局灶性脑缺血大鼠TGFβ1免疫组化研究
作者：杨四清 黄怀钧 王凤霞
单位：湖北医科大学附属第二医院神经科 武汉 430071
关键词：脑缺血；TGFβ1；免疫组织化学；缺血半影区
医学新知杂志990402 摘要 实验采用阻断一侧大脑中动脉(MCAO)造成局灶性脑缺血模型，运用免疫组织化学方法测定脑缺血1 h及3 h脑组织中的TGFβ1阳性染色状况。结果显示：①脑缺血1 h后缺血侧与缺血对侧、缺血侧与对照组的TGFβ1染色均有显著性差异(P<0.05)；而缺血中心和缺血半影区的比较无统计学意义(P>0.05)；②脑缺血3 h后的TGFβ1表达较缺血1 h有新的变化，缺血半影区阳性率呈上升趋势而缺血中心则呈下降趋势(93.3%vs 100%，73.3%vs 60%)，其变化具有显著性差异(P<0.05)。表明脑缺血后神经细胞TGFβ1表达增高及TGFβ1可能参与神经细胞抗损伤机制。
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Increased Expression of TGFβ1 in Experimental
Rat Following Middle Cerebral Artery Occlusion
Yang Siqing Huang Huaijun Wang Fengxia
Dept. of Neurology, 2nd Hospital of Hubei Medical University, Wuhan 430071
Abstract In this experiment, using the model of focal cerebral ischemia by occluding the middle cerebral artery in rat, We observed TGFβ1 staining in its brain which had been occluded for 1 hour or 3 hours by immunohistochemistry. The results showed:1.the expression of TGFβ1 in the group one (occlueded for 1 hour) was significant difference between infarct versus conrtolateral hemisphere and infarct versus control subject (P<0.05), otherwise there was no significance between ischemic core and ischemic penumbra(IP). 2.the expression of TGFβ1 in the group two (occluded for 3 hours) was highly significant difference between infarct versus nonischemic subject and infarct versus conrtol subject (P<0.01), and there was significant differerce between ischemic core and IP. Conclusion: expression of TGFβ1 in rat following PMCAO had increased and it might be of neuroprotective value.
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Key words Cerebral ischemia; TGFβ1; Immunohistochemisrty; IP.
脑缺血后神经细胞损害的机制研究已经进入分子水平，研究较多的有白细胞介素1～3(InterleuKin1～3，IL1～3)、IL6、IL8、肿瘤坏死因子(Tumour necrosis factor, TNF)等[1，2]。上述细胞因子主要参与脑缺血后细胞炎症反应，加重脑缺血后神经细胞的损害，也有结果表明在缺血后期参与神经细胞的修复[3]。转化生长因子β1(Transforming growth factor beta1，TGFβ1)是另外一种具同源双链、分子量为25 ku的多肽类细胞因子，免疫组织化学及Western斑点杂交显示TGFβ1主要位于细胞膜/细胞浆中，正常情况下主要分布于血小板及骨组织中，大脑组织含量极少。因此对TGFβ1在肿瘤、骨折修复、造血、肝脏损伤机制中的作用研究较多，尤其对细胞间质、免疫调节等方面的作用机制已逐步成熟，而在脑缺血中的研究较少。已知TGFβ1参与IL1～3、IL6、TNF、干扰素等细胞因子的相互调节，TGFβ1与BCL2具有协同作用、参与氧自由基代谢的调节等[4]，提示TGFβ1可能与脑缺血后损伤或抗损伤调节有关。为揭示TGFβ1在脑缺血早期的表达及其在不同部位表达之间的规律，我们采用大鼠永久性局灶性脑缺血模型(Permanent middle cerebral artery occlusion, PMCAO)，运用免疫组织化学的方法对脑缺血不同时间及脑组织不同部位TGFβ1表达进行检测，以探讨脑缺血时缺血中心及缺血周边脑组织(缺血半影区)神经细胞损伤、抗损伤的又一分子机制，尤其通过对TGFβ1在各部位表达及其表达的时相关系的研究，揭示TGFβ1参与缺血后神经细胞抗损伤机制。
