慢性肝病患者基质分解素-1基因表达的研究
作者：王爱民 王宝恩 杨跃伟 张斌 张忠明 梁宝忠
单位：071000 保定，中国人民解放军第二五二医院实验中心(王爱民、杨跃 伟、张斌、张忠明、梁宝忠)，北京友谊医院肝病研究中心(王宝恩)
关键词：
中华医学杂志/990412 我们采用逆转录定量聚合酶链反应(PCR)方法研究了慢性肝炎、肝硬化患者基质分解素-1(Stromelysin-1，MMP3)基因表达的改变，现报道如下 。
一、对象与方法
1.研究对象：慢性肝炎12例，男9例，女3例，年龄(43±6)岁。肝硬变13例，男11例， 女2例，年龄(48±9)岁。肝穿取肝组织，部分留病理检查，余迅速投入液氮，组织学检 查证实为慢性活动性肝炎和肝硬变。正常对照8例，男3例，女5例，平均(46±7)岁，为胆囊切除患者。征得患者同意，术中取小块肝组织，部分送病理检查，余迅速投入液氮，组织学检查为正常肝组织。
, 百拇医药
2.试剂及仪器：总RNA提取试剂盒、AMV逆转录酶、RNA酶抑制剂、寡聚(dT)15引物、Taq酶 、PCR分子量标准、琼脂糖均为美国Promega公司产品。毛细管PCR仪为美国Idaho公司产品；凝胶成像系统：Kodak digital science system DC-40为美国Kodak公司产品。
3.RNA提取及cDNA合成：用Promega公司生产的总RNA提取试剂盒提取肝组织总RNA。采用10 μl逆转录反应体系；含待测RNA 100 ng，AMV15单位，RNA酶抑制剂20单位，寡聚(dT)15引物50 μg/ml及适量三磷酸脱氧核糖核酸(dNTP)(10 mmol/L)、5倍逆转录缓冲液，42℃反 应1小时；95℃5分钟灭活AMV逆转录酶。
4.共扩增-PCR及扩增产物定量分析：参照Noonan等[1]的方法进行。基质分解素 -1(MMP3)引物的设计参照Genebank资料及Lichtinghagen等[2]的设计；内参对照β-actin的引物设计参照Genebank资料。两对引物的序列如下：MMP3：5′Primer 5′ -TAT GGA TCC CCC CCT GAC TCC CCT GAG-3′；3′Primer 5′-ATG GAA TTC AGG TTC A AG CTT CCT GAG G-3′；β-actin：5′Primer5′-CGA GAA GAT GAC CCA GAT CA-3′ ；3′ Primer5′-GAT CTT CAT GAG GT A GTC AG-3′。
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PCR反应体系为20 μl，内含cDNA 2 μl，10×buffer 2 μl，4×dNTP(2 mmol/L)2 μl， MMP3、β-肌动蛋白引物(10 mmol/L)各2 μl，Taq酶1 U，用水补至20 μl。PCR反应在0.2 ml薄壁管中进行，用毛细管PCR仪扩增。PCR反应参数为：94℃预变性2分钟；94℃变性2 0秒，55℃退火20秒，72℃延伸30秒，30个循环；72℃后延伸7分钟。扩增产物在2%琼脂糖凝 胶上进行电泳，MMP3和β-actin的扩增产物分别为194 bp和234 bp。对扩增产物用凝胶 成像系统进行定量分析，用MMP3/β-actin的比值表示MMP3的相对表达水平。
5.统计学处理：结果以
±s表示，用单因素方差分析进行处理。
, 百拇医药 二、结果
正常对照可见MMP3的基因表达；慢性肝炎(1.43±0.40)、肝硬化(1.03±0.31)患者MM P3基因表达高于正常对照(0.67±0.18)(P值均<0.001)；慢性肝炎患者MMP3基 因表达水平较肝硬化患者为高(P<0.001)(图1)。
图1 1.为正常对照；2.为慢性肝炎；
3.为肝硬化；4.为PCR分子量标准
三、讨论
本实验对MMP3进行了研究，结果表明：慢性肝炎、肝硬化患者MMP3基因表达水平高 于正常对照；慢性肝炎患者MMP3的基因表达水平较肝硬化患者亦显著为高。
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MMP3基因表达的变化与慢性肝病发生、发展的关系目前尚不清楚。在肝纤维化的早期，MM P3降解Disse氏腔正常基底膜成分：Ⅳ型胶原、层连蛋白、蛋白多糖，影响肝细胞功能， 促使贮脂细胞向肌成纤维表型分化[3]，可能是促进肝纤维化发生的因素。在肝纤 维化的进展中，MMP3降解过多沉积的Ⅳ型胶原、层连蛋白、纤维连接蛋白等，可能是阻止 肝纤维化发展的因素。除对肝脏基质的直接作用外，MMP3尚可通过调节间质胶原酶(inter st itial collagenase, MMP1)的基因表达和酶原活化阻止肝纤维化的发展。研究表明MMP3 和MMP1的基因是紧密协同调节的；MMP3的一个重要性质在于它能激活MMP1，使部分活 化的MMP1完全活化或超活化[4]。
