重组人淋巴毒素抗肿瘤作用的研究
作者：李纯懿 任文龙 李昌本 李平 姚玉龙 戴静芝 刘全海
单位：李纯懿 北京医科大学临床肿瘤学院北京市肿瘤防治研究所临床药理室(北京，100034)；任文龙 姚玉龙 戴静芝 刘全海 上海医药工业研究院药理室(上海，200437)；李昌本 李平 上海复旦大学遗传所遗传工程国家重点实验室(上海，200433)
关键词：重组人淋巴毒素rhLT；人胃癌MKN-45；小鼠肉瘤S180；小鼠Ehrlich氏实体瘤；小鼠黑色素瘤B16
癌症990405
【摘要】目的：探讨重组人淋巴毒素(rhLT)体内外抗肿瘤作用。方法：体外采用MTT法测rhLT对人胃癌细胞MKN-45的细胞毒作用，体内采用小鼠移植性肿瘤研究其抗肿瘤活性。结果：rhLT对体外培养的MKN-45有较强的细胞毒作用，其IC50为1.98×10-2μg/ml；rhLT对小鼠体内移植的S180实体瘤和小鼠Ehrlich氏实体瘤均有一定的抑制作用，其抑制率分别为34.13%和34.08%；在rhLT对小鼠黑色素瘤B16肺转移的抑制作用研究中发现rhLT有很好的疗效，各组的抑瘤率分别为：rhLT预防组，30.61%；rhLT治疗组，59.45%；rhLT预防治疗组79.23%。结论：rhLT在体内外均有一定的抗肿瘤作用，并有潜在的预防转移作用。
, 百拇医药
中图分类号：R735.2 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)04-0376-03
The antitumor activity of recombinant human lymphotoxin
LI Chun-yi1，REN Wen-long2，LI Chang-ben3，et al.
1.Department of Clinical Pharmjacology,Beijing Institute for Cancer Research, Beijing 100034,P.R.China
2.Department of Pharmacology,Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry, Shanghai 200437,P.R.China
, 百拇医药
3.The Institute of Genetics, Fudan University,Shanghai 200433, P.R.China
【Abstract】 Objective：To investigate the antitumor activity in vitro and in vivo of recombinant human lymphotoxin(rhLT).Methods：Cytotoxicity was measured using MTT assay.The antitumor activity in vivo was evaluated by transplanted mouse solid tumor.Results：(1) In vitro rhLT showed cytotoxicity on human gastric carcinomas MKN-45,the IC50 was 1.98× 10- 2μ g/ml.(2) In vivo rhLT had a significant antitumor effect on mouse solid tumors (sarcoma 180 ＆ Ehrlich carcinoma),the rate of inhibition were 34.13% and 34.08%, respectively.(3) In the experimental pulmonary metastasis model induced by i.v. injection of mouse B16 melanoma, a high preventive and curative effect of rhLT was obtained by systemic administration in syngenic mice, the rate of inhibition were：preventive group,30.61% ;treatment group, 59.45%;preventive-treatment group,79.23%;respectively. Conclusion： RhLT has a significant antitumor effect on human gastric carcimoma MKN-45 in vitro and murine solid tumor in vivo, and has a potent preventive effect on metastasis.
