地塞米松对脑缺氧缺血新生大鼠bcl-2mRNA表达的调节
作者：周伟 吴圣媚 陈惠金
单位：200092 上海第二医科大学新华医院，上海市儿科医学研究所
关键词：脑缺氧；脑缺血；地塞米松；bcl-2
上海学报Shanghai Medical Journal1999年4月 第22卷 第4期 1999 【摘要】 目的 探讨地塞米松(DEX)预处理对缺氧缺 血新生大鼠脑保护作用的可能机制。方法 建立新生大鼠缺氧缺血性脑病动物模型，应用快速竞争性逆转录- 聚 合酶链反应(RT-PCR)技术，分别对缺氧缺血、DEX预处理后予缺氧缺血、缺氧结束后即刻予 DEX、DEX加假手术、正常对照5组动物的实验侧大脑组织中bcl-2 mRNA的表达进行半定量 分析。结果 缺氧缺血后，新生大鼠脑bcl-2 mRNA的表达自再灌注后6小时开始 明显增强，12小时达高峰，24小时回落至较低水平，至72小时已基本检测不到。而DEX预处 理在再灌注早期可抑制缺氧缺血对脑bcl-2 mRNA表达的诱导，但自再灌注后24小时始刺激b cl-2 mRNA的表达，并持续至再灌注7天以后。缺氧结束后即刻给予DEX对bcl-2 mRNA的表 达无影响。结论 DEX预处理对脑缺氧缺血新生大鼠的神经保护可能部分是通过对抗凋 亡基因bcl-2的正向调节而实现的。
, 百拇医药
The regulatory effects of dexamethasone on the expression of bcl-2 mRNA in neon atal rats following cerebral hypoxia-ischemia ZHOU Wei, WU Shengmei, CHEN Huijin. XinHua Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai Institute for Pe diatric Research, Shanghai, 200092
【Abstract】 Objective To investigate the possible mechanism of the neuroprotective effect of dexametha sone (DEX) on neonatal rats following cerebral hypoxia-ischemia. Methods Rapid competitive reverse transcriptase-PCR was used to analyse the expression of bcl-2 mRNA at ipsilateral cerebral hemisphere semi -quantitatively in neonatal rat models of hypoxia-ischemia, pre-treatment wit h DEX prior to hypoxia-ischemia; treatment with DEX immediately following hypoxia -ischemia; pre-treatment with DEX prior to sham and normal controls, respectiv ely. Results The expression of bcl-2 mRNA in the ipsilateral hemisp here following cerebral hypoxia-ischemia, began at 6h after recovery, peaked a t 12h, decreased to lower level at 24h, and returned towards baseline at 72h (n=3/ time point). The expression of bcl-2 mRNA in the ipsilateral hemisphere induc ed by hypoxia-ischemia could be inhibited by pretreatment with DEX prior to hyp oxia-ischemia at the early stage of recovery, but the induction of bcl-2 mRNA began at 24h, and lasted at least 7 days after recovery. DEX administered to the r ats immediately following hypoxia-ischemia had no effect on the expression of b cl-2 mRNA. Conclusion Pretreatment with DEX exerts neuroprotective effect on neonatal rats following hypoxia-ischemia, partially through positive inducti on of the expression of bcl-2 mRNA.(Shanghai Med J, 1999,22∶203-206)