许多细胞因子、生长因子可调节MMP3的基因表达[5]，如白细胞介素1β、肿瘤 坏死因子α、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因 子β等。肝纤维化过程中上述因子是如何调节MMP3基因表达的，尚需进一步研究。
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参考文献
[1] Noonan KE, Beck C, Holzmayer TA, et al. Quantitative an alysis of MDR1 (multidrug resistance) gene expression in human tumors by polym erase chain reaction. Proc Natl Acad Sci USA, 1990,87：7160-7164.
[2] Lichtinghagen R, Helmbrecht T, Arndt B, et al. Expression Patte rn of matrix metalloproteinases in Human Liver. Eur J Clin Chem Clin Biochem, 19 95,33：65-71.
[3] Friedman ST, Roll FJ, Boyles J, et al. Maintenance of different iated phenotype of cultured rat hepatic lipocytes by basement membrane matrix. J Biol Chem, 1989,264：10756-10762.
, 百拇医药
[4] Suzuki K, Enghild JJ, Morodomi T. Mechanism of activation of ti ssue procollagenase by matrix metalloproteinase 3 (Stromelysin). Biochemistry, 1 990,29：10261-10270.
[5] Quinones S, Saus J, Otani Y, et al. Transcriptional regulation of human stromelysin. J Biol Chem, 1989,264：8339-8344.
(收稿：1998-06-23 修回：1999-01-04), http://www.100md.com
单位：071000 保定，中国人民解放军第二五二医院实验中心(王爱民、杨跃 伟、张斌、张忠明、梁宝忠)，北京友谊医院肝病研究中心(王宝恩)
关键词：
中华医学杂志/990412 我们采用逆转录定量聚合酶链反应(PCR)方法研究了慢性肝炎、肝硬化患者基质分解素-1(Stromelysin-1，MMP3)基因表达的改变，现报道如下 。
一、对象与方法
1.研究对象：慢性肝炎12例，男9例，女3例，年龄(43±6)岁。肝硬变13例，男11例， 女2例，年龄(48±9)岁。肝穿取肝组织，部分留病理检查，余迅速投入液氮，组织学检 查证实为慢性活动性肝炎和肝硬变。正常对照8例，男3例，女5例，平均(46±7)岁，为胆囊切除患者。征得患者同意，术中取小块肝组织，部分送病理检查，余迅速投入液氮，组织学检查为正常肝组织。
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2.试剂及仪器：总RNA提取试剂盒、AMV逆转录酶、RNA酶抑制剂、寡聚(dT)15引物、Taq酶 、PCR分子量标准、琼脂糖均为美国Promega公司产品。毛细管PCR仪为美国Idaho公司产品；凝胶成像系统：Kodak digital science system DC-40为美国Kodak公司产品。
3.RNA提取及cDNA合成：用Promega公司生产的总RNA提取试剂盒提取肝组织总RNA。采用10 μl逆转录反应体系；含待测RNA 100 ng，AMV15单位，RNA酶抑制剂20单位，寡聚(dT)15引物50 μg/ml及适量三磷酸脱氧核糖核酸(dNTP)(10 mmol/L)、5倍逆转录缓冲液，42℃反 应1小时；95℃5分钟灭活AMV逆转录酶。
4.共扩增-PCR及扩增产物定量分析：参照Noonan等[1]的方法进行。基质分解素 -1(MMP3)引物的设计参照Genebank资料及Lichtinghagen等[2]的设计；内参对照β-actin的引物设计参照Genebank资料。两对引物的序列如下：MMP3：5′Primer 5′ -TAT GGA TCC CCC CCT GAC TCC CCT GAG-3′；3′Primer 5′-ATG GAA TTC AGG TTC A AG CTT CCT GAG G-3′；β-actin：5′Primer5′-CGA GAA GAT GAC CCA GAT CA-3′ ；3′ Primer5′-GAT CTT CAT GAG GT A GTC AG-3′。
