肝细胞生长因子对大鼠急性胃粘膜损伤预防作用的研究
作者：倪金良 邓长生
单位：倪金良 扬州大学医学院附属医院消化内科 扬州 225001;邓长生 湖北医科大学附属第二医院消化内科 武汉 430071
关键词：肝细胞生长因子；急性胃粘膜损伤；预防；肝素；大鼠
医学新知杂志990404 摘要 为建立一种简便、快速诊断戊型肝炎病毒血清抗体的检测方法，以基因工程HEV ORF2区重组蛋白抗原和人工合成HEV ORF3区合成多肽抗原混合作为包被抗原，辣根过氧化物酶标记的单克隆抗人IgG抗体为第二抗体，建立了间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中HEV IgG抗体技术。检测中国药品生物制品检定所《检测抗HEV抗体国家参考品》全套血清盘：特异性参比品30份，全部为阴性；阳性参比品10份，全部为阳性；精密性参比品，CV(n=10)<15%。17例非甲、乙、丙肝炎患者，黄疸出现后4个月内，HEV IgG抗体检出率为100%。普通人群HEV IgG抗体检出率为1%～2%。表明该方法检测HEV IgG抗体，特异性强、敏感性高、操作简便快速，适用于临床对戊型肝炎的诊断和流行病学调查。
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Establishment of A Method to Detect
IgGantibody to Hepatitis E Virus
Peng Hanqin Ma Xiaowen Wu Suying et al
Shenzhen Moonbay Biotech Co., Ltd. Shenzhen 518054
Abstract In order to establish a rapid ELISA method for detection of antiHEV IgG antibody in human serum samples. An indirect ELISA assay was developed to detect anti-HEV IgG antibody in serum using recombinant HEV ORF2 protein and synthetic peptide of HEV ORF3 fragments as coating antigen, HRPmonoclonal antihuman IgG conjugate as secondary antibody. Testing results of the reference standard panel of the Institute of the Control of Pharmaceuticals and Biological Products specific reference 30 samples all is negative; positive reference 10 samples all is positive; Precision reference: CV value (n=10)<15% is completely in accordance with the standard results.17/17(100%)Patients with nonA＼B＼C hepatitis within four months of jaundice were tested to be HEV IgG antibody positive. Approximately 1%～2% of randomly ordinary specimen is positive. Conclusion:this method is sensitive,specific,rapid,and reproducible for detecting antiHEV lgG antibody and is useful in diagnosis of HEV infection and epidemiologic survey.
, 百拇医药
Key words Enzymelinked immunosorbent assay; Hepatitis E virus;IgG;Diagnosis
自1978年在克什米尔峡谷爆发一场大规模的非甲非乙型经肠道传播的肝炎以来，经不断研究，Balayan 证实了其病因是一种不同于甲、乙、丙型经粪口途径传播的病毒。1989年在东京的国际非甲非乙型肝炎病会议上命名为戊型肝炎病毒(HEV)[1]。对戊型肝炎的形态学及基因分子生物学到1990年初才有清楚的认识[2]。HEV属于杯状病毒，病毒颗粒呈球形，直径27～38 nm，平均32.2 nm，无囊膜，基因组为线状单股正链RNA，长约7.5 kb，由5’端非结构区和3’端结构区组成，含3个开放阅读框(ORF)，编码24002533个氨基酸，ORF2和ORF3产物与HEV特异性抗原表位有关[3]。我国自1986年新疆爆发戊肝以来，戊型肝炎呈散发流行状态。根据我国国情，中国药品生物制品检定所于1998年颁发了检测抗HEV抗体诊断试剂国家参考品，为此，我们建立了检测抗HEV IgG间接ELISA法，并制成了试剂，以满足临床检测的需求。
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1 材料和方法
1.1 标准品试剂 检测抗HEV抗体诊断试剂国家参考品(9701)，购自中国药品生物制品检定所。
1.2 血清 阳性血清对照选自经 Genelab 公司试剂检测为阳性的戊型肝炎患者血清。阴性对照为经Genelab公司试剂盒检测为阴性的健康人血清。实验用的检测血清，17份戊型肝炎患者(黄疸出现 4 个月以内)血清标本来自深圳市中医院和深圳进丰生物公司；普通人群随机标本由深圳蛇口联合医院提供；正常人血清采自健康献血员。
1.3 包被抗原 HEV ORF2基因重组表达产物，分子量为37 ku，纯度>95%；人工合成肽HEVORF3最后32个氨基酸，纯度>90%，由北京高达生物技术研究所提供。