, 百拇医药
【Key words】 Cerebral ischemia Cerebral hypoxia Dexamethasone Bcl-2
细胞凋亡受多种基因的调控。在哺乳动物中bcl-2基因及其相关蛋白在细胞凋亡调控过程中起着重要作用。目前认为，脑缺氧缺血所引起的迟发性神经元死亡主要是细胞凋亡，而有资料表明地塞米松(DEX)预处理可以减少缺氧缺血后所致的脑细胞凋亡。本研究通过快速竞争性逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术，检测了DEX对缺氧缺血后新生大鼠脑bcl-2RNA表达的影响，以期阐明地塞米松(DEX)预处理对缺氧缺血新生大鼠脑保护作用的可能机制。
材料和方法
一、新生大鼠HIE模型的制作
参照Rice方法[1]，生后7天的SD大鼠(购自中科院上海实验动物中心)，取仰卧位，将四肢固定于手术板上，颈正中切口，游离右侧颈总动脉，用5-0丝线结扎，缝合切口后置于2 000ml/min的速度输入含8%氧气、92%氮气的混合气体，持续2.5小时。
, 百拇医药
二、实验动物分组
将120只新生大鼠随机分为5组，每组24只。分别接受5种不同的实验条件，即缺氧缺血(HI)、腹腔注射地塞米松(DEX)后12小时左右予缺氧缺血(DH)、缺氧结束后即刻予腹腔注射DEX(HD)、DEX加假手术(DS)、以及正常对照(N)、于缺氧结束后不同时间点0、2、6、12、24、48、72小时及7天断颈处死(每个时间点3只)，自丘脑中1/3水平取实验侧(右侧)大脑半球组织约50mg冻存于-70°C冰箱备用。DEX(地塞米松磷酸钠注射液，上海市第九制药厂，批号970801)剂量为0.5mg/kg，注射时浓度为0.05mg/ml，相当于每10g体重0.1ml，对照组相应注射0.9%氯化钠注射液。
三、引物的设计与合成
从基因文库中查到大白鼠bcl-2基因cDNA序列，应用Oligo 5.0软件程序设计有意义、反义引物，另设计一个反义竞争引物(包含反意义引物另加20个碱基序列)，其扩增片段比目的 片段短208bp(见表1)。引物由美国CyberSyn生物工程公司合成。
, 百拇医药
表1 引物序列及其在bcl-2基因组中的位置
核酸序列
位置
产物大小
bcl-2 mRNA
Sense
(a)
5-CTTCCAGCCTGAGAGCAACC-3
150-169
Antisense
(b)
5-CATCCCAGCCTCCGTTATCC-3
, http://www.100md.com
580-561
431bp
bcl-2 competitor
Sense
(a)
5-CTTCCAGCCTGAGAGCAACC-3
150-169
Antisense
(c)
5-CATCCCAGCCTCCGTTATCC
580-561+
, http://www.100md.com
GGTGCAGCTGACTGGACATC-3
352-333
223bp
四、特定竞争性内参照的制备
特定竞争性内参照(internal standard, IS)的制备参照文献[2]。利用缺氧缺血后6小时的大鼠脑组织标本提取RNA，逆转录成cDNA；然后用引物a、c进行PCR扩增，琼脂糖(Promeg)凝胶电泳，胶回收(采用上海华舜生物工程公司生产的柱离心式胶回收试剂盒) ；再利 用引物a、b对稀释后的回收产物进行第二次PCR扩增，以提高纯度、增加得率。电泳、回收 后定量。并用不同稀释度的IS(160，80，40，20，10，5，2.5,1.25,0.625fg)与一定量的目 的cDNA竞争，以选择IS的最佳竞争浓度。
, 百拇医药 五、快速竞争性RT-PCR