, http://www.100md.com
Key words：Recombinant human lymphotoxin;Human gastric carcinomas MKN-45;Mouse sarcoma S180; Mouse Ehrlich solid tumor;Mouse B16 melanoma
淋巴毒素LT(lymphotoxin)，是由激活的淋巴细胞产生的一种淋巴因子，具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒和诱导分化等作用，但其抗肿瘤作用的国内外研究结果并不完全一致[1]。为此，本研究采用由基因工程方法获得的重组人淋巴毒素(Recombinant human lymphotoxin, rhLt)研究其在体内外的抗肿瘤作用，以便为临床应用提供理论基础和实验依据。
1 材料和方法
1.1 肿瘤细胞株
人胃癌细胞MKN-45(引自ATCC，USA)，和小鼠黑色素瘤细胞株B16均于含15%新生小牛血清的RPMI1640全培养基中常规传代培养；小鼠肉瘤S180和小鼠Ehrlich氏实体瘤常规体内传代维持。
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1.2 实验动物
昆明种小白鼠，雌性，18～20g；C57BL/6，雌性，18～20g，购于中国科学院上海实验动物中心，沪动合格证号006。
1.3 药物和主要试剂
rhLT由上海复旦大学遗传所提供，有两批：批号970519：浓度85μg/ml，比活7.1×107U/mg蛋白，供S180和EC体内实验用；批号970625；浓度150μg/ml，比活5.3×108U/mg蛋白，供体外和B16体内实验用；均溶于PBS中，PH7.0～7.2，经无菌过滤于-20℃保存。MTT为Fluka公司产品，临用前以PBS配成5mg/ml溶液，无菌过滤；细胞溶解液，每100ml去离子双蒸水中含SDS10g，异于醇5ml，浓盐酸120μl。
1.4 MTT法测rhLT对MKN-45的细胞毒作用[2]
, 百拇医药
在96孔细胞培养板(Nunc)中每孔接种MKN-45细胞100μl(1×104个/ml)，加入10倍稀释的不同浓度的rhLT100μl,每浓度设5复孔，并设细胞对照孔和调零孔，于37℃，5%CO2培养箱中培养7天后，每孔轻轻吸出100μl，加MTT溶液20μl，于37℃温育4h后加细胞溶解液100μl，37℃温育过夜，次日轻轻振荡，用酶标仪于570nm处测OD值。统计学分析采用相关线性回归计算IC50。
1.5 rhLT对小鼠S180实体瘤和小鼠Ehrlich氏实体瘤(EC)的抑制作用[3]
无菌取生长良好的S180腹水和EC腹水(EAC)，用生理盐水稀释为约1～2×107个/ml，于昆明种小鼠右前肢腋窝皮下接种0.2ml/只，随机分为对照组和给药组，次日开始给药，隔日一次，共6次，给药方案见表2。在最后一次给药的次日，解剖取出肿瘤，称重，计算公式为：肿瘤抑制率=(1-T/C)×100%，T和C分别为给药组和对照组平均瘤重，统计学分析采用非配对样本t检验。
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表1 rhLT体外对人胃癌细胞MKN-45的细胞毒作用 rhLT浓度(μg/ml)
OD值(
±S)
抑制率(%)
0
1.020±0.081
—
7.5×10-1
0.240±0.017
76.47
7.5×10-2
, http://www.100md.com
0.253±0.031
75.20
7.5×10-3
0.567±0.081
44.41
7.5×10-4
0.957±0.042
6.18
7.5×10-5
1.003±0.081
1.17
, http://www.100md.com
IC50=1.98×10-2μg/ml(γ=0.9589)表2 rhLT对小鼠S180实体瘤和小鼠Ehrlich氏实瘤的抑制作用 瘤源
组别
剂量
(μg/kg)
给药方案
(隔日一次)
动物数
动物体重(g)
瘤重(g)
抑制率
(%)
, 百拇医药
始
终
始
终
总
均(±S)
S180
对照组
PBS
iv×6
10
9
, http://www.100md.com
18.7
21.0
15.1
1.67±0.21
—
rhLT组
1000
iv×6
10
8
18.5
20.3
8.8
, http://www.100md.com
1.10±0.21*
34.13
EC
对照组
PBS
iv×6
10
10
20.7
27.8
26.7
2.67±0.29
—
, http://www.100md.com
rhLT组
1000
iv×6
10
10
20.7
25.2
17.6
1.76±0.21*
34.08
*表示与对照组比较P<0.01表3 rhLT对小鼠黑色素瘤B16肺转移抑制的作用 组别
剂量
, 百拇医药
(μg/kg)
给药方案
(隔日一次)
动物数
动物体重(g)
肺结节数
抑制率
(%)
始
终
始
终
总
