肝脏星形细胞系的建立及其应用
作者：朱永红 胡大荣
单位：第三军医大学西南医院全军传染病专科中心 重庆市 400038
关键词：肝/细胞学；星形细胞；细胞，培养的；细胞株
世界华人消化杂志990423
Subject headings liver/cytology; stellate cell; cells, cultured; cell lines
中国图书资料分类号 R329.2
肝脏星形细胞(hepatic stellate cells, HSCs)，又称为储脂细胞(fat-storing cells, FSCs)、Ito细胞、窦周脂肪细胞(persinusoidal lipocytes)、储存维生素A细胞(vitamin A-storing cells)及肝脏特异性周皮细胞(liver-specific pericytes)等，是肝脏的一种非实质细胞. 该细胞位于Disse隙内，围绕在肝窦周围，其主要生理功能为摄取并储存维生素A. 目前一致认为，激活的HSC为肝纤维化时产生各种细胞外基质(ECM)成分的主要细胞群[1，2]. 此外，激活的HSC还可能在门静脉高压的形成中发挥着重要作用[3，4]. 对HSC的功能特点及其激活调控机制的研究已成为近年来肝纤维化发生机制及抗肝纤维化药物研究中的热点之一. 自从1982年Knook et al建立起大鼠HSC的分离纯化方法以来，有关HSC的研究取得了突破性进展. 但由于HSC分离纯化的方法繁杂，且产量低，在分离人HSC时，尚存在标本来源困难的问题，这些均给研究工作带来了很大困难. 因此，不少学者试图通过建立HSC的细胞系来代替每次实验时需重新分离的HSC，满足实验中对HSC的大量需求.
, 百拇医药
1 正常HSC的常规分离、鉴定及培养
1.1 HSC的分离 HSC约占肝脏非实质细胞总数的5%～10%[5]或约占肝细胞数的3.6%～6%，后者又称为肝脏HSC指数[1]. 大鼠、小鼠及人HSC的分离方法相似，其分离纯化主要分两步进行. 第1步为从肝组织中获得肝脏非实质细胞. 一般采用链霉蛋白酶(pronase)和胶原酶合并消化法. 链霉蛋白酶能选择性破坏肝细胞，减少肝细胞对HSC的粘附，从而提高HSC的产量. 第2步为从肝脏非实质细胞中分离出HSC. 一般采用不连续密度梯度离心进行分离. 由于HSC富含脂滴，其平均密度在所有肝脏细胞中最低，采用合适的密度梯度进行离心，可使获得的HSC纯度达97%以上. 常用的密度梯度递质有Nycodenz，Metrizamide，Percoll及Stractan等. 此外，也有采用离心淘析(centrifugal elutriation)或流式细胞仪技术来分离HSC的. 由于HSC在肝脏中的总量不多，不管采用何种分离技术，HSC的最终产量均不是很高，从1×106/g肝组织至3×106/g肝组织不等[5].
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1.2 HSC的鉴定及培养 光镜下观察，刚从正常大鼠肝脏中分离的单个HSC很像一串葡萄，据此特点能很容易地将其与混杂的肝窦内皮细胞及Kupffer细胞相区别，这一特点可能与HSC胞质中富含脂滴有关. 透射电镜下观察，HSC的细胞轮廓不规则，具有较多突起，胞质中含有大量脂滴. 荧光显微镜下观察，胞质中脂质在波长为328nm的紫外光激发下呈现典型的自发荧光. 免疫组化染色显示，胞质中结蛋白(desmin)表达阳性，α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达阴性. 将分离的HSC接种培养，24h内细胞即贴壁并生长，48h后，细胞伸展已非常显著，细胞变扁，直径增加3～5倍，呈现星形外观，显微镜下见脂滴围绕在细胞核周围，在胞质周围可见明显的细胞骨架，表现为大量纤维束. 培养3d～4d后，细胞进一步伸展，直径进一步增大，核/浆比例变小，细胞突起宽而扁. 随着培养时间的延长，胞质中脂滴及维生素A荧光强度逐渐降低，结蛋白表达增加. 培养7d～10d时，α-SMA表达阳性，传代后α-SMA表达均阳性，此时细胞转化为肌纤维母细胞样细胞(myofibroblast-like cells, MFBLCs). 在传代培养过程中，HSC均保持MFBLC的特征，这些特征包括：①胞质突起长；②出现应力纤维(stress fiber)；③一至二个核仁；④粗面内质网扩张，嵴的数量增加；⑤出现低密度分散的核染色质；⑥脂滴数量减少或脂滴消失；⑦α-SMA表达阳性；⑧合成胶原蛋白等ECM成分增加；⑨获得收缩性[3，6-8]. 对人肝HSC进行鉴定及培养研究发现，人HSC与大鼠HSC具有相似的形态学、标志物及培养生长特点[9].
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2 各种HSC细胞系的建立及其特点
2.1 来源于大鼠的HSC细胞系 1991年，美国的Greenwel et al[10]从正常及CCl4诱发的肝硬变大鼠中分离出HSC，分别进行培养，细胞自发地获得了永生性(immortalization)，由此获得了2个HSC细胞系，分别命名为NFSC及CFSC. 对这2个细胞系传代培养30代以上，其生长特性及表达ECM成分的特性均保持稳定，细胞冻存后复苏培养，其特点保持不变. 这2个细胞系除了不表达Ⅳ型胶原外，其余特点均与原代培养后期及传代的HSC相似.
