地高辛标记的RNA探针原位杂交检测急性白血病多药耐药基因表达
作者：李晓 浦权 杨梅如 杨毅 陶英 石军 刘薏芝 金朝晖
单位：李晓 浦权 杨梅如 陶英 石军 刘薏芝 金朝晖 上海市第六人民医院血液科 邮政编码：上海市，200233；杨毅 上海医科大学儿科医院 上海医科大学儿科研究所(200032)
关键词：RNA探针；原位杂交；多药耐药基因；白血病
临床血液学杂志990401 摘要 目的：将简便可靠的非同位素原位杂交方法应用于急性白血病多药耐药基因(Mdr1)的临床检测。方法：自行构建RNA探针，经地高辛标记，直接在骨髓涂片上进行原位杂交，检测45例急性白血病骨髓细胞Mdr1 mRNA。对部分Mdr1高表达者调整临床治疗。结果：杂交信号清晰，重现性好。复治组中Mdr1阳性88.2%，初治组42.8%，差异有极显著性。经标准化疗2疗程后初治组中Mdr1阳性组完全缓解(CR)率22.2%，阴性组63.6%(P<0.001)。对Mdr1阳性病例调整化疗方案或加用逆转剂可改善预后。结论：Mdr1高表达确为白血病不良预后的主要指标。本方法操作简便，结果可靠，可用于急性白血病Mdr1常规检测，辅助临床治疗并及断预后。
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Detection of Mdr1 Gene Expression in Acute Leukemias in Situ Hybridization with Dig-labeled RNA Probe
Li Xiao,Pu Quan,Yang Meiru,et al
Department of Hematology,Sixth People′s Hospital,Shangahi,200233
Abstract Objective:To detect the Mdr1 gene in acute leuvemia .Method::Cytospins in situ hybridization(ISH) were performed with Dig-nick translated RNA probes.Result:The positive rate of Mdr1 expression in relapse and refractory patients was much more higher than that in initial cases(P<0.001).Complete remission rate was obviously lower in overexpression cases of the initial acute leukemia group.Better prognosis was obtained through modulation of remission inducer regimens or addition of reversal agents.Conclusion:Overexpression of Mdr1 mRNA is truly one of the important indication of poor prognosis in acute leukemias and the ISH method could be used satisfactorily in predicating clinical drug resistance and directing the rearrangement of chemotherapy regimens in view of its sensitivity and simple procedure.
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Key words RNA probe In situ hybridization Mdr1 Leukemia
多药耐药基因(Mdr1)过度表达是肿瘤临床耐药的主要原因。由于Mdr1编码的P糖蛋白(PGP)将细胞内药物泵出胞外，导致细胞内药物浓度降低而产生耐药〔1〕。此过程可被某些逆转剂逆转。以往检测Mdr1多采用逆转录-多聚酶链反应(Rt-PCR)方法较繁锁，需特殊仪器，难以推广。本文自行构建Mdr1 RNA探针，经地高辛标记，抗地高辛抗体-碱性磷酸酶NBT显色系统，直接在骨髓涂片上进行原位杂交，旨在建立一种简便可靠的检测Mdr1的方法，观察Mdr1表达与临床耐药的关系，并初步将检测结果用于指导化疗方案的制定与调整。
1 材料和方法
1.1 受试对象 急性白血病45例，均附合FAB诊断标准。初治组：28例，其中急性淋巴细胞白血病(ALL)7例，急性髓细胞白血病(AML)18例(M27例，M36例，M45例)，杂合型白血病(HAL)3例。复治组：17例(包括难治及复治病例)，其中ALL 3例，M2 7例，M4 5例，M3、M5各1例。
