三氧化二砷对K562细胞细胞周期的影响及其机制的研究
作者:肖冬梅 孙关林 苏卉 邬维礼 陈国强 陈竺 王振义
单位:200025 上海第二医科大学附属瑞金医院上海血液学研究所
关键词:
中华医学杂志/990428 最近,有关三氧化二砷(As2O3)有效治疗急性早幼粒细胞白血病,且无严重毒副作用及骨髓抑制的报道[1,2],再度引起人们对As2O3治疗白血病甚至其他恶性肿瘤的浓厚兴趣。为阐明As2O3治疗慢性髓细胞白血病的机制,并为其临床应用提供理论依据,我们以K562细胞为模型,研究了As2O3对K562细胞的作用及其作用机制。
一、材料与方法
, http://www.100md.com
1.细胞培养及其细胞增殖测定:取指数生长期的K562细胞分别以2×105/ml细胞浓度接种于含或不含As2O3(哈尔滨医科大学附属第一医院提供)的新鲜RPMI 1640培养液(含10%小牛血清)中,于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中进行培养。每日作细胞计数。按每日细胞计数的变化绘制细胞增殖曲线。
2.细胞周期分析:K562细胞在细胞分裂阻滞实验后经流式细胞仪(FACS)分析。K562细胞购自中国科学院细胞生物研究所细胞库。具体操作如下:细胞经1 μmol/L As2O3孵育84小时后,准确调整细胞浓度,按2×105/ml细胞在含或不含0.1μg/ml秋水仙胺(GIBCO-BRL)的RPMI 1640 培养液中进一步培养4、8、12、16小时,收集各时相细胞,进行FACS分析。细胞周期时间按直线相关方程计算。细胞被完全阻滞在G2/M期所需的时间为一个细胞周期时间。
, 百拇医药
3.Western印迹法:收集细胞按2×107/ml裂解细胞后,在质量分数为7.5%或10%的凝胶中进行SDS-PAGE电泳,转膜,封闭后,加一抗(Santa Cruz产品),二抗(Amersham产品),最后ECL试剂盒显色。观察对细胞G1/S期转换调控蛋白c-myc、Rb、CDK4、cyclinD1及p16的表达。
二、结果
1.As2O3通过延长细胞周期而抑制K562细胞生长:在1μmol/L As2O3作用下,K562细胞生长受到明显抑制(图1),但其细胞周期各时相细胞的分布未见异常(表1)。细胞周期有丝分裂阻滞实验显示,K562细胞经1 μmol/L As2O3处理84小时后,其G2/M期细胞的累积明显慢于未经As2O3处理的细胞;两组细胞倍增时间分别为112小时和30小时,差异具有统计学意义。
, http://www.100md.com
图1 As2O3(1μmol/L)对K562细胞生长的影响
表1 As2O3对K562细胞周期各时相细胞分布的影响(×105/ml) 组别
1天
3天
5天
G1
S
G2/M
G1
S
, 百拇医药
G2/M
G1
S
G2/M
对照组
33.4
44.2
22.4
29.7
49.1
21.2
46.0
, http://www.100md.com
43.6
10.4
AS2O3组
24.6
62.4
13.0
23.6
57.8
18.7
30.6
51.5
17.9
, http://www.100md.com 2.As2O3对细胞周期G1/S期转换调控蛋白表达及其磷酸化的影响:发现K562细胞不表达p16蛋白:As2O3对c-myc、Rb、CDK4、cyclin D1及p16蛋白的表达均无明显影响(图2);但Rb蛋白磷酸化水平在As2O3作用下均发生改变,随着时间的延长,其磷酸化程度逐渐降低(图2)。
图2 上图:As2O3对细胞周期G1/S期转换调控蛋白
表达的影响.下图:As2O3对Rb蛋白的表达及其磷酸化的影响
三、讨论
, 百拇医药
K562细胞是一种建株于慢性髓细胞白血病急性变患者骨髓细胞的细胞株,具有Ph染色体和bcr/abl融合基因特征性标志,常用于体外研究。
细胞周期存在G1/S期及G2/M期转换两个限制点(checkpoint),其中G1/S期的转换决定细胞周期时间[3]。细胞周期素(cyclin)D1及其依赖性激酶CDK4、CDK抑制蛋白p16、Rb等在调控G1/S期的转换中起重要作用。CDK4通过与cyclin D1结合而被激活,从而使Rb蛋白发生磷酸化。Rb的磷酸化使被其抑制的E2F等转录因子释放,G1/S期转换促进因子表达增加,从而使细胞周期通过G1/S期限制点进入S期;此外,Rb的磷酸化还使与之结合的c-ABL蛋白解离,恢复其受抑的蛋白酪氨酸激酶(PTK)活性。后者调节G1/S期转换调节因子的表达,促进细胞周期进入S期[3,4]。本研究表明As2O3可抑制Rb蛋白磷酸化。因此,Rb与E2F等转录因子及c-ABL蛋白的结合可能被加强,从而抑制细胞G1/S期的转换,使细胞周期延长;同时,Rb磷酸化的减少,也可能使Rb与BCR/ABL蛋白的结合增多,而抑制BCR/ABL蛋白的PTK活性,这进一步证实了我们以前的研究结果[5]。As2O3可能通过抑制BCR/ABL蛋白的PTK活性,从而干扰BCR/ABL蛋白致癌信号的传导,抑制K562细胞生长。