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1 材料和方法
1.1 大鼠PMCAO模型制备 选择健康、体重250 g左右的Wistar大鼠45只，雌雄不限，大鼠随机分为三大组：缺血组1(n=15)，缺血时间1 h；缺血组2(n=15)，缺血时间3 h；对照组即假手术组(n=15)，未行MCA栓塞。用3%戊巴比妥钠35.40 mg/kg腹腔麻醉。大鼠取仰卧固定，行颈正中长约2 cm切口，暴露左颈外动脉(ECA)及枕动脉，在近颅底处分离颈内动脉(ICA)颅外段唯一分支——翼腭动脉，并将其起始部结扎，在ECA残端剪一小孔，将一长约20 mm的60尼龙线，其首端7 mm粘上硅橡胶成直径0.2 mm，经小孔插入ECA及ICA，再将尼龙线继续送入共约19 mm时，可遇轻微阻力，表明尼龙线头端已达大脑前动脉(ACA)近端壁，即将大脑中动脉(MCA)起始部阻塞。分别将三组大鼠采用磷酸缓冲液(含4%多聚甲醛)灌注固定，断头取脑，再用上述固定液固定3 h后加入7%乙醇过夜，次日经梯度乙醇脱水，石蜡包埋冠状切片[5]。用TTC(氯化三苯基四氮唑)染色法确定梗塞范围，经栓线阻断法阻断MCA 1 h后，断头取脑，放入2%TTC液中，37℃水溶15～30 min，可见MCA闭塞后所支配的皮质(额叶、颞叶、顶叶)为白色，其它部位皮质为红色。
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1.2 免疫组织化学染色
1.2.1 试剂 兔源性抗TGFβ1多克隆抗体，美国Santa公司产品；TGFβ1 SABC(链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物)试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司产品。
1.2.2 免疫组织化学染色 采用美国Zymed公司于1986年建立和报道的链霉素-抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法(SABC)。步骤如下：①多聚甲醛液灌注固定的石蜡包埋的大鼠脑组织切片5 μm厚，经常规脱蜡水化后浸入PBS(0.01 M,pH 7.4)缓冲液中冲洗(5 min×3，下同)；②将固定好的脑组织切片在新鲜配制的3%H2O2中浸泡(室温，10 min)以阻断内源性过氧化物酶；③滴加复合消化液(室温，10 min)；④加入正常山羊血清50 μl，以减少非特异性背景染色，室温下孵化10 min，随后吸去切片周围多余的液体；⑤加入一抗(兔抗TGFβ1的多克隆抗体)，室温下孵化60 min，0.01 M PBS冲洗；⑥加入生物素化标记的二抗(羊抗兔)，室温下孵化20 min，0.01 M PBS冲洗；⑦滴加SABC 50 μl，室温下孵化20 min，0.01 M PBS冲冼4次；⑧加入50 μl新鲜配制的DAB溶液，室温显色3～5 min，显微镜下观察显色反应，蒸馏水洗涤；⑨苏木素轻度复染，脱水，透明，中性树胶封片。
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每次实验均设阳性对照和空白对照。
阳性对照：使用胃癌组织作阳性对照(武汉博士德生物工程有限公司提供)，染色过程同上。
空白对照：组织来源同上，染色过程除用PBS取代一抗外，余步骤相同。
1.2.3 染色结果判断 阳性者可见棕黄色颗粒。阳性百分数采用计数估计的半定量判断标准，即每高倍视野(HPF)100个细胞中的阳性细胞数。设立分级标准如下：未见阳性细胞计(-)，1%～25%计(+)，大于25%计(
)。
1.3 统计分析方法 TGFβ1免疫染色与部位的关系比较用秩和检验(H检验)；缺血中心及缺血半影区TGFβ1表达阳性率用四格表确切概率法检验。
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2 结果
2.1 TGFβ1免疫染色的细胞定位 胃癌组织细胞膜及部分细胞浆充满棕黄色颗粒，大鼠脑缺血中心及缺血半影区TGFβ1免疫染色主要位于神经经胞的胞浆。阳性细胞分布特点为缺血侧较缺血对侧及对照组密集，且着色较深、缺血时间不同、各部位阳性染色分布及强弱不同。
2.2 TGFβ1免疫染色结果
2.2.1 局灶性大鼠脑缺血1 h各部位TGFβ1染色的比较 缺血中心与缺血对侧有显著性差异(P<0.05)，缺血侧与对照组、缺血半影区与缺血对侧比较均有高度显著性差异(P<0.01)，见表1。
表1 局灶性大鼠脑缺血1 h各部位TGFβ1表达的比较(n) TGFβ1染色结果
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缺血中心
缺血半影区
缺血对侧
对照组
-
4
1
13
15
+
9
6
2
0
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2
8
0
0
Hc=37.82,P<0.005(两两比较用Nemenyi法)
2.2.2 局灶性大鼠脑缺血3 h各部位TGFβ1染色的比较 缺血中心与缺血半影区及对照组均有显著性差异(P<0.05)，缺血半影区与缺血对侧及对照组均有高度显著性差异(P<0.01)，见表2。
表2 局灶性大鼠脑缺血3 h各部位TGFβ1表达的比较(n)
TGFβ1染色结果
缺血中心