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1.2 材料和试剂 地高辛标记的RNA探针(170 BP)由本科与上海医科大学儿科研究所共同制备，蛋白酶K(E.Merck公司产品)，DIG、ISH、Kit(德国宝灵曼公司产品)。
1.3 操作步骤 探针制备：从本科室1位难治性ALL患者抽取骨髓细胞，提取RNA，经Rt～PCR获得一段特异的cDNA片段，将此片段克隆至PGEM4Z载体中，经DNA序列分析证明与文献报道一致〔2〕。然后采用地高辛(DIG)RNA标记试剂盒制备反义RNA探针。原位杂交；改良苏氏方法〔3〕，勿需分离骨髓有核细胞，检测直接在骨髓涂片上进行。冻存或新鲜标本风干后，4%多聚甲醛固定10 min，蛋白酶K(2 μg/ml)消化15 min(37℃)。4%多聚甲醛后固定5 min(以上各步骤间均用1×PBS-DEPC水洗片3 min×2)。乙醇系列梯度脱水(75%～95%～100%各1 min)。风干玻片，滴加含RNA探针(2 μg/ml)的杂交液30 μl，杂交6～12 h(42℃湿盒内)，取出玻片，2×SSC，0.2×SSC，0.1×SSC各洗片15 min×2次后，20%乙酸中浸泡15″，加缓冲液Ⅱ室温作用30 min后，抗地高辛抗体(1∶10000)作用2 h，缓冲液Ⅰ洗片15 min×2，滴加缓冲液Ⅲ稀释的显色液(每ml含NBT4.5 μl，BCIP 3.5 μl)，静置过夜，蒸镏水冲洗中止反应。结果判定：光学显微镜下观察RNA探针与Mdr1 mRNA之杂交信号为紫色细颗粒，定位于胞浆，此类细胞在全部有核细胞中>30%，判为阳性。阳性对照：采用探针制备时采髓病例之骨髓涂片按上述步骤操作作为阳性对照。上述阳性对照片操作中不加探针作为阴性对照。
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1.4 统计学处理 采用χ2检验
1.5 方案调整 对部分Mdr1高表达者在化疗方案中加用与MDR无关的药物或在化疗同时应用逆转剂，观察疗效。
2 结果
2.1 方法的可靠性 自行制备的RNA探针与探针制备时抽髓患者及其它大多数复治病例的骨髓涂片细胞行原位杂交，结果显示阳性，阳性信号清晰(见图1)。而阴性对照片和多数初治病例结果为阴性(见图2)同一病例的骨髓涂片多次杂交结果一致。
图1 一例难治性AML患者Mdr1阳性
见紫色细颗粒分布于胞浆(×1000)
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图2 一例初治ALL病例Mdr1阴性
骨髓细胞经伊红复染后未见阳性信号(×1000)
2.2 初治和复治组Mdr1的不同表达 初治组28例，Mdr1阳性12例，占42.8%。难治组17例，阳性15例，占88.2%。两组结果有极显著差异(P<0.001)。
2.3 Mdr1表达强度与临床疗效的关系 在可以评价疗效的初治病例中，Mdr1阳性者经2个疗程标准化疗方案后的完全缓鲜(CR)率22.2%(2/9例)。Mdr1阴性者CR率63.6%(7/11例)，P<0.001，部分缓解(PR)和未缓解(NR)率36.4%(4/11例)。
2.4 针对Mdr1高表达的方案调整 1例ALL患者入院时即Mdr1强阳性，经一疗程VDP方案后NR，及时加用与多药耐药无关的左旋门冬酰胺酶10000 U，qod，×10次，髓象达PR。另一M2b患者，入院时Mdr1阴性，经1疗程HA方案后Mdr1转阳性，髓象NR，及时改用含MDR无关去甲氧柔红霉素的IA方案，2疗程后髓象CR。对1例复发的M5患者，Mdr1持续阳性，化疗时同时加用MDR逆转剂异搏定80 mg，po,tid及丹参8支，静脉滴注，qd，出现Mdr1，阳性程度减弱和血象髓象部分改善。
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3 讨论
白血病细胞对化疗药物产生原始和继发性耐药是影响成功治疗的关键。在众多耐药机制中，Mdr1基因过度表达导致的多药耐药最为国内外学者所肯定〔4，5〕。在检测Mdr1/PGP水平的4种方法中，免疫细胞化学和斑点杂交的假阳性和假阴性率较高。Rt-PCR和原位杂交(ISH)敏感性高，特异性强〔6〕。鉴于Rt-PCR需特殊设备，且需结合与β2微球蛋白DNA比值行半定量分析，非同位素原位杂交至少具有以下优势：①操作简便。②可以从细胞水平观察Mdr1表达。③可根据阳性细胞百分率预测临床耐药。本工作采用自行构建的Mdr1探针直接在骨髓涂片上进行原位杂交，进一步省略了分离单个核细胞等步骤。由于采用RNA探针，杂交过程中不存在cDNA探针的自身复性，又因用乙酸浸泡去除了内源性碱性磷酸酶，避免了假阳性。较之光敏生物素标记的cDNA探针更特异、更敏感，阳性信号清晰，重现性好。