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均(±S)
对照组rhLT
PBS
iv×6
6
6
18.1
19.0
624
104.00±6.16
-
预防组rhLT
, http://www.100md.com
1000
iv×6
6
6
17.9
19.2
433
72.17±5.49*
30.61
治疗组rhLT预防
1000
iv×6
6
, 百拇医药
6
18.5
18.9
253
42.17±6.43*
59.45
治疗组
1000
iv×12
6
6
18.2
19.0
, http://www.100md.com
108
21.60±4.22*
79.23
*表示分别与其它3组比较P<0.01
1.6 rhLT对小鼠黑色素瘤B16肺转移的抑制作用[4]
取处于对数生长期的B16细胞，用含15%新生小牛血清的RPMI1640全培养基调整至5×105个/ml，无菌操作于C57BL/6小鼠尾静脉接种，0.2ml/只，随机分为4组，给药途径均为：小鼠尾静脉注射，隔日一次。每次给药体积均为0.5mg/20g，rhLT剂量为1000μg/kg。其中，对照组于接种后的次日起给予PBS，隔日一次，共6次；预防组于接种前的第11天起给予rhLT，隔日一次，共6次，即最后一次给药为接种的前一天；治疗组于接种后的次日起给予rhLT，隔日一次，共6次，即最后一次给药为接种后的第11天；预防治疗组于接种前的第11天起给予rhLT，隔日一次，共12次，即最后一次给药为接种后的第11天。在接种后的第21天，处死小鼠，解剖计肺叶上黑色结节数，统计学分析采用多样本均数两两比较的秩和检验。
, 百拇医药
2 结果
2.1 体外MTT法测定结果
MTT法测定表明rhLT在一定浓度范围内，对一定浓度的MKN-45有较强的细胞毒作用，以抑制率和lgc进行相关线性回归，得到IC50=1.98×10-2μg/ml(γ=0.9589)，表明体外rhLT对MKN-45的细胞毒作用与其浓度其有很好的相关性(表1)。
2.2 体内研究结果
体内研究表明rhLT对小鼠S180实体瘤和小鼠Ehrlich氏实体瘤均有较强的抑作用，实验组平均瘤重与对照组相比有显著性差异(P<0.01)(表2)。
2.3 rhLT对小鼠黑色素瘤B16的肺转移的抑制作用
rlLT对B16的肺转移有很强的抑制作用，接种前给药的预防组，其抑制率便可达30.61%；而接种后给药的治疗组，其抑制率可增至59.45%，将近预防组的两倍；尤其是预防治疗组，其抑制效果最佳，将近80%。对各组的肺结节均数进行多样本均数两两比较的秩和检验表明以上3个给药组，分别与其它3个实验组相比均有显著性差异(P<0.01)(表3)。
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3 讨论
淋巴毒素是由抗原或有丝分裂原激活的淋巴细胞产生的一种淋巴因子，于1967年由Ruddle和Waksman在研究迟发性过敏反应(delayedhypersensitivity)时发现[5]。自从1984年Gray[6]等克隆了淋巴毒素的cDNA以来，研究工作更加深入。淋巴毒素存在可溶性的分泌型和膜结合型两种表达形式[7]，分泌到细胞外的可溶性形式为LTα，即基因工程领域通常所说的淋巴毒素，本文所用即是这种分泌型淋巴毒素，它是一个25kD的糖蛋白。作为机体免疫网络中的一种组成成份，LT有广泛和独特的生物学效应，主要表现在免疫调节，诱导分化，抗肿瘤作用，抗病毒作用和调节炎症反应中。这给它的抗肿瘤作用带来一定程度的独特性，但其抗肿瘤作用的研究结果报道不一[1，4]。
在本实验的体外研究中rhLT对人胃癌细胞MKN-45有较强的细胞毒作用，且这种细胞毒作用在不同批号的rhLT(结果未出示)和多次MTT重复实验中均有稳定的表现。但是在对rhLT体外抑瘤谱的研究中，除MKN-45以外，我们曾先后筛选了人源和鼠源共30余种肿瘤细胞株，均采用3种不同的细胞浓度和培养时间重复筛选，rhLT对这些细胞都没有显示明显的细胞毒作用。这与文献报道大体一致，但国外报道LT对其中少数肿瘤细胞是敏感的。分析原因有以下两个方面：一是本实验所用的rhLT是一种突变体，本身的结构功能不可能和LT原形以及其它作用所用的LT完全一样；二是本实验所采用的肿瘤细胞株大部分来源于国内，其亚型以及一些受体的表达和国外同名细胞株存在一些差异，因而可能造成对某些抗肿瘤药不敏感。
, 百拇医药
体内研究结果表明rhLT对S180实体瘤和EC实体瘤有一定的抑制作用，但在体外实验中rhLT对这两种细胞株均无明显的细胞毒作用(结果未列出)，这与国外一些作者的实验结果相似。LT体内效果优于体外效果表明LT可能不是单纯地杀死肿瘤细胞，而可能是通过调动机体自身的免疫系统，借助免疫网络的调节来发挥作用[8，9]。这是LT抗肿瘤作用的独特性，也正因此，给LT的体内研究带来一定程度的困难。有作者对小鼠和裸鼠上的移植性肿瘤研究表明，当同基因小鼠和裸鼠移植上MethA肉瘤时，LT对前者移植瘤有显著的生长抑制作用，对后者移植瘤不管用什么给药途径，LT的抑制作用都相当小，只有加大LT剂量至前者的8～16倍时[4，10]方可取得相同的抑瘤效果。这说明LT的体内抗肿瘤作用需机体免疫系统的参与。