采用上海华舜生物工程公司生产的柱离心式组织/细胞RNA抽提试剂盒提取RNA，PE Lamda 10 紫外/可见光分光光度计定量及电泳确定RNA质量。取2μg总RNA按逆转录试剂盒(Bioneer, K orea)说明进行逆转录，然后在Gene Amp PCR System 2400(Gene, U.S.A.)上行PCR。总反应 体系为50μl，其中包括：10×PCR缓冲液(内含15mmol/L的氯化镁)5μl，4×10nM dNTP(Promeg)2μl，12.5pmol的引物a、b各2μl，Taq DNA聚合酶(Promeg)2μl(1U/1μl)， 目的cDNA4 μ l(0.4μg),IS1μl(2.5fg)，灭菌去离子水32μl。反应条件是:94°C预变性5分钟，继之以9 4° C变性1分钟，67°C退火1分钟，72°C延伸1分钟，共30个循环，最后一个循环后72°C再延伸7分钟，4°C保存。PCR产物通过2%琼 脂 糖凝胶(含0.5μg/ml溴乙锭)电泳后用凝胶成像仪(上海复日公司)观察结果。计算PCR产物bc l-2 cDNA与IS的荧光密度比作为bcl-2基因的相对表达强度。
, 百拇医药
结 果
一、RNA抽提、cDNA逆转录及PCR扩增的效率
用柱离心式组织/细胞总RNA抽提试剂盒提取的总RNA的A260nm/ A280nm为1.9～2.0，变性电 泳28 S与18S之比约为2∶1，说明RNA未发生明显的降解。对缺氧缺血后12小时的大鼠脑组织提取 得到的总RNA进行逆转录并经PCR扩增，分别在431bp(bcl-2)及223bp(bcl-2 competitor) 处出现一条背景清晰的条带。
二、特定竞争性内标量的确定
选择目的条带与竞争条带均较明显的电泳泳道含量(第7泳道，2.5fg)，即为较合适的竞争水 平(图1)。
三、缺氧缺血后新生大鼠脑内bcl-2基因表达的动态变化
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正常情况下，新生大鼠脑内一般无可检测水平的bcl-2 mRNA的表达或表达很弱。缺氧缺血 后6小时，同侧大脑bcl-2 mRNA的表达开始明显增强，至12小时达高峰。24小时回落至较低 水平，至缺氧缺血后72小时已检测不到(图2A,图2B)。
自右向左泳道内标(IS)的量分别为80，40，20，10，5，2.5，1.25，0.625fg， 目的cDNA为0.4μg。bcl-2，大鼠bcl-2 PCR产物条带(431bp);IS，内标(223bp)。
图1 竞争内标量的确定
四、地塞米松对bcl-2基因表达的调节作用
DEX预处理在再灌注早期抑制了缺氧缺血对新生大鼠脑bcl-2 mRNA表达的诱导；而在再灌注 后24 小时，DEX预处理组大鼠脑内bcl-2 mRNA的表达已显著增强，并持续数天，在再灌注后7天 仍可检测到较强的表达水平。但缺氧缺血后给予DEX对bcl-2 mRNA的表达基本上无影响(图3 、4)。各组在再灌注后不同时间点bcl-2 mRNA的相对表达量见表2。
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A：自右向左泳 道对应的时间分别为再灌注后0，2，6， B：A中bcl-2目的条带与竞争内标条带的
12，24，48，72小时，7天。Bcl-2 PCR产物电泳条带； 密度比和时间对应关系的直方图
Is，bcl-2竞争性内标条带
图3 再灌注后12小时bcl-2 mRNA的表达情况
表2 DEX对缺氧缺血新生大鼠脑内bcl-2 mRNA
表达的调节 T
N
DS
, http://www.100md.com
HI
DH
HD
0h
0
0
0
0
0
2h
0
0
0
0
, 百拇医药
6h
0
0
0.82±0.12
0
0.79±0.15
12h
0
0
1.66±0.17
0
1.60±0.13
24h
, 百拇医药
0
0
0.24±0.07
0.87±0.10
0.27±0.05
48h
0
0
0.09±0.02
1.10±0.14
0.08±0.02
72h
0
, 百拇医药
0
0
0.51±0.09
0
7d
0
0
0
0.45±0.06
0
注：自6h至7d，HI组与DH组比较P<0.001; DH组与HD组比较P<0.001,HI组与HD组比 较 P>0.05
讨 论
, 百拇医药
国外的一些研究表明，DEX预处理对缺氧缺血新生动物具有神经保护作用，且这种作用存在 时间依赖性，即在缺氧缺血前4～48小时内给予
图4 再灌注后24小时bcl-2 mRNA的表达 情况
DEX可以显著减轻脑损伤的程度，而在缺氧缺 血前3小时内或发生缺氧缺血后应用DEX则无效[3]。其作用机制尚不清楚，但这种 时间依赖性提示DEX的作用可能与基因水平的调控有关。