本工作测定结果与多数报道一致〔7，8〕，复治病例的Mdr1阳性率明显高于初治病例，提示复治病例可能通过：①由药物诱导产生获得性耐药或；②由原来少量的内在性耐药细胞经过化疗筛选成为优势克隆增殖，表现出耐药〔8〕。而在初治病例中，Mdr1低表达者CR高，反之则明显降低，证明Mdr1高表达确为化疗失败的主要原因。观察到Mdr1低表达者中部分(36.4%)不能CR，提示除Mdr1外尚有其它耐药机制(如MRP，TOPOⅡ等)〔9，10〕或白血病细胞的其它生物学特征影响临床耐药。
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Mdr1主要影响大分子脂溶性化学药物〔11〕，包括烷化剂、抗肿瘤抗生素、植物碱、激素等。某些逆转剂如钙通道阻滞剂、钙调蛋白拮抗剂等〔11〕，可竞争性抑制PGP与化疗药物结合，阻止药物外流从而提高细胞内药物浓度。对Mdr1高表达者，通过在化疗方案中换用或加用与MDR无关的药物或在化疗同时应用逆转剂增强化疗效果，改善预后，正是应用原位杂交技术检测急性白血病Mdr1水平的目的所在，我们的初步观察结果证实了这种可能性。
参考文献
1 Bradley G.Mechanism of drug resistance.Biochem Biophys Acta,1988,948:8～12
2 Chen CJ,Chin JE,Ueda K,et al.Internal duplication and homelogy with bacterial transport proteins in the Mdr1 (P-Glycoprotein) gene from multidrug-resistant human cells.Cell,1986,47:381～390
, 百拇医药
3 苏慧慈.原位杂交.北京：中国科学技术出版社，1994.149～153
4 Sato H,Presler H,Day R,et al.Mdr1 transcript level as an indication of resistant disease in acute myelogenous leukemia.Br J haematol,1990,75:340～349
5 Pirker R,Wallner J,Geisssler K,et al.Mdr1 gene expression and outcome in acute Myeloid leukemia.J NatI Cancer Inst,1991,83:708～715
6 Zhou DC,Maris JP,Suberville AM,et al.Relevance of Mdr1 gene expression in acute myeloid leukemia and comparision of different diagnostic methods.Leukemia,1992,6:879～883
, 百拇医药
7 Michieli M,Damiani D,Geromin,et al.Overexpression of multidrug resistance-associated P-glycoprotein in acute nonlymphocytic leukemia.Eur J haemotol,1992,48:8～13
8 竺香才，王荷碧，郭娟，等.急性髓细胞白血病患者多药耐药基因Mdr1表达的研究.中华血液学杂志，1995，12：642～644
9 Schneider E,Cowan KH,Bader H,et al.Increased expression of the multidrug resistance-associated protein gene in relapsed acute leukemia.Blood,1995,85:186～191
10 Kaufmann SH,Karp JE,Jones RJ,et al.Topoisomerase Ⅱ levels and drug sensitivity in adult myelogenous leukemia.Blood,1994,83:517～523
11 Gorge A.Clinical studies with modulation of multidrug resistance.Hematol Oncol Clin North Am,1995,9:363～363
(1998-10-08 收稿 1999-01-18 修回), 百拇医药