1.4 酶标第二抗体 辣根过氧化物酶RZ>3.0，购自Sigma公司，抗人IgG单抗本公司自制；采用过碘酸钠-乙二醇法标记[4]。
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1.5 HEV IgG 抗体检测程序 用50 mmol/L pH9.0碳酸缓冲液稀释包被抗原(两种抗原按1∶1比例V/V混合)，包被酶标板(深圳立基)，0.1 ml/孔，4℃过夜，经含25%小牛血清的PBST(0.2 ml/孔)4℃封闭过夜后，甩干，(若不立即使用，干燥板、密封板备用)。按1∶20稀释血清标本，0.1 ml/孔加样，并设阴、阳性对照各2孔，37℃反应30 min；洗板，每孔加入酶结合物0.1 ml，37℃反应30 min；洗板后依次加TMB底物A液、B液各0.05 ml，37℃显色15 min，加终止液(2 M H2SO4)0.05 ml，测定OD450nm°结果判定：cutoff值为阴性对照OD值+0.2；标本OD值≥cutoff值者为阳性，反之为阴性。
2 结果
2.1 中国药品生物制品检定所《检测抗HEV抗体诊断试剂国家参考品》检测结果
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2.1.1 特异性 国家参考品血清盘中特异性参比品30份(确证为抗HEV IgG阴性，其中两份抗HCV阳性)，本试剂检测结果全部为阴性，无假阳性，达到国家部颁要求(标准：假阳性份数≤1)。
2.1.2 敏感性 国家参考品血清盘中阳性参比品10份(确证为抗HEV IgG阳性，包含强、中、弱阳性血清，含有HEV不同的抗体成份)，本试剂检测结果全部为阳性，敏感性达到并超过国家规定标准(标准：阳性检出率≥9/10)。
2.1.3 精密性 国家参考品血清盘中精密性参比品(抗HEV IgG阳性血清一支)，在本试剂中按规定测试10孔，CV值<15%，达到国家标准(标准：CV≤15%)。以上结果与中国药品生物制品检定所检定报告(97)量认(国)字(S0599)号结果相符。
2.2 与Genelab公司试剂对比实验
2.2.1 特异性 10份采自健康献血员的正常人血清，本试剂与Genelab试剂检测结果一致，全部为阴性。
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2.2.2 敏感性 17份非甲非乙非丙型肝炎(黄疸出现后4个月内)患者血清分别以1∶20、1∶40、1∶80稀释的各浓度测定HEV IgG抗体，其结果与Genelab试剂检测结果相符，全部为阳性，说明本法敏感性较好。
2.3 随机人群检出率 检测来自蛇口联合医院的普通人群体检新鲜血清标本480份，检出阳性标本9份，检出率为1.88%。
2.4 稳定性 将检测试剂(包被的反应板、对照血清、酶结合物及底物溶液等)置37℃3 d，与4℃放置的试剂用国家参考品进行对照检测，结果完全一致。
3 讨论
为了保证临床使用质量可靠的检测HEV IgG试剂，中国药品生物制品检定所于1998年颁布了《检测抗HEV抗体诊断试剂国家参考品》，这是我国第一代该类参比品，用于抗HEV IgG酶联免疫诊断试剂盒的质量控制。在间接ELISA中，包被抗原的选取、所包含的抗原组份、抗原的纯度都会影响检测结果的可靠性。我们根据有关文献[5～8]，选用相对保守并和特异抗原表位有关的ORF2区重组抗原和ORF3区的人工合成肽抗原作为包被抗原，经反复筛选，采用了北京高达生物技术研究所提供的这两种抗原，由于抗原纯度高，杂蛋白含量低，极大地减少了间接ELISA法易造成的非特异性，建立的检测HEV IgG间接ELISA试剂及方法，经国家参考品检测验证，参考品中特异性、阳性检出率、精密性三项指标完全符合国家规定的标准。在临床上使用，检验17份非甲、乙、丙型肝炎患者血清，黄疸出现后HEV抗体均为阳性，与患者临床症状及Genelab公司试剂检测结果完全一致。随机人群的检出率为1%～2%，与有关文献报道一致[9]。说明本方法及试剂既达到了国家标准，又和国外试剂水平相近，具有较好的特异性和敏感性。本试剂操作简便快速、结果准确、稳定性好，可用于临床检测HEV抗体及流行病学调查等。
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参考文献
1 李梦东.实用传染病学.北京：人民卫生出版社，1994.113～116
2 Reyes G R， Purdy M A, Kim J P,et al. Isolation of a cDNA from the virus responsible for enterically transmitted nonA, nonB hepatitis. Science, 1990, 247(2):1335～1337
3 Li T C,Yamakawa Y,Suzuki K, et al. Expression and selfassembly of empty viruslike particles of hepatitis E virus. J Virol,1997,71(10):7207～7213
4 Tijssen P, Kurstak E.Highly efficient and simple methods for the preparation of peroxidase and active peroxidaseantibody conjugates for enzyme immunoassay. Anal Biochem, 1984,136(1):451～457
, 百拇医药
5 Li F,Zhuang H, Kolivas S, et al. Persistent and transient antibody responses to hepatitis E virus detect by western immunoblot using open reading frame 2 and 3 and glutathione Stransferase fusion proteins. J Clin Microbiol,1994,32(9):2060～2066