Bcl-2基因及其相关蛋白在细胞凋亡调控过程中起着重要作用。不同的干预和刺激，通过 bcl-2的表达及其蛋白增加的机制能抑制凋亡[4]，转基因小鼠bcl-2的过表达对 缺 氧缺血性脑损伤具有保护作用[5]。缺氧缺血后脑组织bcl-2的表达增加[6] 。我们的研究也发现，在再灌注早期，由于神经细胞的自我保护机制，缺血侧大脑抗凋亡 基因bcl-2的表达反应性增强，再灌注后12小时其表达达高峰，而在再灌注后24～48小时， bcl-2 mRNA的表达已回落至低水平甚至检测不到。结合病理资料，此时恰为缺氧缺血后细 胞凋亡最显著时期。可以认为bcl-2未能对抗过强的损伤因子最终导致了细胞的凋亡，同时 由于表达bcl-2的细胞的凋亡而使bcl-2 mRNA的表达量明显下降。而DEX预处理组大鼠在再 灌注早期未能检测到bcl-2基因的表达，至再灌注后24小时左右bcl-2 mRNA的表达明显增 强并至少持续到再灌注后7天。采用原位末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡显示，与缺氧缺 血组比较，DEX预处理组脑细胞凋亡程度明显轻于前者。此结果与bcl-2 mRNA表达的 变化相一致。提示bcl-2 mRNA的表达与神经细胞存活密切相关，bcl-2可防止或减少缺血 再灌注所致凋亡的发生。
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电生理研究显示：糖皮质激素有助于抑制中枢神经系统神经元活性；Liu等也观察到，经DEX 预 处理的新生大鼠遭受缺氧缺血后，其缺血侧运动皮质神经元成熟及髓鞘形成均延迟，但不久 即恢复至正常水平，认为DEX对缺氧缺血新生大鼠的保护作用乃是由于暂时抑制神经元的成 熟 所致[3]。因此，上述DEX预处理组脑bcl-2 mRNA表达的变化过程可以理解为，在 再灌注早期，神经元活性由于受到暂时抑制，因而未能对缺氧缺血产生应答，没有诱导bcl -2 mRNA的表达。再灌注后24小时左右，这些神经元的活性得到恢复，开始过表达bcl-2 m RNA，对抗再灌注后所致的钙超载、氧自由基和兴奋性氨基酸等，从而使其免遭损伤。本研 究显示，bcl-2 mRNA的不同表达与DEX作用的时间依赖性吻合，提示DEX预处理对脑缺氧缺 血新生大鼠的神经保护可能部分是通过对bcl-2 mRNA的正向调节而实现的。当然，细胞凋 亡是受多因素调控的，而且有资料表明，bcl-2缺陷小鼠仍能正常发育及维持中枢神经系 统功能，提示其它一些基因也可能在控制中枢神经系统细胞死亡的过程中起着重要作用。DE X预处理的神经保护作用的机制也不仅限于对bcl-2的调节，尚有待于进一步研究。
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参考文献
1 Rice JE, Vannucci RC, Brierley JB. The influence of immaturity on hypo xic-ischemic brain damage in the rat. Ann Neurol, 1981,9:131-141.
2 Jiang YH, Davidson LA, Lupton JR, et al. Rapid competitive PCR determi na tion of relative gene expression in limiting tissue samples. Clin Chem, 1996,42: 227-333.
3 周伟，吴圣楣.地塞米松与围生期缺氧缺血性脑损伤.国外医学妇幼保健分册，19 97，8：166-168.
, 百拇医药 4 Schwartzman RA, Cidlowski JA. Apoptosis: the biochemistry and molecula r biology of programmed cell death. Endocrine Rev, 1993,14:133-151.
5 Martinou JC, Dubois DM, Staple JK, et al. Overexpression of bcl-2 in transgenic mice protects neurones from naturally occuring cell death and experim ental ischemia. Neuron, 1994,13:1017-1030.
6 Ekert P, MacLusky N, Luo XP, et al. Dexamethasone prevents in a neonat al rat model of hypoxic-ischemic encephalopathy by a reactive oxygen species-i ndepengent mechanism. Brain Res, 1997,747:9-17.