单位：李晓 浦权 杨梅如 陶英 石军 刘薏芝 金朝晖 上海市第六人民医院血液科 邮政编码：上海市，200233；杨毅 上海医科大学儿科医院 上海医科大学儿科研究所(200032)
关键词：RNA探针；原位杂交；多药耐药基因；白血病
临床血液学杂志990401 摘要 目的：将简便可靠的非同位素原位杂交方法应用于急性白血病多药耐药基因(Mdr1)的临床检测。方法：自行构建RNA探针，经地高辛标记，直接在骨髓涂片上进行原位杂交，检测45例急性白血病骨髓细胞Mdr1 mRNA。对部分Mdr1高表达者调整临床治疗。结果：杂交信号清晰，重现性好。复治组中Mdr1阳性88.2%，初治组42.8%，差异有极显著性。经标准化疗2疗程后初治组中Mdr1阳性组完全缓解(CR)率22.2%，阴性组63.6%(P<0.001)。对Mdr1阳性病例调整化疗方案或加用逆转剂可改善预后。结论：Mdr1高表达确为白血病不良预后的主要指标。本方法操作简便，结果可靠，可用于急性白血病Mdr1常规检测，辅助临床治疗并及断预后。
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Detection of Mdr1 Gene Expression in Acute Leukemias in Situ Hybridization with Dig-labeled RNA Probe
Li Xiao,Pu Quan,Yang Meiru,et al
Department of Hematology,Sixth People′s Hospital,Shangahi,200233
Abstract Objective:To detect the Mdr1 gene in acute leuvemia .Method::Cytospins in situ hybridization(ISH) were performed with Dig-nick translated RNA probes.Result:The positive rate of Mdr1 expression in relapse and refractory patients was much more higher than that in initial cases(P<0.001).Complete remission rate was obviously lower in overexpression cases of the initial acute leukemia group.Better prognosis was obtained through modulation of remission inducer regimens or addition of reversal agents.Conclusion:Overexpression of Mdr1 mRNA is truly one of the important indication of poor prognosis in acute leukemias and the ISH method could be used satisfactorily in predicating clinical drug resistance and directing the rearrangement of chemotherapy regimens in view of its sensitivity and simple procedure.
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Key words RNA probe In situ hybridization Mdr1 Leukemia
多药耐药基因(Mdr1)过度表达是肿瘤临床耐药的主要原因。由于Mdr1编码的P糖蛋白(PGP)将细胞内药物泵出胞外，导致细胞内药物浓度降低而产生耐药〔1〕。此过程可被某些逆转剂逆转。以往检测Mdr1多采用逆转录-多聚酶链反应(Rt-PCR)方法较繁锁，需特殊仪器，难以推广。本文自行构建Mdr1 RNA探针，经地高辛标记，抗地高辛抗体-碱性磷酸酶NBT显色系统，直接在骨髓涂片上进行原位杂交，旨在建立一种简便可靠的检测Mdr1的方法，观察Mdr1表达与临床耐药的关系，并初步将检测结果用于指导化疗方案的制定与调整。
1 材料和方法
1.1 受试对象 急性白血病45例，均附合FAB诊断标准。初治组：28例，其中急性淋巴细胞白血病(ALL)7例，急性髓细胞白血病(AML)18例(M27例，M36例，M45例)，杂合型白血病(HAL)3例。复治组：17例(包括难治及复治病例)，其中ALL 3例，M2 7例，M4 5例，M3、M5各1例。