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PCR反应体系为20 μl，内含cDNA 2 μl，10×buffer 2 μl，4×dNTP(2 mmol/L)2 μl， MMP3、β-肌动蛋白引物(10 mmol/L)各2 μl，Taq酶1 U，用水补至20 μl。PCR反应在0.2 ml薄壁管中进行，用毛细管PCR仪扩增。PCR反应参数为：94℃预变性2分钟；94℃变性2 0秒，55℃退火20秒，72℃延伸30秒，30个循环；72℃后延伸7分钟。扩增产物在2%琼脂糖凝 胶上进行电泳，MMP3和β-actin的扩增产物分别为194 bp和234 bp。对扩增产物用凝胶 成像系统进行定量分析，用MMP3/β-actin的比值表示MMP3的相对表达水平。
5.统计学处理：结果以
±s表示，用单因素方差分析进行处理。, 百拇医药 二、结果
正常对照可见MMP3的基因表达；慢性肝炎(1.43±0.40)、肝硬化(1.03±0.31)患者MM P3基因表达高于正常对照(0.67±0.18)(P值均<0.001)；慢性肝炎患者MMP3基 因表达水平较肝硬化患者为高(P<0.001)(图1)。
图1 1.为正常对照；2.为慢性肝炎；
3.为肝硬化；4.为PCR分子量标准
三、讨论
本实验对MMP3进行了研究，结果表明：慢性肝炎、肝硬化患者MMP3基因表达水平高 于正常对照；慢性肝炎患者MMP3的基因表达水平较肝硬化患者亦显著为高。
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MMP3基因表达的变化与慢性肝病发生、发展的关系目前尚不清楚。在肝纤维化的早期，MM P3降解Disse氏腔正常基底膜成分：Ⅳ型胶原、层连蛋白、蛋白多糖，影响肝细胞功能， 促使贮脂细胞向肌成纤维表型分化[3]，可能是促进肝纤维化发生的因素。在肝纤 维化的进展中，MMP3降解过多沉积的Ⅳ型胶原、层连蛋白、纤维连接蛋白等，可能是阻止 肝纤维化发展的因素。除对肝脏基质的直接作用外，MMP3尚可通过调节间质胶原酶(inter st itial collagenase, MMP1)的基因表达和酶原活化阻止肝纤维化的发展。研究表明MMP3 和MMP1的基因是紧密协同调节的；MMP3的一个重要性质在于它能激活MMP1，使部分活 化的MMP1完全活化或超活化[4]。
许多细胞因子、生长因子可调节MMP3的基因表达[5]，如白细胞介素1β、肿瘤 坏死因子α、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因 子β等。肝纤维化过程中上述因子是如何调节MMP3基因表达的，尚需进一步研究。
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参考文献
[1] Noonan KE, Beck C, Holzmayer TA, et al. Quantitative an alysis of MDR1 (multidrug resistance) gene expression in human tumors by polym erase chain reaction. Proc Natl Acad Sci USA, 1990,87：7160-7164.
[2] Lichtinghagen R, Helmbrecht T, Arndt B, et al. Expression Patte rn of matrix metalloproteinases in Human Liver. Eur J Clin Chem Clin Biochem, 19 95,33：65-71.
[3] Friedman ST, Roll FJ, Boyles J, et al. Maintenance of different iated phenotype of cultured rat hepatic lipocytes by basement membrane matrix. J Biol Chem, 1989,264：10756-10762.
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[4] Suzuki K, Enghild JJ, Morodomi T. Mechanism of activation of ti ssue procollagenase by matrix metalloproteinase 3 (Stromelysin). Biochemistry, 1 990,29：10261-10270.
[5] Quinones S, Saus J, Otani Y, et al. Transcriptional regulation of human stromelysin. J Biol Chem, 1989,264：8339-8344.
(收稿：1998-06-23 修回：1999-01-04), http://www.100md.com