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缺血半影区
缺血对侧
对照组
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3
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Hc=42.77,P<0.005(两两比较用Nemenyi法)
2.2.3 局灶性大鼠脑缺血1 h、3 h各部位TGFβ1阳性染色率比较 缺血中心TGFβ1阳性染色率随缺血时间的延长而呈降低趋势(1 h,73.3% vs 3 h，60%)，相反，缺血半影区TGFβ1阳性染色率随缺血时间的延长而呈上升趋势(1 h,93.3% vs 3 h,100%)。
3 讨论
细胞因子参与调节脑缺血后神经细胞损伤与修复的研究，掀开了缺血性脑血管疾病因子机制研究的新领域。本实验运用免疫组织化学的方法对PMCAO大鼠脑组织TGFβ1活性蛋白的检测，可见缺血中心及缺血半影区TGFβ1表达较缺血对侧高；缺血1 h，大鼠脑组织缺血中心和缺血半影区TGFβ1阳性染色率分别为73.3%和93.3%，而缺血对侧的阳性率仅为13.3%，对照组无1例阳性。说明在脑缺血早期，TGFβ1在缺血中心及其周边区、半影区就有较多表达，与Klempt等[6]报道接近，但缺血中心与缺血半影区TGFβ1表达无显著性差异(P>0.05)，可能与脑缺血早期损伤因子如IL1～3、IL6、TNF等占主导地位有关。大多数实验证实IL1、IL6、TNF等细胞因子早期参与脑缺血的炎症反应，加重脑损害[7，8]。
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随着缺血时间的延长，即在缺血3 h组中，TGFβ1阳性表达仍然以缺血中心及缺血半影区为主，而缺血对侧及对照组很少。但是缺血半影区TGFβ1明显高于缺血中心(P<0.05)，说明缺血中心脑组织损害逐渐走向不可逆性损害；而缺血半影区TGFβ1继续增高，进一步说明TGFβ1可能参与缺血后神经细胞的抗损伤机制，延缓缺血周边区神经细胞的损害。据Saito等[9]报道，TGFβ1在中枢神经系统中充当一种化学信使，通过改变中枢神经系统神经元对兴奋性递质的反应，改变细胞外钙离子的注入与释放，选择性增强细胞内钙离子对N甲基D天冬氨酸(NMNA)的反应，阻碍细胞钙内流，延缓细胞的损害。脑缺血不同时间脑组织各相应部位的TGFβ1 阳性率比较均无显著性差异(P>0.05)，但各自的趋势反映：缺血中心呈下降趋势而缺血半影区则呈上升趋势，至缺血3 h，缺血半影区已与缺血中心存在显著性差异，从数字角度分析，这种差异与缺血中心的TGFβ1阳性染色的下降更有关联，推测TGFβ1在缺血半影区参与积极的抗损伤的作用。Unsicker K等[10]证实TGFβ1能增加BCL-2蛋白合成，二者为一协同调节信使，而BCL2基因及其蛋白在调控凋亡中发挥重要作用，对脑缺血损伤诱导的细胞凋亡、致使细胞迟发性损伤具有较确切抑制作用。这可能为TGFβ1间接参与抗细胞凋亡，减轻或延缓神经细胞损伤的机理。本研究结果显示，脑缺血3 h时缺血对侧TGFβ1的阳性表达与缺血1 h比较虽无统计学意义，但呈上升趋势，可能与局灶性脑缺血随时间的延长出现全脑的损害有关。综上所述，TGFβ1参与脑缺血抗损伤机理，TGFβ1蛋白可能对神经细胞起保护作用。
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参考文献
1 Yabuuchi K, Minamin M, Katsumata S, et al. Localization of type I interleukin 1 receptor mRNA in the rat brain. Mol Brain Res, 1994,27(1):26～27
2 Yamassaki Y, Itoyama Y, Kogurek. Involvement of cytokine production in pathogenesis of transient cerebrtal ischemic damage. Keio J Med， 1996,45(3):225～229
3 Krupinski J, Kaluza J, Kumar P, et al. The role of angiogenesis in patients with cerebral ischemic stroke. Stroke, 1994,25(2):1794～1798
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4 Prehn J H, Bindokas V, Marcuccillic, et al. Regulation of neuronal BCL2 protein expression and calcium homeostasis by transforming growth factor type beta conferswideranging protection on rat hippocampal neurons. Proc Natl Acad Sci USA， 1994,91(4):12599～12603
5 朱长庚主编.神经免疫细胞化学.北京：科学出版社，1990.8～31