收稿：1999-01-12, 百拇医药
单位：200092 上海第二医科大学新华医院，上海市儿科医学研究所
关键词：脑缺氧；脑缺血；地塞米松；bcl-2
上海学报Shanghai Medical Journal1999年4月 第22卷 第4期 1999 【摘要】 目的 探讨地塞米松(DEX)预处理对缺氧缺 血新生大鼠脑保护作用的可能机制。方法 建立新生大鼠缺氧缺血性脑病动物模型，应用快速竞争性逆转录- 聚 合酶链反应(RT-PCR)技术，分别对缺氧缺血、DEX预处理后予缺氧缺血、缺氧结束后即刻予 DEX、DEX加假手术、正常对照5组动物的实验侧大脑组织中bcl-2 mRNA的表达进行半定量 分析。结果 缺氧缺血后，新生大鼠脑bcl-2 mRNA的表达自再灌注后6小时开始 明显增强，12小时达高峰，24小时回落至较低水平，至72小时已基本检测不到。而DEX预处 理在再灌注早期可抑制缺氧缺血对脑bcl-2 mRNA表达的诱导，但自再灌注后24小时始刺激b cl-2 mRNA的表达，并持续至再灌注7天以后。缺氧结束后即刻给予DEX对bcl-2 mRNA的表 达无影响。结论 DEX预处理对脑缺氧缺血新生大鼠的神经保护可能部分是通过对抗凋 亡基因bcl-2的正向调节而实现的。
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The regulatory effects of dexamethasone on the expression of bcl-2 mRNA in neon atal rats following cerebral hypoxia-ischemia ZHOU Wei, WU Shengmei, CHEN Huijin. XinHua Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai Institute for Pe diatric Research, Shanghai, 200092
【Abstract】 Objective To investigate the possible mechanism of the neuroprotective effect of dexametha sone (DEX) on neonatal rats following cerebral hypoxia-ischemia. Methods Rapid competitive reverse transcriptase-PCR was used to analyse the expression of bcl-2 mRNA at ipsilateral cerebral hemisphere semi -quantitatively in neonatal rat models of hypoxia-ischemia, pre-treatment wit h DEX prior to hypoxia-ischemia; treatment with DEX immediately following hypoxia -ischemia; pre-treatment with DEX prior to sham and normal controls, respectiv ely. Results The expression of bcl-2 mRNA in the ipsilateral hemisp here following cerebral hypoxia-ischemia, began at 6h after recovery, peaked a t 12h, decreased to lower level at 24h, and returned towards baseline at 72h (n=3/ time point). The expression of bcl-2 mRNA in the ipsilateral hemisphere induc ed by hypoxia-ischemia could be inhibited by pretreatment with DEX prior to hyp oxia-ischemia at the early stage of recovery, but the induction of bcl-2 mRNA began at 24h, and lasted at least 7 days after recovery. DEX administered to the r ats immediately following hypoxia-ischemia had no effect on the expression of b cl-2 mRNA. Conclusion Pretreatment with DEX exerts neuroprotective effect on neonatal rats following hypoxia-ischemia, partially through positive inducti on of the expression of bcl-2 mRNA.(Shanghai Med J, 1999,22∶203-206)
, 百拇医药
【Key words】 Cerebral ischemia Cerebral hypoxia Dexamethasone Bcl-2
细胞凋亡受多种基因的调控。在哺乳动物中bcl-2基因及其相关蛋白在细胞凋亡调控过程中起着重要作用。目前认为，脑缺氧缺血所引起的迟发性神经元死亡主要是细胞凋亡，而有资料表明地塞米松(DEX)预处理可以减少缺氧缺血后所致的脑细胞凋亡。本研究通过快速竞争性逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术，检测了DEX对缺氧缺血后新生大鼠脑bcl-2RNA表达的影响，以期阐明地塞米松(DEX)预处理对缺氧缺血新生大鼠脑保护作用的可能机制。
