三氧化二砷对K562细胞细胞周期的影响及其机制的研究
作者：肖冬梅 孙关林 苏卉 邬维礼 陈国强 陈竺 王振义
单位：200025 上海第二医科大学附属瑞金医院上海血液学研究所
关键词：
中华医学杂志/990428 最近，有关三氧化二砷(As2O3)有效治疗急性早幼粒细胞白血病，且无严重毒副作用及骨髓抑制的报道[1，2]，再度引起人们对As2O3治疗白血病甚至其他恶性肿瘤的浓厚兴趣。为阐明As2O3治疗慢性髓细胞白血病的机制，并为其临床应用提供理论依据，我们以K562细胞为模型，研究了As2O3对K562细胞的作用及其作用机制。
一、材料与方法
, http://www.100md.com
1.细胞培养及其细胞增殖测定：取指数生长期的K562细胞分别以2×105/ml细胞浓度接种于含或不含As2O3(哈尔滨医科大学附属第一医院提供)的新鲜RPMI 1640培养液(含10%小牛血清)中，于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中进行培养。每日作细胞计数。按每日细胞计数的变化绘制细胞增殖曲线。
2.细胞周期分析：K562细胞在细胞分裂阻滞实验后经流式细胞仪(FACS)分析。K562细胞购自中国科学院细胞生物研究所细胞库。具体操作如下：细胞经1 μmol/L As2O3孵育84小时后，准确调整细胞浓度，按2×105/ml细胞在含或不含0.1μg/ml秋水仙胺(GIBCO-BRL)的RPMI 1640 培养液中进一步培养4、8、12、16小时，收集各时相细胞，进行FACS分析。细胞周期时间按直线相关方程计算。细胞被完全阻滞在G2/M期所需的时间为一个细胞周期时间。
, 百拇医药
3.Western印迹法：收集细胞按2×107/ml裂解细胞后，在质量分数为7.5%或10%的凝胶中进行SDS-PAGE电泳，转膜，封闭后，加一抗(Santa Cruz产品)，二抗(Amersham产品)，最后ECL试剂盒显色。观察对细胞G1/S期转换调控蛋白c-myc、Rb、CDK4、cyclinD1及p16的表达。
二、结果
1.As2O3通过延长细胞周期而抑制K562细胞生长：在1μmol/L As2O3作用下，K562细胞生长受到明显抑制(图1)，但其细胞周期各时相细胞的分布未见异常(表1)。细胞周期有丝分裂阻滞实验显示，K562细胞经1 μmol/L As2O3处理84小时后，其G2/M期细胞的累积明显慢于未经As2O3处理的细胞；两组细胞倍增时间分别为112小时和30小时，差异具有统计学意义。
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图1 As2O3(1μmol/L)对K562细胞生长的影响
表1 As2O3对K562细胞周期各时相细胞分布的影响(×105/ml) 组别
1天
3天
5天
G1
S
G2/M
G1
S
, 百拇医药
G2/M
G1
S
G2/M
对照组
33.4
44.2
22.4
29.7
49.1
21.2
46.0
, http://www.100md.com
43.6
10.4
AS2O3组
24.6
62.4
13.0
23.6
57.8
18.7
30.6
51.5
17.9
, http://www.100md.com 2.As2O3对细胞周期G1/S期转换调控蛋白表达及其磷酸化的影响：发现K562细胞不表达p16蛋白：As2O3对c-myc、Rb、CDK4、cyclin D1及p16蛋白的表达均无明显影响(图2)；但Rb蛋白磷酸化水平在As2O3作用下均发生改变，随着时间的延长，其磷酸化程度逐渐降低(图2)。
图2 上图：As2O3对细胞周期G1/S期转换调控蛋白
表达的影响.下图：As2O3对Rb蛋白的表达及其磷酸化的影响
三、讨论
, 百拇医药
K562细胞是一种建株于慢性髓细胞白血病急性变患者骨髓细胞的细胞株，具有Ph染色体和bcr/abl融合基因特征性标志，常用于体外研究。
细胞周期存在G1/S期及G2/M期转换两个限制点(checkpoint)，其中G1/S期的转换决定细胞周期时间[3]。细胞周期素(cyclin)D1及其依赖性激酶CDK4、CDK抑制蛋白p16、Rb等在调控G1/S期的转换中起重要作用。CDK4通过与cyclin D1结合而被激活，从而使Rb蛋白发生磷酸化。Rb的磷酸化使被其抑制的E2F等转录因子释放，G1/S期转换促进因子表达增加，从而使细胞周期通过G1/S期限制点进入S期；此外，Rb的磷酸化还使与之结合的c-ABL蛋白解离，恢复其受抑的蛋白酪氨酸激酶(PTK)活性。后者调节G1/S期转换调节因子的表达，促进细胞周期进入S期[3，4]。本研究表明As2O3可抑制Rb蛋白磷酸化。因此，Rb与E2F等转录因子及c-ABL蛋白的结合可能被加强，从而抑制细胞G1/S期的转换，使细胞周期延长；同时，Rb磷酸化的减少，也可能使Rb与BCR/ABL蛋白的结合增多，而抑制BCR/ABL蛋白的PTK活性，这进一步证实了我们以前的研究结果[5]。As2O3可能通过抑制BCR/ABL蛋白的PTK活性，从而干扰BCR/ABL蛋白致癌信号的传导，抑制K562细胞生长。
