争实验，以Dex取代时的特异结合为100%，计算其它甾体激素取代时结合率。大鼠外周血白细胞GR与各种甾体激素的亲和力为：Dex(100%)>皮质醇(93.50%)>醛固酮(75.36%)>孕酮(70.20%)>雌二醇(30.25%)>睾酮(27.61%)。说明[3H]Dex特异结合位点与糖皮质激素的亲和力最高。
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3 讨论
国内外有关动物外周血白细胞糖皮质激素受体的研究工作，仅见有在兔、山羊、狗所做工作的报道[1～2]，尚未见大鼠外周血白细胞GR测定方法的报道。我们参照上述文献方法建立了大鼠外周血白细胞GR的放射配体结合测定法。确定了白细胞[3H]Dex特异结合测定的最适条件：最适孵育时间和温度为24℃、4 h；当白细胞浓度在(1～6)×106范围内时，[3H]Dex特异结合与细胞数之间呈良好的线性关系。当[3H]Dex浓度达12 nmol/L时，特异结合基本饱和，Scatchard作图呈一直线，表观结合容量(Ro)和平衡解离常数(Kd)分别为(3387±328)位点/细胞和(2.35±1.13)nmol/L(±s，n=5)，竞争实验表明[3H]Dex特异结合位点与糖皮质激素的亲和力最高。以上结果显示大鼠外周血白细胞[3H]Dex特异结合部位具有可饱和性、高亲和力和甾体特异性等特点，具备了鉴定受体所必须的基本条件。利用大鼠外周血白细胞研究GR的特性，具有取材方便，可重复性好等优点，作为研究GR改变在某些疾病发生中的作用及对治疗的指导意义，是较理想的手段之一。
, 百拇医药
*广东省自然科学基金(960327)
作者简介：乐颖影,女,1964年出生,1992年毕业于第二军医大学;博士,副教授,电话85148363
参考文献
1 Simonsson B.Uptake of 3H-cortisol by rabbit polymorphonuclear leukocytes in vitro: (3) Structural evidence for a specific glucocorticoid uptake.Steroids，1972，20: 23
2 黄宗海，高 瀚，徐仁宝。狗外周血白细胞糖皮质激素受体的测定。中国病理生理杂志，1987，3(2):99
(收稿日期：1998-11-25), http://www.100md.com
单位：第一军医大学生理学教研室，广州 510515
关键词：受体；糖皮质激素；放射配体测定；白细胞；大鼠
第一军医大学学报990404 摘要：目的 为了测定糖皮质激素受体(GR)的结合参数，以利于今后进一步探讨GR改变在某些疾病发生中的作用及对治疗的指导意义。材料和方法 以[3H]地塞米松(Dex)为配基，建立了大鼠外周血GR的放射配体结合测定方法。结果 Scatchard 作图分析[3H]Dex特异结合呈一直线，表观结合容量(Ro)和平衡解离常数(Kd)分别为(3387±328)位点/细胞和(2.35±1.13)nmol/L(
±s，n=5)，[3H]Dex特异结合有明显的甾体特异性。结论 大鼠外周血白细胞[3H]Dex特异结合部位具备了鉴定受体所必须的基本条件。, 百拇医药
中图分类号：R966
A method for leukocyte glucocorticoid receptor characterization in rats
Le Yingying，Li Xiaowen
(Department of Physiology，First Military Medical University，Guangzhou，510515)
Abstract：Objective To determine the binding constants of glucocorticoid receptor (GR)，and further study the effects of the changes of glucocorticoid receptor on the pathogenesis and treatment of some diseases.Material and Method A method for measurement of glucocorticoid receptor in rat peripheral leukocytes was established using the radio-ligand binding assay with [3H]dexamethasone (Dex) as the ligand.Results The Scatchard plot analysis of [3H]Dex binding to rat leukocyte showed single class of binding sites.The binding capacity and apparent Kd were 3387±328 sites/cell and 3.35±1.23 nmol/L(