在对小鼠黑色素瘤B16的肺转移抑制作用的研究中，发现rhLT有着非常好的预防和治疗作用，目前国内还无此方面的报道，国外文献中也较少见。
, 百拇医药 参考文献
1 Paul NL, Ruddle NH. Lymphotoxin [ J] . Ann Rev Immunol,1988,6： 407～ 438.
2 韩锐主编.抗癌药物研究与实验技术[M].北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1997：284～285.
3 韩锐主编.肿瘤化学预防及药物治疗[M].第一版.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1991：16～26.
4 Funahashi I, Kawatsu M, Kajikawa T, et al. Usefulness of glycosylated recombinant human lymphotoxin for growth inhibition of human and murine solid tumors and experimental metastasis in mice [J] . J Immunother,1991,10： 28～38.
, http://www.100md.com
5 Ruddle NH, Waksman BH.Cytotoxic effect of lymphocyte antigen interaction in delayed hypersensitivity [J] .Science,1967,157： 1060～ 1062.
6 Gray PW, Aggarwal BB, Benton CV,et al. Cloning and expression of cDNA for human lymphotoxin： a lymphokine with tumor necrosis activity [J] .Nature,1984,312： 721～ 724.
7 徐人尔，李平，倪卓昱，等.淋巴毒素的研究进展[J].中国肿瘤生物治疗杂志，1997，4(4)：313～315，322.
8 Qin ZH, Blankenstein T. Tumor growth inhibition mediated by lymphotoxin： evidence of B lymphocyte involvement in the antitumor response [J] .Cancer Res, 1995,55： 4747～ 4751.
9 Higuchi M, Mitsuno T, Sugimoto M,et al. Tumoricidal activity of lymphotoxin(tumor necrosis factor β)in vivo：its effects on macrophages [J] .J Biol Response Mod,1988,7： 619～ 630.
10 蔡铀庆.淋巴毒素研究新进展[J].国外医学分子生物学分册，1994，16(2)：49～53.
收稿日期：1999-05-26；修回日期：1999-06-09, http://www.100md.com
单位：李纯懿 北京医科大学临床肿瘤学院北京市肿瘤防治研究所临床药理室(北京，100034)；任文龙 姚玉龙 戴静芝 刘全海 上海医药工业研究院药理室(上海，200437)；李昌本 李平 上海复旦大学遗传所遗传工程国家重点实验室(上海，200433)
关键词：重组人淋巴毒素rhLT；人胃癌MKN-45；小鼠肉瘤S180；小鼠Ehrlich氏实体瘤；小鼠黑色素瘤B16
癌症990405
【摘要】目的：探讨重组人淋巴毒素(rhLT)体内外抗肿瘤作用。方法：体外采用MTT法测rhLT对人胃癌细胞MKN-45的细胞毒作用，体内采用小鼠移植性肿瘤研究其抗肿瘤活性。结果：rhLT对体外培养的MKN-45有较强的细胞毒作用，其IC50为1.98×10-2μg/ml；rhLT对小鼠体内移植的S180实体瘤和小鼠Ehrlich氏实体瘤均有一定的抑制作用，其抑制率分别为34.13%和34.08%；在rhLT对小鼠黑色素瘤B16肺转移的抑制作用研究中发现rhLT有很好的疗效，各组的抑瘤率分别为：rhLT预防组，30.61%；rhLT治疗组，59.45%；rhLT预防治疗组79.23%。结论：rhLT在体内外均有一定的抗肿瘤作用，并有潜在的预防转移作用。
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中图分类号：R735.2 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)04-0376-03
The antitumor activity of recombinant human lymphotoxin
LI Chun-yi1，REN Wen-long2，LI Chang-ben3，et al.