, 百拇医药
本课题为国家九五科技攻关项目基金(969060117)、国家自然科学基金(39870773、39610329)、国家杰出青年科学基金(39725011)和胡应洲基金资助项目
参考文献
[1] 张鹏,王树叶,胡龙虎,等.三氧化二砷注射液治疗72例急性早幼粒细胞白血病.中华血液学杂志,1996,17:58-61.
[2] Shen ZX, Chen GQ, Ni JH, et al. Use of arsenic trioxide (As2O3) in the treatment of acute promyelocytic leukemia (APL): Ⅱ. Clinical efficacy and pharmacokinetics in relapsed patients. Blood, 1997, 89:3354-3360.
, 百拇医药
[3] Ragione FD, Borriello A, Giordani L, et al. Cell division cycle alterations in human malignancies. Cancer, J 1997, 10:151-156.
[4] Welch PJ, Wang JYJ. A c-terminal protein-binding domain in the retinoblastoma protein regulates nuclear c-Abl tyrosine kinase in the cell cycle. Cell, 1993, 75:779-790.
[5] 肖冬梅,孙关林,邬维礼,等.As2O3诱导K562细胞凋亡过程中酪酸蛋白激酶活性的变化.中华血液学杂志,1998,19:234-237.
(收稿:1998-06-29 修回:1998-11-26), 百拇医药
单位:200025 上海第二医科大学附属瑞金医院上海血液学研究所
关键词:
中华医学杂志/990428 最近,有关三氧化二砷(As2O3)有效治疗急性早幼粒细胞白血病,且无严重毒副作用及骨髓抑制的报道[1,2],再度引起人们对As2O3治疗白血病甚至其他恶性肿瘤的浓厚兴趣。为阐明As2O3治疗慢性髓细胞白血病的机制,并为其临床应用提供理论依据,我们以K562细胞为模型,研究了As2O3对K562细胞的作用及其作用机制。
一、材料与方法
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1.细胞培养及其细胞增殖测定:取指数生长期的K562细胞分别以2×105/ml细胞浓度接种于含或不含As2O3(哈尔滨医科大学附属第一医院提供)的新鲜RPMI 1640培养液(含10%小牛血清)中,于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中进行培养。每日作细胞计数。按每日细胞计数的变化绘制细胞增殖曲线。
2.细胞周期分析:K562细胞在细胞分裂阻滞实验后经流式细胞仪(FACS)分析。K562细胞购自中国科学院细胞生物研究所细胞库。具体操作如下:细胞经1 μmol/L As2O3孵育84小时后,准确调整细胞浓度,按2×105/ml细胞在含或不含0.1μg/ml秋水仙胺(GIBCO-BRL)的RPMI 1640 培养液中进一步培养4、8、12、16小时,收集各时相细胞,进行FACS分析。细胞周期时间按直线相关方程计算。细胞被完全阻滞在G2/M期所需的时间为一个细胞周期时间。
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3.Western印迹法:收集细胞按2×107/ml裂解细胞后,在质量分数为7.5%或10%的凝胶中进行SDS-PAGE电泳,转膜,封闭后,加一抗(Santa Cruz产品),二抗(Amersham产品),最后ECL试剂盒显色。观察对细胞G1/S期转换调控蛋白c-myc、Rb、CDK4、cyclinD1及p16的表达。
二、结果
1.As2O3通过延长细胞周期而抑制K562细胞生长:在1μmol/L As2O3作用下,K562细胞生长受到明显抑制(图1),但其细胞周期各时相细胞的分布未见异常(表1)。细胞周期有丝分裂阻滞实验显示,K562细胞经1 μmol/L As2O3处理84小时后,其G2/M期细胞的累积明显慢于未经As2O3处理的细胞;两组细胞倍增时间分别为112小时和30小时,差异具有统计学意义。