材料和方法
一、新生大鼠HIE模型的制作
参照Rice方法[1]，生后7天的SD大鼠(购自中科院上海实验动物中心)，取仰卧位，将四肢固定于手术板上，颈正中切口，游离右侧颈总动脉，用5-0丝线结扎，缝合切口后置于2 000ml/min的速度输入含8%氧气、92%氮气的混合气体，持续2.5小时。
, 百拇医药
二、实验动物分组
将120只新生大鼠随机分为5组，每组24只。分别接受5种不同的实验条件，即缺氧缺血(HI)、腹腔注射地塞米松(DEX)后12小时左右予缺氧缺血(DH)、缺氧结束后即刻予腹腔注射DEX(HD)、DEX加假手术(DS)、以及正常对照(N)、于缺氧结束后不同时间点0、2、6、12、24、48、72小时及7天断颈处死(每个时间点3只)，自丘脑中1/3水平取实验侧(右侧)大脑半球组织约50mg冻存于-70°C冰箱备用。DEX(地塞米松磷酸钠注射液，上海市第九制药厂，批号970801)剂量为0.5mg/kg，注射时浓度为0.05mg/ml，相当于每10g体重0.1ml，对照组相应注射0.9%氯化钠注射液。
三、引物的设计与合成
从基因文库中查到大白鼠bcl-2基因cDNA序列，应用Oligo 5.0软件程序设计有意义、反义引物，另设计一个反义竞争引物(包含反意义引物另加20个碱基序列)，其扩增片段比目的 片段短208bp(见表1)。引物由美国CyberSyn生物工程公司合成。
, 百拇医药
表1 引物序列及其在bcl-2基因组中的位置
核酸序列
位置
产物大小
bcl-2 mRNA
Sense
(a)
5-CTTCCAGCCTGAGAGCAACC-3
150-169
Antisense
(b)
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Sense
(a)
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150-169
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(c)
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580-561+
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GGTGCAGCTGACTGGACATC-3
352-333
223bp
四、特定竞争性内参照的制备
特定竞争性内参照(internal standard, IS)的制备参照文献[2]。利用缺氧缺血后6小时的大鼠脑组织标本提取RNA，逆转录成cDNA；然后用引物a、c进行PCR扩增，琼脂糖(Promeg)凝胶电泳，胶回收(采用上海华舜生物工程公司生产的柱离心式胶回收试剂盒) ；再利 用引物a、b对稀释后的回收产物进行第二次PCR扩增，以提高纯度、增加得率。电泳、回收 后定量。并用不同稀释度的IS(160，80，40，20，10，5，2.5,1.25,0.625fg)与一定量的目 的cDNA竞争，以选择IS的最佳竞争浓度。
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采用上海华舜生物工程公司生产的柱离心式组织/细胞RNA抽提试剂盒提取RNA，PE Lamda 10 紫外/可见光分光光度计定量及电泳确定RNA质量。取2μg总RNA按逆转录试剂盒(Bioneer, K orea)说明进行逆转录，然后在Gene Amp PCR System 2400(Gene, U.S.A.)上行PCR。总反应 体系为50μl，其中包括：10×PCR缓冲液(内含15mmol/L的氯化镁)5μl，4×10nM dNTP(Promeg)2μl，12.5pmol的引物a、b各2μl，Taq DNA聚合酶(Promeg)2μl(1U/1μl)， 目的cDNA4 μ l(0.4μg),IS1μl(2.5fg)，灭菌去离子水32μl。反应条件是:94°C预变性5分钟，继之以9 4° C变性1分钟，67°C退火1分钟，72°C延伸1分钟，共30个循环，最后一个循环后72°C再延伸7分钟，4°C保存。PCR产物通过2%琼 脂 糖凝胶(含0.5μg/ml溴乙锭)电泳后用凝胶成像仪(上海复日公司)观察结果。计算PCR产物bc l-2 cDNA与IS的荧光密度比作为bcl-2基因的相对表达强度。
, 百拇医药
结 果
一、RNA抽提、cDNA逆转录及PCR扩增的效率
用柱离心式组织/细胞总RNA抽提试剂盒提取的总RNA的A260nm/ A280nm为1.9～2.0，变性电 泳28 S与18S之比约为2∶1，说明RNA未发生明显的降解。对缺氧缺血后12小时的大鼠脑组织提取 得到的总RNA进行逆转录并经PCR扩增，分别在431bp(bcl-2)及223bp(bcl-2 competitor) 处出现一条背景清晰的条带。
二、特定竞争性内标量的确定
选择目的条带与竞争条带均较明显的电泳泳道含量(第7泳道，2.5fg)，即为较合适的竞争水 平(图1)。
三、缺氧缺血后新生大鼠脑内bcl-2基因表达的动态变化
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正常情况下，新生大鼠脑内一般无可检测水平的bcl-2 mRNA的表达或表达很弱。缺氧缺血 后6小时，同侧大脑bcl-2 mRNA的表达开始明显增强，至12小时达高峰。24小时回落至较低 水平，至缺氧缺血后72小时已检测不到(图2A,图2B)。
自右向左泳道内标(IS)的量分别为80，40，20，10，5，2.5，1.25，0.625fg， 目的cDNA为0.4μg。bcl-2，大鼠bcl-2 PCR产物条带(431bp);IS，内标(223bp)。
图1 竞争内标量的确定
四、地塞米松对bcl-2基因表达的调节作用