1.Department of Clinical Pharmjacology,Beijing Institute for Cancer Research, Beijing 100034,P.R.China
2.Department of Pharmacology,Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry, Shanghai 200437,P.R.China
, 百拇医药
3.The Institute of Genetics, Fudan University,Shanghai 200433, P.R.China
【Abstract】 Objective：To investigate the antitumor activity in vitro and in vivo of recombinant human lymphotoxin(rhLT).Methods：Cytotoxicity was measured using MTT assay.The antitumor activity in vivo was evaluated by transplanted mouse solid tumor.Results：(1) In vitro rhLT showed cytotoxicity on human gastric carcinomas MKN-45,the IC50 was 1.98× 10- 2μ g/ml.(2) In vivo rhLT had a significant antitumor effect on mouse solid tumors (sarcoma 180 ＆ Ehrlich carcinoma),the rate of inhibition were 34.13% and 34.08%, respectively.(3) In the experimental pulmonary metastasis model induced by i.v. injection of mouse B16 melanoma, a high preventive and curative effect of rhLT was obtained by systemic administration in syngenic mice, the rate of inhibition were：preventive group,30.61% ;treatment group, 59.45%;preventive-treatment group,79.23%;respectively. Conclusion： RhLT has a significant antitumor effect on human gastric carcimoma MKN-45 in vitro and murine solid tumor in vivo, and has a potent preventive effect on metastasis.
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Key words：Recombinant human lymphotoxin;Human gastric carcinomas MKN-45;Mouse sarcoma S180; Mouse Ehrlich solid tumor;Mouse B16 melanoma
淋巴毒素LT(lymphotoxin)，是由激活的淋巴细胞产生的一种淋巴因子，具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒和诱导分化等作用，但其抗肿瘤作用的国内外研究结果并不完全一致[1]。为此，本研究采用由基因工程方法获得的重组人淋巴毒素(Recombinant human lymphotoxin, rhLt)研究其在体内外的抗肿瘤作用，以便为临床应用提供理论基础和实验依据。
1 材料和方法
1.1 肿瘤细胞株
人胃癌细胞MKN-45(引自ATCC，USA)，和小鼠黑色素瘤细胞株B16均于含15%新生小牛血清的RPMI1640全培养基中常规传代培养；小鼠肉瘤S180和小鼠Ehrlich氏实体瘤常规体内传代维持。
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1.2 实验动物
昆明种小白鼠，雌性，18～20g；C57BL/6，雌性，18～20g，购于中国科学院上海实验动物中心，沪动合格证号006。
1.3 药物和主要试剂