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1.2 材料和试剂 地高辛标记的RNA探针(170 BP)由本科与上海医科大学儿科研究所共同制备，蛋白酶K(E.Merck公司产品)，DIG、ISH、Kit(德国宝灵曼公司产品)。
1.3 操作步骤 探针制备：从本科室1位难治性ALL患者抽取骨髓细胞，提取RNA，经Rt～PCR获得一段特异的cDNA片段，将此片段克隆至PGEM4Z载体中，经DNA序列分析证明与文献报道一致〔2〕。然后采用地高辛(DIG)RNA标记试剂盒制备反义RNA探针。原位杂交；改良苏氏方法〔3〕，勿需分离骨髓有核细胞，检测直接在骨髓涂片上进行。冻存或新鲜标本风干后，4%多聚甲醛固定10 min，蛋白酶K(2 μg/ml)消化15 min(37℃)。4%多聚甲醛后固定5 min(以上各步骤间均用1×PBS-DEPC水洗片3 min×2)。乙醇系列梯度脱水(75%～95%～100%各1 min)。风干玻片，滴加含RNA探针(2 μg/ml)的杂交液30 μl，杂交6～12 h(42℃湿盒内)，取出玻片，2×SSC，0.2×SSC，0.1×SSC各洗片15 min×2次后，20%乙酸中浸泡15″，加缓冲液Ⅱ室温作用30 min后，抗地高辛抗体(1∶10000)作用2 h，缓冲液Ⅰ洗片15 min×2，滴加缓冲液Ⅲ稀释的显色液(每ml含NBT4.5 μl，BCIP 3.5 μl)，静置过夜，蒸镏水冲洗中止反应。结果判定：光学显微镜下观察RNA探针与Mdr1 mRNA之杂交信号为紫色细颗粒，定位于胞浆，此类细胞在全部有核细胞中>30%，判为阳性。阳性对照：采用探针制备时采髓病例之骨髓涂片按上述步骤操作作为阳性对照。上述阳性对照片操作中不加探针作为阴性对照。
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1.4 统计学处理 采用χ2检验
1.5 方案调整 对部分Mdr1高表达者在化疗方案中加用与MDR无关的药物或在化疗同时应用逆转剂，观察疗效。
2 结果
2.1 方法的可靠性 自行制备的RNA探针与探针制备时抽髓患者及其它大多数复治病例的骨髓涂片细胞行原位杂交，结果显示阳性，阳性信号清晰(见图1)。而阴性对照片和多数初治病例结果为阴性(见图2)同一病例的骨髓涂片多次杂交结果一致。
图1 一例难治性AML患者Mdr1阳性
见紫色细颗粒分布于胞浆(×1000)
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图2 一例初治ALL病例Mdr1阴性
骨髓细胞经伊红复染后未见阳性信号(×1000)
2.2 初治和复治组Mdr1的不同表达 初治组28例，Mdr1阳性12例，占42.8%。难治组17例，阳性15例，占88.2%。两组结果有极显著差异(P<0.001)。
2.3 Mdr1表达强度与临床疗效的关系 在可以评价疗效的初治病例中，Mdr1阳性者经2个疗程标准化疗方案后的完全缓鲜(CR)率22.2%(2/9例)。Mdr1阴性者CR率63.6%(7/11例)，P<0.001，部分缓解(PR)和未缓解(NR)率36.4%(4/11例)。
2.4 针对Mdr1高表达的方案调整 1例ALL患者入院时即Mdr1强阳性，经一疗程VDP方案后NR，及时加用与多药耐药无关的左旋门冬酰胺酶10000 U，qod，×10次，髓象达PR。另一M2b患者，入院时Mdr1阴性，经1疗程HA方案后Mdr1转阳性，髓象NR，及时改用含MDR无关去甲氧柔红霉素的IA方案，2疗程后髓象CR。对1例复发的M5患者，Mdr1持续阳性，化疗时同时加用MDR逆转剂异搏定80 mg，po,tid及丹参8支，静脉滴注，qd，出现Mdr1，阳性程度减弱和血象髓象部分改善。
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3 讨论
白血病细胞对化疗药物产生原始和继发性耐药是影响成功治疗的关键。在众多耐药机制中，Mdr1基因过度表达导致的多药耐药最为国内外学者所肯定〔4，5〕。在检测Mdr1/PGP水平的4种方法中，免疫细胞化学和斑点杂交的假阳性和假阴性率较高。Rt-PCR和原位杂交(ISH)敏感性高，特异性强〔6〕。鉴于Rt-PCR需特殊设备，且需结合与β2微球蛋白DNA比值行半定量分析，非同位素原位杂交至少具有以下优势：①操作简便。②可以从细胞水平观察Mdr1表达。③可根据阳性细胞百分率预测临床耐药。本工作采用自行构建的Mdr1探针直接在骨髓涂片上进行原位杂交，进一步省略了分离单个核细胞等步骤。由于采用RNA探针，杂交过程中不存在cDNA探针的自身复性，又因用乙酸浸泡去除了内源性碱性磷酸酶，避免了假阳性。较之光敏生物素标记的cDNA探针更特异、更敏感，阳性信号清晰，重现性好。