6 Klempt N D, Sirimanne E, Gunn A J, et al. Hypoxiaischemia induces transforming growth gactor beta 1 mRNA in the infarct rat brain. Brain Res Mol Brain Res， 1992,13(1～2):93～101
, 百拇医药
7 Ilyin S E, PlataSalaman C R. In vivo regularion of the I L1β system(ligand, receptors Ⅰand Ⅱ, receptor accessary protein, and receptor antagonsit)and TNFа mRNAs in specific brain region. Biochem Biophys Res Commun, 1996,227(3):861～867
8 Gehrmann J, Banati R B, Wiessner C, et al. Reactive microglia in cerebral ischemia: an early mediator of tissue damage? Neuropathol Appl Neurobiol,1995,21(4)：277～289
9 Saito K, Suyama K, Nishidak, et al. Early increase in TNFа, IL6 and IL1 beta levels following transient cerebral ischemia in gerbil brain. Neurosci Lett, 1996,206(2):149～152
10 Unsicker K, Grothe C, Westermann R, et al. Cytokines in neural regenneration. Curr Opin Neurobiol,1992,(4):671～678
收稿日期：1999-02-01, 百拇医药
单位：湖北医科大学附属第二医院神经科 武汉 430071
关键词：脑缺血；TGFβ1；免疫组织化学；缺血半影区
医学新知杂志990402 摘要 实验采用阻断一侧大脑中动脉(MCAO)造成局灶性脑缺血模型，运用免疫组织化学方法测定脑缺血1 h及3 h脑组织中的TGFβ1阳性染色状况。结果显示：①脑缺血1 h后缺血侧与缺血对侧、缺血侧与对照组的TGFβ1染色均有显著性差异(P<0.05)；而缺血中心和缺血半影区的比较无统计学意义(P>0.05)；②脑缺血3 h后的TGFβ1表达较缺血1 h有新的变化，缺血半影区阳性率呈上升趋势而缺血中心则呈下降趋势(93.3%vs 100%，73.3%vs 60%)，其变化具有显著性差异(P<0.05)。表明脑缺血后神经细胞TGFβ1表达增高及TGFβ1可能参与神经细胞抗损伤机制。
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Increased Expression of TGFβ1 in Experimental
Rat Following Middle Cerebral Artery Occlusion
Yang Siqing Huang Huaijun Wang Fengxia
Dept. of Neurology, 2nd Hospital of Hubei Medical University, Wuhan 430071
Abstract In this experiment, using the model of focal cerebral ischemia by occluding the middle cerebral artery in rat, We observed TGFβ1 staining in its brain which had been occluded for 1 hour or 3 hours by immunohistochemistry. The results showed:1.the expression of TGFβ1 in the group one (occlueded for 1 hour) was significant difference between infarct versus conrtolateral hemisphere and infarct versus control subject (P<0.05), otherwise there was no significance between ischemic core and ischemic penumbra(IP). 2.the expression of TGFβ1 in the group two (occluded for 3 hours) was highly significant difference between infarct versus nonischemic subject and infarct versus conrtol subject (P<0.01), and there was significant differerce between ischemic core and IP. Conclusion: expression of TGFβ1 in rat following PMCAO had increased and it might be of neuroprotective value.