6 Tsarev S A, Tsareva T S, Emerson S U, et al. ELISA for antibody to hepatitis E virus (HEV)based on complete openreading frame2 protein expressed in insect cells:identification of HEV infection in primates. J Infect Dis, 1993,168(2):369～378
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7 Purdy M A, Carson D, Mc Caustland K A, et al. Viral specificity of hepatitis E virus antigens identified by fluoresent antibody assay using recombinant HEV proteins. J Med Virol,1994, 44(2):212～214
8 Bradley D W. Hepatitis E virus:a brief review of the biology, molecular virology, and immunology of a novel virus. J Hepatol, 1995,22(1 suppl.):140～145
9 Dauson G J, Chau K H, Cabal C M, et al. Solidphase enzymelinked immunosorbent assay for hepatitis E virus IgG and IgM antibodies utilizing recombinant antigens and synthetic peptides, J Virol Methods,1992,38(1):175～186
收稿日期：1999-05-07, 百拇医药
单位：倪金良 扬州大学医学院附属医院消化内科 扬州 225001;邓长生 湖北医科大学附属第二医院消化内科 武汉 430071
关键词：肝细胞生长因子；急性胃粘膜损伤；预防；肝素；大鼠
医学新知杂志990404 摘要 为建立一种简便、快速诊断戊型肝炎病毒血清抗体的检测方法，以基因工程HEV ORF2区重组蛋白抗原和人工合成HEV ORF3区合成多肽抗原混合作为包被抗原，辣根过氧化物酶标记的单克隆抗人IgG抗体为第二抗体，建立了间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中HEV IgG抗体技术。检测中国药品生物制品检定所《检测抗HEV抗体国家参考品》全套血清盘：特异性参比品30份，全部为阴性；阳性参比品10份，全部为阳性；精密性参比品，CV(n=10)<15%。17例非甲、乙、丙肝炎患者，黄疸出现后4个月内，HEV IgG抗体检出率为100%。普通人群HEV IgG抗体检出率为1%～2%。表明该方法检测HEV IgG抗体，特异性强、敏感性高、操作简便快速，适用于临床对戊型肝炎的诊断和流行病学调查。
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Establishment of A Method to Detect
IgGantibody to Hepatitis E Virus
Peng Hanqin Ma Xiaowen Wu Suying et al
Shenzhen Moonbay Biotech Co., Ltd. Shenzhen 518054
Abstract In order to establish a rapid ELISA method for detection of antiHEV IgG antibody in human serum samples. An indirect ELISA assay was developed to detect anti-HEV IgG antibody in serum using recombinant HEV ORF2 protein and synthetic peptide of HEV ORF3 fragments as coating antigen, HRPmonoclonal antihuman IgG conjugate as secondary antibody. Testing results of the reference standard panel of the Institute of the Control of Pharmaceuticals and Biological Products specific reference 30 samples all is negative; positive reference 10 samples all is positive; Precision reference: CV value (n=10)<15% is completely in accordance with the standard results.17/17(100%)Patients with nonA＼B＼C hepatitis within four months of jaundice were tested to be HEV IgG antibody positive. Approximately 1%～2% of randomly ordinary specimen is positive. Conclusion:this method is sensitive,specific,rapid,and reproducible for detecting antiHEV lgG antibody and is useful in diagnosis of HEV infection and epidemiologic survey.