rhLT由上海复旦大学遗传所提供，有两批：批号970519：浓度85μg/ml，比活7.1×107U/mg蛋白，供S180和EC体内实验用；批号970625；浓度150μg/ml，比活5.3×108U/mg蛋白，供体外和B16体内实验用；均溶于PBS中，PH7.0～7.2，经无菌过滤于-20℃保存。MTT为Fluka公司产品，临用前以PBS配成5mg/ml溶液，无菌过滤；细胞溶解液，每100ml去离子双蒸水中含SDS10g，异于醇5ml，浓盐酸120μl。
1.4 MTT法测rhLT对MKN-45的细胞毒作用[2]
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在96孔细胞培养板(Nunc)中每孔接种MKN-45细胞100μl(1×104个/ml)，加入10倍稀释的不同浓度的rhLT100μl,每浓度设5复孔，并设细胞对照孔和调零孔，于37℃，5%CO2培养箱中培养7天后，每孔轻轻吸出100μl，加MTT溶液20μl，于37℃温育4h后加细胞溶解液100μl，37℃温育过夜，次日轻轻振荡，用酶标仪于570nm处测OD值。统计学分析采用相关线性回归计算IC50。
1.5 rhLT对小鼠S180实体瘤和小鼠Ehrlich氏实体瘤(EC)的抑制作用[3]
无菌取生长良好的S180腹水和EC腹水(EAC)，用生理盐水稀释为约1～2×107个/ml，于昆明种小鼠右前肢腋窝皮下接种0.2ml/只，随机分为对照组和给药组，次日开始给药，隔日一次，共6次，给药方案见表2。在最后一次给药的次日，解剖取出肿瘤，称重，计算公式为：肿瘤抑制率=(1-T/C)×100%，T和C分别为给药组和对照组平均瘤重，统计学分析采用非配对样本t检验。
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表1 rhLT体外对人胃癌细胞MKN-45的细胞毒作用 rhLT浓度(μg/ml)
OD值(
±S)抑制率(%)
0
1.020±0.081
—
7.5×10-1
0.240±0.017
76.47
7.5×10-2
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0.253±0.031
75.20
7.5×10-3
0.567±0.081
44.41
7.5×10-4
0.957±0.042
6.18
7.5×10-5
1.003±0.081
1.17
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IC50=1.98×10-2μg/ml(γ=0.9589)表2 rhLT对小鼠S180实体瘤和小鼠Ehrlich氏实瘤的抑制作用 瘤源
组别
剂量
(μg/kg)
给药方案
(隔日一次)
动物数
动物体重(g)
瘤重(g)
抑制率
(%)
, 百拇医药
始
终
始
终
总
均(
±S)S180
对照组
PBS
iv×6
10
9
, http://www.100md.com
18.7
21.0
15.1
1.67±0.21
—
rhLT组
1000
iv×6
10
8
18.5
20.3
8.8
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1.10±0.21*
34.13
EC
对照组
PBS
iv×6
10
10
20.7
27.8
26.7
2.67±0.29
—
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rhLT组
1000
iv×6
10
10
20.7
25.2
17.6
1.76±0.21*
34.08
*表示与对照组比较P<0.01表3 rhLT对小鼠黑色素瘤B16肺转移抑制的作用 组别
剂量
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(μg/kg)
给药方案
(隔日一次)
动物数
动物体重(g)
肺结节数
抑制率
(%)
始
终
始
终
总
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均(
±S)对照组rhLT
PBS
iv×6
6
6
18.1
19.0
624
104.00±6.16
-
预防组rhLT
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1000
iv×6
6
6
17.9
19.2
433
72.17±5.49*
30.61
治疗组rhLT预防
1000
iv×6
6
, 百拇医药
6
18.5
18.9
253
42.17±6.43*
59.45
治疗组
1000
iv×12
6
6
18.2
19.0
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108
21.60±4.22*
79.23
*表示分别与其它3组比较P<0.01
1.6 rhLT对小鼠黑色素瘤B16肺转移的抑制作用[4]