±s，n=5) respectively.The binding sites showed higher glucocorticoid specificity.Conclusion The specific binding site of [3H]Dex in rat leukocyte fulfill the basic requirements of receptor., 百拇医药
Key words：glucocorticoid；receptors；radioligand assay；leukocytes；rats
受体测定方法的建立，为疾病发生机理的研究、疾病的辅助诊断、治疗及预后提供了有效的手段。已知外周血白细胞是糖皮质激素作用的靶细胞，存在糖皮质激素受体(GR)。本文参照文献方法建立了大鼠外周血白细胞GR的测定方法，以便于进一步探讨GR改变在某些疾病发生中的作用及对治疗的指导意义。
1 材料与方法
1.1 试剂 [1,2,4-3H]地塞米松(Dex)，美国杜邦公司产品，166.5×1010 Bq/mol (45 Ci/mmol)，放化纯度97%，放化浓度37 MBq/mmol，稀释100倍使用。地塞米松(Dex)、皮质醇、醛固酮、雌二醇、孕酮、睾酮均为Sigma产品。葡聚糖T500(Dextran T500，MW 500，5000)，Pharmacia产品，用PBS配成3%使用。Tris-NH4Cl溶液：Tris 2.06 g，NH4Cl7.47 g，KCl2.4 g，加蒸馏水至1000 ml，pH7.4。磷酸生理盐水缓冲液(PBS)：6.7 mmol/LK2HPO4，6.7 mmol/L KH2PO4，150mmol/LNaCl，pH 7.4。
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1.2 方法
1.2.1 白细胞的分离 大鼠断头取血，肝素抗凝(每管加2.0%肝素钠0.2 ml)，250 g离心15～20min，弃血浆，加入血细胞2倍体积的PBS，再加入总容积1/2的3% Dextran T500，充分混匀，将试管竖立静置15～20 min。吸出含白细胞的上清液，600 g离心5 min，弃上清。沉淀物内加入8 mlTris-NH4Cl溶液，34℃水浴20 min，600 g离心5 min，弃上清，重复用PBS冲洗2次，用Hanks液制成白细胞悬液。
1.2.2 白细胞[3H]Dex特异结合的测定 将白细胞悬液置于37℃水浴10 min，Hanks液冲洗(去除内源性糖皮质激素)后，用Hanks液调成(1～6)×106个细胞/ml。总结合管加细胞悬液0.5 ml，不同浓度[3H]Dex； 非特异结合管除加等量[3H]Dex外，再加2 000倍浓度Dex，同一浓度[3H]Dex 的特异结合与非特异结合均作3个平行管，24℃孵育4 h，加3 ml冷PBS中止反应，离心，弃上清，再用冷PBS洗2次。沉渣内加甲酸0.1 ml，100℃水浴5 min，以6 ml闪液分3次将样品移入闪瓶内，用Beckman液体闪烁计数仪计数(计数效率55%)，取平行管每分钟计数(min-1)的均值，总结合减去非特异结合即为特异结合。
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2 结果
2.1 白细胞的存活率 分离白细胞，将细胞悬液放置于24℃水浴4 h，细胞成活率(台盼蓝染色法)为(95.3±2.5)%，说明该孵育条件对细胞的活力无明显影响。
2.2 [3H]Dex特异结合测定条件的选择
2.2.1 孵育时间及温度 将加入12 nmol/L[3H]Dex 及12 nmol/L[3H]Dex+2000倍浓度Dex的白细胞悬液放于24℃水浴，于不同时间取出测定其特异结合量。结果(图1)表明，24℃孵育3 h反应达平衡，5 h内结合稳定。另外还测定了37℃孵育不同时间的[3H]Dex特异结合量，10 min反应达平衡，60 min内结合稳定。由于24℃孵育时的特异结合量大于37℃，因此将孵育条件定为24℃、4h。