, 百拇医药
本课题为国家九五科技攻关项目基金(969060117)、国家自然科学基金(39870773、39610329)、国家杰出青年科学基金(39725011)和胡应洲基金资助项目
参考文献
[1] 张鹏，王树叶，胡龙虎，等.三氧化二砷注射液治疗72例急性早幼粒细胞白血病.中华血液学杂志，1996，17：58-61.
[2] Shen ZX, Chen GQ, Ni JH, et al. Use of arsenic trioxide (As2O3) in the treatment of acute promyelocytic leukemia (APL)： Ⅱ. Clinical efficacy and pharmacokinetics in relapsed patients. Blood, 1997, 89:3354-3360.
, 百拇医药
[3] Ragione FD, Borriello A, Giordani L, et al. Cell division cycle alterations in human malignancies. Cancer, J 1997, 10:151-156.
[4] Welch PJ, Wang JYJ. A c-terminal protein-binding domain in the retinoblastoma protein regulates nuclear c-Abl tyrosine kinase in the cell cycle. Cell, 1993, 75:779-790.
[5] 肖冬梅，孙关林，邬维礼，等.As2O3诱导K562细胞凋亡过程中酪酸蛋白激酶活性的变化.中华血液学杂志，1998，19：234-237.
(收稿：1998-06-29 修回：1998-11-26), 百拇医药
单位：200025 上海第二医科大学附属瑞金医院上海血液学研究所
关键词：
中华医学杂志/990428 最近，有关三氧化二砷(As2O3)有效治疗急性早幼粒细胞白血病，且无严重毒副作用及骨髓抑制的报道[1，2]，再度引起人们对As2O3治疗白血病甚至其他恶性肿瘤的浓厚兴趣。为阐明As2O3治疗慢性髓细胞白血病的机制，并为其临床应用提供理论依据，我们以K562细胞为模型，研究了As2O3对K562细胞的作用及其作用机制。
一、材料与方法
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1.细胞培养及其细胞增殖测定：取指数生长期的K562细胞分别以2×105/ml细胞浓度接种于含或不含As2O3(哈尔滨医科大学附属第一医院提供)的新鲜RPMI 1640培养液(含10%小牛血清)中，于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中进行培养。每日作细胞计数。按每日细胞计数的变化绘制细胞增殖曲线。
2.细胞周期分析：K562细胞在细胞分裂阻滞实验后经流式细胞仪(FACS)分析。K562细胞购自中国科学院细胞生物研究所细胞库。具体操作如下：细胞经1 μmol/L As2O3孵育84小时后，准确调整细胞浓度，按2×105/ml细胞在含或不含0.1μg/ml秋水仙胺(GIBCO-BRL)的RPMI 1640 培养液中进一步培养4、8、12、16小时，收集各时相细胞，进行FACS分析。细胞周期时间按直线相关方程计算。细胞被完全阻滞在G2/M期所需的时间为一个细胞周期时间。
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3.Western印迹法：收集细胞按2×107/ml裂解细胞后，在质量分数为7.5%或10%的凝胶中进行SDS-PAGE电泳，转膜，封闭后，加一抗(Santa Cruz产品)，二抗(Amersham产品)，最后ECL试剂盒显色。观察对细胞G1/S期转换调控蛋白c-myc、Rb、CDK4、cyclinD1及p16的表达。
二、结果
1.As2O3通过延长细胞周期而抑制K562细胞生长：在1μmol/L As2O3作用下，K562细胞生长受到明显抑制(图1)，但其细胞周期各时相细胞的分布未见异常(表1)。细胞周期有丝分裂阻滞实验显示，K562细胞经1 μmol/L As2O3处理84小时后，其G2/M期细胞的累积明显慢于未经As2O3处理的细胞；两组细胞倍增时间分别为112小时和30小时，差异具有统计学意义。