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Key words Cerebral ischemia; TGFβ1; Immunohistochemisrty; IP.
脑缺血后神经细胞损害的机制研究已经进入分子水平，研究较多的有白细胞介素1～3(InterleuKin1～3，IL1～3)、IL6、IL8、肿瘤坏死因子(Tumour necrosis factor, TNF)等[1，2]。上述细胞因子主要参与脑缺血后细胞炎症反应，加重脑缺血后神经细胞的损害，也有结果表明在缺血后期参与神经细胞的修复[3]。转化生长因子β1(Transforming growth factor beta1，TGFβ1)是另外一种具同源双链、分子量为25 ku的多肽类细胞因子，免疫组织化学及Western斑点杂交显示TGFβ1主要位于细胞膜/细胞浆中，正常情况下主要分布于血小板及骨组织中，大脑组织含量极少。因此对TGFβ1在肿瘤、骨折修复、造血、肝脏损伤机制中的作用研究较多，尤其对细胞间质、免疫调节等方面的作用机制已逐步成熟，而在脑缺血中的研究较少。已知TGFβ1参与IL1～3、IL6、TNF、干扰素等细胞因子的相互调节，TGFβ1与BCL2具有协同作用、参与氧自由基代谢的调节等[4]，提示TGFβ1可能与脑缺血后损伤或抗损伤调节有关。为揭示TGFβ1在脑缺血早期的表达及其在不同部位表达之间的规律，我们采用大鼠永久性局灶性脑缺血模型(Permanent middle cerebral artery occlusion, PMCAO)，运用免疫组织化学的方法对脑缺血不同时间及脑组织不同部位TGFβ1表达进行检测，以探讨脑缺血时缺血中心及缺血周边脑组织(缺血半影区)神经细胞损伤、抗损伤的又一分子机制，尤其通过对TGFβ1在各部位表达及其表达的时相关系的研究，揭示TGFβ1参与缺血后神经细胞抗损伤机制。
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1 材料和方法
1.1 大鼠PMCAO模型制备 选择健康、体重250 g左右的Wistar大鼠45只，雌雄不限，大鼠随机分为三大组：缺血组1(n=15)，缺血时间1 h；缺血组2(n=15)，缺血时间3 h；对照组即假手术组(n=15)，未行MCA栓塞。用3%戊巴比妥钠35.40 mg/kg腹腔麻醉。大鼠取仰卧固定，行颈正中长约2 cm切口，暴露左颈外动脉(ECA)及枕动脉，在近颅底处分离颈内动脉(ICA)颅外段唯一分支——翼腭动脉，并将其起始部结扎，在ECA残端剪一小孔，将一长约20 mm的60尼龙线，其首端7 mm粘上硅橡胶成直径0.2 mm，经小孔插入ECA及ICA，再将尼龙线继续送入共约19 mm时，可遇轻微阻力，表明尼龙线头端已达大脑前动脉(ACA)近端壁，即将大脑中动脉(MCA)起始部阻塞。分别将三组大鼠采用磷酸缓冲液(含4%多聚甲醛)灌注固定，断头取脑，再用上述固定液固定3 h后加入7%乙醇过夜，次日经梯度乙醇脱水，石蜡包埋冠状切片[5]。用TTC(氯化三苯基四氮唑)染色法确定梗塞范围，经栓线阻断法阻断MCA 1 h后，断头取脑，放入2%TTC液中，37℃水溶15～30 min，可见MCA闭塞后所支配的皮质(额叶、颞叶、顶叶)为白色，其它部位皮质为红色。
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1.2 免疫组织化学染色
1.2.1 试剂 兔源性抗TGFβ1多克隆抗体，美国Santa公司产品；TGFβ1 SABC(链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物)试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司产品。