取处于对数生长期的B16细胞，用含15%新生小牛血清的RPMI1640全培养基调整至5×105个/ml，无菌操作于C57BL/6小鼠尾静脉接种，0.2ml/只，随机分为4组，给药途径均为：小鼠尾静脉注射，隔日一次。每次给药体积均为0.5mg/20g，rhLT剂量为1000μg/kg。其中，对照组于接种后的次日起给予PBS，隔日一次，共6次；预防组于接种前的第11天起给予rhLT，隔日一次，共6次，即最后一次给药为接种的前一天；治疗组于接种后的次日起给予rhLT，隔日一次，共6次，即最后一次给药为接种后的第11天；预防治疗组于接种前的第11天起给予rhLT，隔日一次，共12次，即最后一次给药为接种后的第11天。在接种后的第21天，处死小鼠，解剖计肺叶上黑色结节数，统计学分析采用多样本均数两两比较的秩和检验。
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2 结果
2.1 体外MTT法测定结果
MTT法测定表明rhLT在一定浓度范围内，对一定浓度的MKN-45有较强的细胞毒作用，以抑制率和lgc进行相关线性回归，得到IC50=1.98×10-2μg/ml(γ=0.9589)，表明体外rhLT对MKN-45的细胞毒作用与其浓度其有很好的相关性(表1)。
2.2 体内研究结果
体内研究表明rhLT对小鼠S180实体瘤和小鼠Ehrlich氏实体瘤均有较强的抑作用，实验组平均瘤重与对照组相比有显著性差异(P<0.01)(表2)。
2.3 rhLT对小鼠黑色素瘤B16的肺转移的抑制作用
rlLT对B16的肺转移有很强的抑制作用，接种前给药的预防组，其抑制率便可达30.61%；而接种后给药的治疗组，其抑制率可增至59.45%，将近预防组的两倍；尤其是预防治疗组，其抑制效果最佳，将近80%。对各组的肺结节均数进行多样本均数两两比较的秩和检验表明以上3个给药组，分别与其它3个实验组相比均有显著性差异(P<0.01)(表3)。
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3 讨论
淋巴毒素是由抗原或有丝分裂原激活的淋巴细胞产生的一种淋巴因子，于1967年由Ruddle和Waksman在研究迟发性过敏反应(delayedhypersensitivity)时发现[5]。自从1984年Gray[6]等克隆了淋巴毒素的cDNA以来，研究工作更加深入。淋巴毒素存在可溶性的分泌型和膜结合型两种表达形式[7]，分泌到细胞外的可溶性形式为LTα，即基因工程领域通常所说的淋巴毒素，本文所用即是这种分泌型淋巴毒素，它是一个25kD的糖蛋白。作为机体免疫网络中的一种组成成份，LT有广泛和独特的生物学效应，主要表现在免疫调节，诱导分化，抗肿瘤作用，抗病毒作用和调节炎症反应中。这给它的抗肿瘤作用带来一定程度的独特性，但其抗肿瘤作用的研究结果报道不一[1，4]。
在本实验的体外研究中rhLT对人胃癌细胞MKN-45有较强的细胞毒作用，且这种细胞毒作用在不同批号的rhLT(结果未出示)和多次MTT重复实验中均有稳定的表现。但是在对rhLT体外抑瘤谱的研究中，除MKN-45以外，我们曾先后筛选了人源和鼠源共30余种肿瘤细胞株，均采用3种不同的细胞浓度和培养时间重复筛选，rhLT对这些细胞都没有显示明显的细胞毒作用。这与文献报道大体一致，但国外报道LT对其中少数肿瘤细胞是敏感的。分析原因有以下两个方面：一是本实验所用的rhLT是一种突变体，本身的结构功能不可能和LT原形以及其它作用所用的LT完全一样；二是本实验所采用的肿瘤细胞株大部分来源于国内，其亚型以及一些受体的表达和国外同名细胞株存在一些差异，因而可能造成对某些抗肿瘤药不敏感。
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体内研究结果表明rhLT对S180实体瘤和EC实体瘤有一定的抑制作用，但在体外实验中rhLT对这两种细胞株均无明显的细胞毒作用(结果未列出)，这与国外一些作者的实验结果相似。LT体内效果优于体外效果表明LT可能不是单纯地杀死肿瘤细胞，而可能是通过调动机体自身的免疫系统，借助免疫网络的调节来发挥作用[8，9]。这是LT抗肿瘤作用的独特性，也正因此，给LT的体内研究带来一定程度的困难。有作者对小鼠和裸鼠上的移植性肿瘤研究表明，当同基因小鼠和裸鼠移植上MethA肉瘤时，LT对前者移植瘤有显著的生长抑制作用，对后者移植瘤不管用什么给药途径，LT的抑制作用都相当小，只有加大LT剂量至前者的8～16倍时[4，10]方可取得相同的抑瘤效果。这说明LT的体内抗肿瘤作用需机体免疫系统的参与。
在对小鼠黑色素瘤B16的肺转移抑制作用的研究中，发现rhLT有着非常好的预防和治疗作用，目前国内还无此方面的报道，国外文献中也较少见。
, 百拇医药 参考文献
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收稿日期：1999-05-26；修回日期：1999-06-09, http://www.100md.com