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图1 As2O3(1μmol/L)对K562细胞生长的影响
表1 As2O3对K562细胞周期各时相细胞分布的影响(×105/ml) 组别
1天
3天
5天
G1
S
G2/M
G1
S
, 百拇医药
G2/M
G1
S
G2/M
对照组
33.4
44.2
22.4
29.7
49.1
21.2
46.0
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43.6
10.4
AS2O3组
24.6
62.4
13.0
23.6
57.8
18.7
30.6
51.5
17.9
, http://www.100md.com 2.As2O3对细胞周期G1/S期转换调控蛋白表达及其磷酸化的影响：发现K562细胞不表达p16蛋白：As2O3对c-myc、Rb、CDK4、cyclin D1及p16蛋白的表达均无明显影响(图2)；但Rb蛋白磷酸化水平在As2O3作用下均发生改变，随着时间的延长，其磷酸化程度逐渐降低(图2)。
图2 上图：As2O3对细胞周期G1/S期转换调控蛋白
表达的影响.下图：As2O3对Rb蛋白的表达及其磷酸化的影响
三、讨论
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K562细胞是一种建株于慢性髓细胞白血病急性变患者骨髓细胞的细胞株，具有Ph染色体和bcr/abl融合基因特征性标志，常用于体外研究。
细胞周期存在G1/S期及G2/M期转换两个限制点(checkpoint)，其中G1/S期的转换决定细胞周期时间[3]。细胞周期素(cyclin)D1及其依赖性激酶CDK4、CDK抑制蛋白p16、Rb等在调控G1/S期的转换中起重要作用。CDK4通过与cyclin D1结合而被激活，从而使Rb蛋白发生磷酸化。Rb的磷酸化使被其抑制的E2F等转录因子释放，G1/S期转换促进因子表达增加，从而使细胞周期通过G1/S期限制点进入S期；此外，Rb的磷酸化还使与之结合的c-ABL蛋白解离，恢复其受抑的蛋白酪氨酸激酶(PTK)活性。后者调节G1/S期转换调节因子的表达，促进细胞周期进入S期[3，4]。本研究表明As2O3可抑制Rb蛋白磷酸化。因此，Rb与E2F等转录因子及c-ABL蛋白的结合可能被加强，从而抑制细胞G1/S期的转换，使细胞周期延长；同时，Rb磷酸化的减少，也可能使Rb与BCR/ABL蛋白的结合增多，而抑制BCR/ABL蛋白的PTK活性，这进一步证实了我们以前的研究结果[5]。As2O3可能通过抑制BCR/ABL蛋白的PTK活性，从而干扰BCR/ABL蛋白致癌信号的传导，抑制K562细胞生长。
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本课题为国家九五科技攻关项目基金(969060117)、国家自然科学基金(39870773、39610329)、国家杰出青年科学基金(39725011)和胡应洲基金资助项目
参考文献
[1] 张鹏，王树叶，胡龙虎，等.三氧化二砷注射液治疗72例急性早幼粒细胞白血病.中华血液学杂志，1996，17：58-61.
[2] Shen ZX, Chen GQ, Ni JH, et al. Use of arsenic trioxide (As2O3) in the treatment of acute promyelocytic leukemia (APL)： Ⅱ. Clinical efficacy and pharmacokinetics in relapsed patients. Blood, 1997, 89:3354-3360.
, 百拇医药
[3] Ragione FD, Borriello A, Giordani L, et al. Cell division cycle alterations in human malignancies. Cancer, J 1997, 10:151-156.
[4] Welch PJ, Wang JYJ. A c-terminal protein-binding domain in the retinoblastoma protein regulates nuclear c-Abl tyrosine kinase in the cell cycle. Cell, 1993, 75:779-790.
[5] 肖冬梅，孙关林，邬维礼，等.As2O3诱导K562细胞凋亡过程中酪酸蛋白激酶活性的变化.中华血液学杂志，1998，19：234-237.
(收稿：1998-06-29 修回：1998-11-26), 百拇医药