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Key words Enzymelinked immunosorbent assay; Hepatitis E virus;IgG;Diagnosis
自1978年在克什米尔峡谷爆发一场大规模的非甲非乙型经肠道传播的肝炎以来，经不断研究，Balayan 证实了其病因是一种不同于甲、乙、丙型经粪口途径传播的病毒。1989年在东京的国际非甲非乙型肝炎病会议上命名为戊型肝炎病毒(HEV)[1]。对戊型肝炎的形态学及基因分子生物学到1990年初才有清楚的认识[2]。HEV属于杯状病毒，病毒颗粒呈球形，直径27～38 nm，平均32.2 nm，无囊膜，基因组为线状单股正链RNA，长约7.5 kb，由5’端非结构区和3’端结构区组成，含3个开放阅读框(ORF)，编码24002533个氨基酸，ORF2和ORF3产物与HEV特异性抗原表位有关[3]。我国自1986年新疆爆发戊肝以来，戊型肝炎呈散发流行状态。根据我国国情，中国药品生物制品检定所于1998年颁发了检测抗HEV抗体诊断试剂国家参考品，为此，我们建立了检测抗HEV IgG间接ELISA法，并制成了试剂，以满足临床检测的需求。
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1 材料和方法
1.1 标准品试剂 检测抗HEV抗体诊断试剂国家参考品(9701)，购自中国药品生物制品检定所。
1.2 血清 阳性血清对照选自经 Genelab 公司试剂检测为阳性的戊型肝炎患者血清。阴性对照为经Genelab公司试剂盒检测为阴性的健康人血清。实验用的检测血清，17份戊型肝炎患者(黄疸出现 4 个月以内)血清标本来自深圳市中医院和深圳进丰生物公司；普通人群随机标本由深圳蛇口联合医院提供；正常人血清采自健康献血员。
1.3 包被抗原 HEV ORF2基因重组表达产物，分子量为37 ku，纯度>95%；人工合成肽HEVORF3最后32个氨基酸，纯度>90%，由北京高达生物技术研究所提供。
1.4 酶标第二抗体 辣根过氧化物酶RZ>3.0，购自Sigma公司，抗人IgG单抗本公司自制；采用过碘酸钠-乙二醇法标记[4]。
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1.5 HEV IgG 抗体检测程序 用50 mmol/L pH9.0碳酸缓冲液稀释包被抗原(两种抗原按1∶1比例V/V混合)，包被酶标板(深圳立基)，0.1 ml/孔，4℃过夜，经含25%小牛血清的PBST(0.2 ml/孔)4℃封闭过夜后，甩干，(若不立即使用，干燥板、密封板备用)。按1∶20稀释血清标本，0.1 ml/孔加样，并设阴、阳性对照各2孔，37℃反应30 min；洗板，每孔加入酶结合物0.1 ml，37℃反应30 min；洗板后依次加TMB底物A液、B液各0.05 ml，37℃显色15 min，加终止液(2 M H2SO4)0.05 ml，测定OD450nm°结果判定：cutoff值为阴性对照OD值+0.2；标本OD值≥cutoff值者为阳性，反之为阴性。
2 结果
2.1 中国药品生物制品检定所《检测抗HEV抗体诊断试剂国家参考品》检测结果
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2.1.1 特异性 国家参考品血清盘中特异性参比品30份(确证为抗HEV IgG阴性，其中两份抗HCV阳性)，本试剂检测结果全部为阴性，无假阳性，达到国家部颁要求(标准：假阳性份数≤1)。
2.1.2 敏感性 国家参考品血清盘中阳性参比品10份(确证为抗HEV IgG阳性，包含强、中、弱阳性血清，含有HEV不同的抗体成份)，本试剂检测结果全部为阳性，敏感性达到并超过国家规定标准(标准：阳性检出率≥9/10)。
2.1.3 精密性 国家参考品血清盘中精密性参比品(抗HEV IgG阳性血清一支)，在本试剂中按规定测试10孔，CV值<15%，达到国家标准(标准：CV≤15%)。以上结果与中国药品生物制品检定所检定报告(97)量认(国)字(S0599)号结果相符。
2.2 与Genelab公司试剂对比实验
2.2.1 特异性 10份采自健康献血员的正常人血清，本试剂与Genelab试剂检测结果一致，全部为阴性。
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2.2.2 敏感性 17份非甲非乙非丙型肝炎(黄疸出现后4个月内)患者血清分别以1∶20、1∶40、1∶80稀释的各浓度测定HEV IgG抗体，其结果与Genelab试剂检测结果相符，全部为阳性，说明本法敏感性较好。
2.3 随机人群检出率 检测来自蛇口联合医院的普通人群体检新鲜血清标本480份，检出阳性标本9份，检出率为1.88%。
2.4 稳定性 将检测试剂(包被的反应板、对照血清、酶结合物及底物溶液等)置37℃3 d，与4℃放置的试剂用国家参考品进行对照检测，结果完全一致。
3 讨论