DEX预处理在再灌注早期抑制了缺氧缺血对新生大鼠脑bcl-2 mRNA表达的诱导；而在再灌注 后24 小时，DEX预处理组大鼠脑内bcl-2 mRNA的表达已显著增强，并持续数天，在再灌注后7天 仍可检测到较强的表达水平。但缺氧缺血后给予DEX对bcl-2 mRNA的表达基本上无影响(图3 、4)。各组在再灌注后不同时间点bcl-2 mRNA的相对表达量见表2。
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A：自右向左泳 道对应的时间分别为再灌注后0，2，6， B：A中bcl-2目的条带与竞争内标条带的
12，24，48，72小时，7天。Bcl-2 PCR产物电泳条带； 密度比和时间对应关系的直方图
Is，bcl-2竞争性内标条带
图3 再灌注后12小时bcl-2 mRNA的表达情况
表2 DEX对缺氧缺血新生大鼠脑内bcl-2 mRNA
表达的调节 T
N
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6h
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0.82±0.12
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0.79±0.15
12h
0
0
1.66±0.17
0
1.60±0.13
24h
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0
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0.24±0.07
0.87±0.10
0.27±0.05
48h
0
0
0.09±0.02
1.10±0.14
0.08±0.02
72h
0
, 百拇医药
0
0
0.51±0.09
0
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0
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0.45±0.06
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注：自6h至7d，HI组与DH组比较P<0.001; DH组与HD组比较P<0.001,HI组与HD组比 较 P>0.05
讨 论
, 百拇医药
国外的一些研究表明，DEX预处理对缺氧缺血新生动物具有神经保护作用，且这种作用存在 时间依赖性，即在缺氧缺血前4～48小时内给予
图4 再灌注后24小时bcl-2 mRNA的表达 情况
DEX可以显著减轻脑损伤的程度，而在缺氧缺 血前3小时内或发生缺氧缺血后应用DEX则无效[3]。其作用机制尚不清楚，但这种 时间依赖性提示DEX的作用可能与基因水平的调控有关。
Bcl-2基因及其相关蛋白在细胞凋亡调控过程中起着重要作用。不同的干预和刺激，通过 bcl-2的表达及其蛋白增加的机制能抑制凋亡[4]，转基因小鼠bcl-2的过表达对 缺 氧缺血性脑损伤具有保护作用[5]。缺氧缺血后脑组织bcl-2的表达增加[6] 。我们的研究也发现，在再灌注早期，由于神经细胞的自我保护机制，缺血侧大脑抗凋亡 基因bcl-2的表达反应性增强，再灌注后12小时其表达达高峰，而在再灌注后24～48小时， bcl-2 mRNA的表达已回落至低水平甚至检测不到。结合病理资料，此时恰为缺氧缺血后细 胞凋亡最显著时期。可以认为bcl-2未能对抗过强的损伤因子最终导致了细胞的凋亡，同时 由于表达bcl-2的细胞的凋亡而使bcl-2 mRNA的表达量明显下降。而DEX预处理组大鼠在再 灌注早期未能检测到bcl-2基因的表达，至再灌注后24小时左右bcl-2 mRNA的表达明显增 强并至少持续到再灌注后7天。采用原位末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡显示，与缺氧缺 血组比较，DEX预处理组脑细胞凋亡程度明显轻于前者。此结果与bcl-2 mRNA表达的 变化相一致。提示bcl-2 mRNA的表达与神经细胞存活密切相关，bcl-2可防止或减少缺血 再灌注所致凋亡的发生。
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电生理研究显示：糖皮质激素有助于抑制中枢神经系统神经元活性；Liu等也观察到，经DEX 预 处理的新生大鼠遭受缺氧缺血后，其缺血侧运动皮质神经元成熟及髓鞘形成均延迟，但不久 即恢复至正常水平，认为DEX对缺氧缺血新生大鼠的保护作用乃是由于暂时抑制神经元的成 熟 所致[3]。因此，上述DEX预处理组脑bcl-2 mRNA表达的变化过程可以理解为，在 再灌注早期，神经元活性由于受到暂时抑制，因而未能对缺氧缺血产生应答，没有诱导bcl -2 mRNA的表达。再灌注后24小时左右，这些神经元的活性得到恢复，开始过表达bcl-2 m RNA，对抗再灌注后所致的钙超载、氧自由基和兴奋性氨基酸等，从而使其免遭损伤。本研 究显示，bcl-2 mRNA的不同表达与DEX作用的时间依赖性吻合，提示DEX预处理对脑缺氧缺 血新生大鼠的神经保护可能部分是通过对bcl-2 mRNA的正向调节而实现的。当然，细胞凋 亡是受多因素调控的，而且有资料表明，bcl-2缺陷小鼠仍能正常发育及维持中枢神经系 统功能，提示其它一些基因也可能在控制中枢神经系统细胞死亡的过程中起着重要作用。DE X预处理的神经保护作用的机制也不仅限于对bcl-2的调节，尚有待于进一步研究。
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参考文献
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收稿：1999-01-12, 百拇医药