本工作测定结果与多数报道一致〔7，8〕，复治病例的Mdr1阳性率明显高于初治病例，提示复治病例可能通过：①由药物诱导产生获得性耐药或；②由原来少量的内在性耐药细胞经过化疗筛选成为优势克隆增殖，表现出耐药〔8〕。而在初治病例中，Mdr1低表达者CR高，反之则明显降低，证明Mdr1高表达确为化疗失败的主要原因。观察到Mdr1低表达者中部分(36.4%)不能CR，提示除Mdr1外尚有其它耐药机制(如MRP，TOPOⅡ等)〔9，10〕或白血病细胞的其它生物学特征影响临床耐药。
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Mdr1主要影响大分子脂溶性化学药物〔11〕，包括烷化剂、抗肿瘤抗生素、植物碱、激素等。某些逆转剂如钙通道阻滞剂、钙调蛋白拮抗剂等〔11〕，可竞争性抑制PGP与化疗药物结合，阻止药物外流从而提高细胞内药物浓度。对Mdr1高表达者，通过在化疗方案中换用或加用与MDR无关的药物或在化疗同时应用逆转剂增强化疗效果，改善预后，正是应用原位杂交技术检测急性白血病Mdr1水平的目的所在，我们的初步观察结果证实了这种可能性。
参考文献
1 Bradley G.Mechanism of drug resistance.Biochem Biophys Acta,1988,948:8～12
2 Chen CJ,Chin JE,Ueda K,et al.Internal duplication and homelogy with bacterial transport proteins in the Mdr1 (P-Glycoprotein) gene from multidrug-resistant human cells.Cell,1986,47:381～390
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3 苏慧慈.原位杂交.北京：中国科学技术出版社，1994.149～153
4 Sato H,Presler H,Day R,et al.Mdr1 transcript level as an indication of resistant disease in acute myelogenous leukemia.Br J haematol,1990,75:340～349
5 Pirker R,Wallner J,Geisssler K,et al.Mdr1 gene expression and outcome in acute Myeloid leukemia.J NatI Cancer Inst,1991,83:708～715
6 Zhou DC,Maris JP,Suberville AM,et al.Relevance of Mdr1 gene expression in acute myeloid leukemia and comparision of different diagnostic methods.Leukemia,1992,6:879～883
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7 Michieli M,Damiani D,Geromin,et al.Overexpression of multidrug resistance-associated P-glycoprotein in acute nonlymphocytic leukemia.Eur J haemotol,1992,48:8～13
8 竺香才，王荷碧，郭娟，等.急性髓细胞白血病患者多药耐药基因Mdr1表达的研究.中华血液学杂志，1995，12：642～644
9 Schneider E,Cowan KH,Bader H,et al.Increased expression of the multidrug resistance-associated protein gene in relapsed acute leukemia.Blood,1995,85:186～191
10 Kaufmann SH,Karp JE,Jones RJ,et al.Topoisomerase Ⅱ levels and drug sensitivity in adult myelogenous leukemia.Blood,1994,83:517～523
11 Gorge A.Clinical studies with modulation of multidrug resistance.Hematol Oncol Clin North Am,1995,9:363～363
(1998-10-08 收稿 1999-01-18 修回), 百拇医药