1.2.2 免疫组织化学染色 采用美国Zymed公司于1986年建立和报道的链霉素-抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法(SABC)。步骤如下：①多聚甲醛液灌注固定的石蜡包埋的大鼠脑组织切片5 μm厚，经常规脱蜡水化后浸入PBS(0.01 M,pH 7.4)缓冲液中冲洗(5 min×3，下同)；②将固定好的脑组织切片在新鲜配制的3%H2O2中浸泡(室温，10 min)以阻断内源性过氧化物酶；③滴加复合消化液(室温，10 min)；④加入正常山羊血清50 μl，以减少非特异性背景染色，室温下孵化10 min，随后吸去切片周围多余的液体；⑤加入一抗(兔抗TGFβ1的多克隆抗体)，室温下孵化60 min，0.01 M PBS冲洗；⑥加入生物素化标记的二抗(羊抗兔)，室温下孵化20 min，0.01 M PBS冲洗；⑦滴加SABC 50 μl，室温下孵化20 min，0.01 M PBS冲冼4次；⑧加入50 μl新鲜配制的DAB溶液，室温显色3～5 min，显微镜下观察显色反应，蒸馏水洗涤；⑨苏木素轻度复染，脱水，透明，中性树胶封片。
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每次实验均设阳性对照和空白对照。
阳性对照：使用胃癌组织作阳性对照(武汉博士德生物工程有限公司提供)，染色过程同上。
空白对照：组织来源同上，染色过程除用PBS取代一抗外，余步骤相同。
1.2.3 染色结果判断 阳性者可见棕黄色颗粒。阳性百分数采用计数估计的半定量判断标准，即每高倍视野(HPF)100个细胞中的阳性细胞数。设立分级标准如下：未见阳性细胞计(-)，1%～25%计(+)，大于25%计(
)。1.3 统计分析方法 TGFβ1免疫染色与部位的关系比较用秩和检验(H检验)；缺血中心及缺血半影区TGFβ1表达阳性率用四格表确切概率法检验。
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2 结果
2.1 TGFβ1免疫染色的细胞定位 胃癌组织细胞膜及部分细胞浆充满棕黄色颗粒，大鼠脑缺血中心及缺血半影区TGFβ1免疫染色主要位于神经经胞的胞浆。阳性细胞分布特点为缺血侧较缺血对侧及对照组密集，且着色较深、缺血时间不同、各部位阳性染色分布及强弱不同。
2.2 TGFβ1免疫染色结果
2.2.1 局灶性大鼠脑缺血1 h各部位TGFβ1染色的比较 缺血中心与缺血对侧有显著性差异(P<0.05)，缺血侧与对照组、缺血半影区与缺血对侧比较均有高度显著性差异(P<0.01)，见表1。
表1 局灶性大鼠脑缺血1 h各部位TGFβ1表达的比较(n) TGFβ1染色结果
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缺血中心
缺血半影区
缺血对侧
对照组
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Hc=37.82,P<0.005(两两比较用Nemenyi法)
2.2.2 局灶性大鼠脑缺血3 h各部位TGFβ1染色的比较 缺血中心与缺血半影区及对照组均有显著性差异(P<0.05)，缺血半影区与缺血对侧及对照组均有高度显著性差异(P<0.01)，见表2。
表2 局灶性大鼠脑缺血3 h各部位TGFβ1表达的比较(n)
TGFβ1染色结果
缺血中心
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缺血半影区
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Hc=42.77,P<0.005(两两比较用Nemenyi法)