为了保证临床使用质量可靠的检测HEV IgG试剂，中国药品生物制品检定所于1998年颁布了《检测抗HEV抗体诊断试剂国家参考品》，这是我国第一代该类参比品，用于抗HEV IgG酶联免疫诊断试剂盒的质量控制。在间接ELISA中，包被抗原的选取、所包含的抗原组份、抗原的纯度都会影响检测结果的可靠性。我们根据有关文献[5～8]，选用相对保守并和特异抗原表位有关的ORF2区重组抗原和ORF3区的人工合成肽抗原作为包被抗原，经反复筛选，采用了北京高达生物技术研究所提供的这两种抗原，由于抗原纯度高，杂蛋白含量低，极大地减少了间接ELISA法易造成的非特异性，建立的检测HEV IgG间接ELISA试剂及方法，经国家参考品检测验证，参考品中特异性、阳性检出率、精密性三项指标完全符合国家规定的标准。在临床上使用，检验17份非甲、乙、丙型肝炎患者血清，黄疸出现后HEV抗体均为阳性，与患者临床症状及Genelab公司试剂检测结果完全一致。随机人群的检出率为1%～2%，与有关文献报道一致[9]。说明本方法及试剂既达到了国家标准，又和国外试剂水平相近，具有较好的特异性和敏感性。本试剂操作简便快速、结果准确、稳定性好，可用于临床检测HEV抗体及流行病学调查等。
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参考文献
1 李梦东.实用传染病学.北京：人民卫生出版社，1994.113～116
2 Reyes G R， Purdy M A, Kim J P,et al. Isolation of a cDNA from the virus responsible for enterically transmitted nonA, nonB hepatitis. Science, 1990, 247(2):1335～1337
3 Li T C,Yamakawa Y,Suzuki K, et al. Expression and selfassembly of empty viruslike particles of hepatitis E virus. J Virol,1997,71(10):7207～7213
4 Tijssen P, Kurstak E.Highly efficient and simple methods for the preparation of peroxidase and active peroxidaseantibody conjugates for enzyme immunoassay. Anal Biochem, 1984,136(1):451～457
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5 Li F,Zhuang H, Kolivas S, et al. Persistent and transient antibody responses to hepatitis E virus detect by western immunoblot using open reading frame 2 and 3 and glutathione Stransferase fusion proteins. J Clin Microbiol,1994,32(9):2060～2066
6 Tsarev S A, Tsareva T S, Emerson S U, et al. ELISA for antibody to hepatitis E virus (HEV)based on complete openreading frame2 protein expressed in insect cells:identification of HEV infection in primates. J Infect Dis, 1993,168(2):369～378
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7 Purdy M A, Carson D, Mc Caustland K A, et al. Viral specificity of hepatitis E virus antigens identified by fluoresent antibody assay using recombinant HEV proteins. J Med Virol,1994, 44(2):212～214
8 Bradley D W. Hepatitis E virus:a brief review of the biology, molecular virology, and immunology of a novel virus. J Hepatol, 1995,22(1 suppl.):140～145
9 Dauson G J, Chau K H, Cabal C M, et al. Solidphase enzymelinked immunosorbent assay for hepatitis E virus IgG and IgM antibodies utilizing recombinant antigens and synthetic peptides, J Virol Methods,1992,38(1):175～186
收稿日期：1999-05-07, 百拇医药