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图1 孵育时间对大鼠白细胞 [3H]Dex特异结合量的影响
Fig.1 Effect of time on the specific binding of [3H]Dex to rat leukocytes
2.2.2 [3H]Dex特异结合量与细胞数的关系 将白细胞悬液调成不同浓度，总结合管加入12nmol/L[3H]Dex，非特异结合管加等量[3H]Dex及2000倍浓度的非标记Dex，测定[3H]Dex特异结合量。结果(图2)表明，当白细胞浓度在(1～6)×106范围内时，[3H]Dex特异结合与细胞数之间呈良好的线性关系(相关系数r =0.995，P<0.01)。故以后实验将细胞浓度调至此范围内。
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图2 大鼠白细胞浓度与 [3H]Dex 特异结合量的关系
Fig.2 Relationship between cell number and binding of [3H]Dex to rat leukocytes
2.2.3 饱和曲线与Scatchard 作图 总结合管加入1～16 nmol/L[3H]Dex，非特异结合管除加[3H]Dex外，再加2 000倍浓度的非标记Dex，每管均加细胞悬液0.5 ml，按上述方法测定大鼠白细胞[3H]Dex特异结合量。结果表明，当[3H]Dex浓度达12 nmol/L时，特异结合基本饱和，Scatchard作图呈一直线，表观结合容量(Ro)和平衡解离常数(Kd)分别为(3387±328)位点/细胞和(2.35±1.13)nmol/L(
±s，n=5，图3为其中一次实验结果)。, http://www.100md.com
图3 大鼠白细胞[3H]Dex特异结合的饱和曲线 (A)及Scatchard 作图 (B)
Fig.3 Binding curve(A) and Scatchard analysis (B) of [3H]Dex to rat leukocytes
2.2.4 [3H]Dex结合的甾体特异性 白细胞悬液0.5 ml加入12 nmol/L [3H]Dex，以2000倍浓度的Dex及其它非标记甾体激素作竞争实验，以Dex取代时的特异结合为100%，计算其它甾体激素取代时结合率。大鼠外周血白细胞GR与各种甾体激素的亲和力为：Dex(100%)>皮质醇(93.50%)>醛固酮(75.36%)>孕酮(70.20%)>雌二醇(30.25%)>睾酮(27.61%)。说明[3H]Dex特异结合位点与糖皮质激素的亲和力最高。
, 百拇医药
3 讨论
国内外有关动物外周血白细胞糖皮质激素受体的研究工作，仅见有在兔、山羊、狗所做工作的报道[1～2]，尚未见大鼠外周血白细胞GR测定方法的报道。我们参照上述文献方法建立了大鼠外周血白细胞GR的放射配体结合测定法。确定了白细胞[3H]Dex特异结合测定的最适条件：最适孵育时间和温度为24℃、4 h；当白细胞浓度在(1～6)×106范围内时，[3H]Dex特异结合与细胞数之间呈良好的线性关系。当[3H]Dex浓度达12 nmol/L时，特异结合基本饱和，Scatchard作图呈一直线，表观结合容量(Ro)和平衡解离常数(Kd)分别为(3387±328)位点/细胞和(2.35±1.13)nmol/L(
±s，n=5)，竞争实验表明[3H]Dex特异结合位点与糖皮质激素的亲和力最高。以上结果显示大鼠外周血白细胞[3H]Dex特异结合部位具有可饱和性、高亲和力和甾体特异性等特点，具备了鉴定受体所必须的基本条件。利用大鼠外周血白细胞研究GR的特性，具有取材方便，可重复性好等优点，作为研究GR改变在某些疾病发生中的作用及对治疗的指导意义，是较理想的手段之一。, 百拇医药
*广东省自然科学基金(960327)
作者简介：乐颖影,女,1964年出生,1992年毕业于第二军医大学;博士,副教授,电话85148363
参考文献
1 Simonsson B.Uptake of 3H-cortisol by rabbit polymorphonuclear leukocytes in vitro: (3) Structural evidence for a specific glucocorticoid uptake.Steroids，1972，20: 23
2 黄宗海，高 瀚，徐仁宝。狗外周血白细胞糖皮质激素受体的测定。中国病理生理杂志，1987，3(2):99
(收稿日期：1998-11-25), http://www.100md.com