2.2.3 局灶性大鼠脑缺血1 h、3 h各部位TGFβ1阳性染色率比较 缺血中心TGFβ1阳性染色率随缺血时间的延长而呈降低趋势(1 h,73.3% vs 3 h，60%)，相反，缺血半影区TGFβ1阳性染色率随缺血时间的延长而呈上升趋势(1 h,93.3% vs 3 h,100%)。
3 讨论
细胞因子参与调节脑缺血后神经细胞损伤与修复的研究，掀开了缺血性脑血管疾病因子机制研究的新领域。本实验运用免疫组织化学的方法对PMCAO大鼠脑组织TGFβ1活性蛋白的检测，可见缺血中心及缺血半影区TGFβ1表达较缺血对侧高；缺血1 h，大鼠脑组织缺血中心和缺血半影区TGFβ1阳性染色率分别为73.3%和93.3%，而缺血对侧的阳性率仅为13.3%，对照组无1例阳性。说明在脑缺血早期，TGFβ1在缺血中心及其周边区、半影区就有较多表达，与Klempt等[6]报道接近，但缺血中心与缺血半影区TGFβ1表达无显著性差异(P>0.05)，可能与脑缺血早期损伤因子如IL1～3、IL6、TNF等占主导地位有关。大多数实验证实IL1、IL6、TNF等细胞因子早期参与脑缺血的炎症反应，加重脑损害[7，8]。
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随着缺血时间的延长，即在缺血3 h组中，TGFβ1阳性表达仍然以缺血中心及缺血半影区为主，而缺血对侧及对照组很少。但是缺血半影区TGFβ1明显高于缺血中心(P<0.05)，说明缺血中心脑组织损害逐渐走向不可逆性损害；而缺血半影区TGFβ1继续增高，进一步说明TGFβ1可能参与缺血后神经细胞的抗损伤机制，延缓缺血周边区神经细胞的损害。据Saito等[9]报道，TGFβ1在中枢神经系统中充当一种化学信使，通过改变中枢神经系统神经元对兴奋性递质的反应，改变细胞外钙离子的注入与释放，选择性增强细胞内钙离子对N甲基D天冬氨酸(NMNA)的反应，阻碍细胞钙内流，延缓细胞的损害。脑缺血不同时间脑组织各相应部位的TGFβ1 阳性率比较均无显著性差异(P>0.05)，但各自的趋势反映：缺血中心呈下降趋势而缺血半影区则呈上升趋势，至缺血3 h，缺血半影区已与缺血中心存在显著性差异，从数字角度分析，这种差异与缺血中心的TGFβ1阳性染色的下降更有关联，推测TGFβ1在缺血半影区参与积极的抗损伤的作用。Unsicker K等[10]证实TGFβ1能增加BCL-2蛋白合成，二者为一协同调节信使，而BCL2基因及其蛋白在调控凋亡中发挥重要作用，对脑缺血损伤诱导的细胞凋亡、致使细胞迟发性损伤具有较确切抑制作用。这可能为TGFβ1间接参与抗细胞凋亡，减轻或延缓神经细胞损伤的机理。本研究结果显示，脑缺血3 h时缺血对侧TGFβ1的阳性表达与缺血1 h比较虽无统计学意义，但呈上升趋势，可能与局灶性脑缺血随时间的延长出现全脑的损害有关。综上所述，TGFβ1参与脑缺血抗损伤机理，TGFβ1蛋白可能对神经细胞起保护作用。
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参考文献
1 Yabuuchi K, Minamin M, Katsumata S, et al. Localization of type I interleukin 1 receptor mRNA in the rat brain. Mol Brain Res, 1994,27(1):26～27
2 Yamassaki Y, Itoyama Y, Kogurek. Involvement of cytokine production in pathogenesis of transient cerebrtal ischemic damage. Keio J Med， 1996,45(3):225～229
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收稿日期：1999-02-01, 百拇医药