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图1 As2O3(1μmol/L)对K562细胞生长的影响
表1 As2O3对K562细胞周期各时相细胞分布的影响(×105/ml) 组别
1天
3天
5天
G1
S
G2/M
G1
S
, 百拇医药
G2/M
G1
S
G2/M
对照组
33.4
44.2
22.4
29.7
49.1
21.2
46.0
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43.6
10.4
AS2O3组
24.6
62.4
13.0
23.6
57.8
18.7
30.6
51.5
17.9
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图2 上图:As2O3对细胞周期G1/S期转换调控蛋白
表达的影响.下图:As2O3对Rb蛋白的表达及其磷酸化的影响
三、讨论
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K562细胞是一种建株于慢性髓细胞白血病急性变患者骨髓细胞的细胞株,具有Ph染色体和bcr/abl融合基因特征性标志,常用于体外研究。
细胞周期存在G1/S期及G2/M期转换两个限制点(checkpoint),其中G1/S期的转换决定细胞周期时间[3]。细胞周期素(cyclin)D1及其依赖性激酶CDK4、CDK抑制蛋白p16、Rb等在调控G1/S期的转换中起重要作用。CDK4通过与cyclin D1结合而被激活,从而使Rb蛋白发生磷酸化。Rb的磷酸化使被其抑制的E2F等转录因子释放,G1/S期转换促进因子表达增加,从而使细胞周期通过G1/S期限制点进入S期;此外,Rb的磷酸化还使与之结合的c-ABL蛋白解离,恢复其受抑的蛋白酪氨酸激酶(PTK)活性。后者调节G1/S期转换调节因子的表达,促进细胞周期进入S期[3,4]。本研究表明As2O3可抑制Rb蛋白磷酸化。因此,Rb与E2F等转录因子及c-ABL蛋白的结合可能被加强,从而抑制细胞G1/S期的转换,使细胞周期延长;同时,Rb磷酸化的减少,也可能使Rb与BCR/ABL蛋白的结合增多,而抑制BCR/ABL蛋白的PTK活性,这进一步证实了我们以前的研究结果[5]。As2O3可能通过抑制BCR/ABL蛋白的PTK活性,从而干扰BCR/ABL蛋白致癌信号的传导,抑制K562细胞生长。
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本课题为国家九五科技攻关项目基金(969060117)、国家自然科学基金(39870773、39610329)、国家杰出青年科学基金(39725011)和胡应洲基金资助项目
参考文献
[1] 张鹏,王树叶,胡龙虎,等.三氧化二砷注射液治疗72例急性早幼粒细胞白血病.中华血液学杂志,1996,17:58-61.
[2] Shen ZX, Chen GQ, Ni JH, et al. Use of arsenic trioxide (As2O3) in the treatment of acute promyelocytic leukemia (APL): Ⅱ. Clinical efficacy and pharmacokinetics in relapsed patients. Blood, 1997, 89:3354-3360.
, 百拇医药
[3] Ragione FD, Borriello A, Giordani L, et al. Cell division cycle alterations in human malignancies. Cancer, J 1997, 10:151-156.
[4] Welch PJ, Wang JYJ. A c-terminal protein-binding domain in the retinoblastoma protein regulates nuclear c-Abl tyrosine kinase in the cell cycle. Cell, 1993, 75:779-790.
[5] 肖冬梅,孙关林,邬维礼,等.As2O3诱导K562细胞凋亡过程中酪酸蛋白激酶活性的变化.中华血液学杂志,1998,19:234-237.
(收稿:1998-06-29 修回:1998-11-26), 百拇医药