2.2 来源于小鼠的HSC细胞系 1997年，日本的Kitamura et al[11]采用SV40的温度敏感突变体tsA640转化小鼠HSC，获得了一个小鼠HSC的细胞系，命名为A640-IS. 该细胞系在不同温度下展示出不同的功能特点. 当培养温度为33℃时，A640-IS表达大T抗原(large T antigen)，此时，细胞生长旺盛. 而当培养温度为39℃时，大T抗原表达受抑制，此时细胞不发生增殖，但若将温度从39℃降为33℃，细胞又开始增殖并表达大T抗原. 这一特点提示A640-IS细胞的生长及大T抗原的表达具有温度敏感性. 形态学观察发现，A640-IS细胞在33℃时类似成纤维细胞，在39℃时与HSC相似，为星形形态. 油红染色可见A640-IS胞质内含有脂滴，荧光显微镜观察，这些脂滴中显示维生素A荧光. 当培养温度从33℃增加到39℃时，脂滴数量及维生素A荧光强度均增加. 与HSC一样，A640-IS也表达Ⅰ，Ⅲ及Ⅳ型胶原，纤维连接蛋白(FN)及板层素(LM)也易于在胞质中检出. 免疫印迹分析发现，A640-IS经TGF-β1剌激后，Ⅲ型胶原、FN及LM表达出现少量增加. 对HSC激活标志物α-SMA进行检测发现，A640-IS也表达α-SMA，但在39℃时，α-SMA的表达呈密度依赖性，高密度培养时，α-SMA表达停止. 使用A640-IS具有两大优点：①由于该细胞系在33℃时生长旺盛，可在此条件下获得足够的细胞数量；②在39℃时，该细胞系具有HSC的功能及形态特点. 可在此温度下对HSC的功能及分化特点加以研究. 由于A640-IS的许多功能及生长特性似乎受到大T抗原的调节，因此，该细胞系有可能成为研究HSC分化及功能的非常有用的模型.
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2.3 来源于人的HSC细胞系
2.3.1 来源于肝脏非实质细胞肿瘤的HSC细胞系 该细胞系(命 名为L190)来源于1名55岁的女性患者，在对该患者行胆囊切除术时发现其患有肝脏间充质肿瘤，根据该肿瘤的组织病理学特点，将其诊断为上皮样血管内皮瘤(epithelioid hemangioendothelioma). 对该肿瘤细胞进行原代培养发现，胞体较大，为多角形及纺锤形. 传代培养5～7代时，细胞形态以多角形为主，胞质丰富，胞质中富含纤维丝，细胞核呈卵圆形. 当细胞继续增殖时，可形成多细胞结节，过度融合时，可形成“山和谷”(hills-and-valleys)样结构. L190在体外传代培养30代以上，其在含10%胎牛血清的培养递质中的倍增时间约为60h. 免疫组化研究发现，L190能表达α-SMA及多种结缔组织成分如Ⅰ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ,Ⅵ型胶原以及FN和LM，但缺乏单核巨噬细胞及内皮细胞标志. 在含维生素A的培养液中，L190胞质中也形成脂肪滴，并呈现维生素A荧光. 此外，将L190细胞免疫小鼠，获得了3株单克隆抗体(mAb)，这3株mAb均能与人肝脏组织中的HSC发生特异性反应. 对含7×105个噬菌体克隆的人肝脏cDNA文库进行免疫筛选，发现与这3株mAb发生反应的抗原为腱蛋白(tenascin)，这提示L190细胞为腱蛋白的丰富来源. L190细胞的上述形态及功能特点提示该细胞系来源于HSC[12]. L190的建立为研究人HSC的生物学功能提供了一个有用的细胞模型.
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2.3.2 转染获得的人HSC细胞系 最近，法国的Weil et al[13]将含多瘤病毒大T抗原编码序列的质粒CMVLT2转染人肝MFBLC，转染2d后用胰蛋白酶消化，低密度(200个细胞/cm2)接种，选取具有生长优势的细胞继续传代培养，由此获得了一个具有活跃生长能力的细胞系，命名为GREF-X. 对GREF-X进行检测发现，该细胞系并不表达大T抗原，但该细胞系已连续传代近1a，提示该细胞系已具有永生性. GREF-X的形态学与原代培养的人肝MFBLC相似，其倍增时间约为72h，细胞生长具有血清依赖性. 将GREF-X接种裸鼠，未能诱导肿瘤形成，提示该细胞系未发生转化. GREF-X能表达MFBLC的标志物如α-SMA及波形蛋白(vimentin)，以及表达各种ECM成分如Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅵ型胶原、FN及LM等，还能摄取维生素A并使之发生酯化，这些均提示GREF-X来源于HSC. 此外，GREF-X在TGF-β1剌激下，FN及Ⅰ型纤溶酶激活物抑制剂的分泌增加，这与正常HSC相似. 由于GREF-X并不表达大T抗原，因此其永生性的获得可能系培养过程中自发形成的结果. 采用相同的转染方法，Weil et al同时从另一分离的人肝MFBLC中获得了另一个细胞系，命名为GREF-Y，但未对其进行细致鉴定.
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3 HSC细胞系的应用
由于建立的HSC细胞系具有与HSC相似的形态学及功能特点，因此可作为进行HSC基因表达调控、抗纤维化药物作用及肝纤维化发生机制等研究的理想细胞模型. 到目前为止，采用HSC细胞系的应用研究尚不多. 最近，Hernandez-Munoz et al[14]采用Greenwel et al建立的大鼠HSC细胞系CFSC，研究了G蛋白在TNFα抑制胶原基因表达中的作用. 结果发现，TNF-α抑制胶原基因表达的作用可能是通过百日咳毒素敏感性G蛋白介导的，而鞘磷脂/神经酰胺可能为其细胞内信号传导通路. 研究还发现，多种药物对CFSCⅠ型胶原基因表达的影响与这些药物对常规分离培养的正常大鼠HSC的作用相似，这进一步提示HSC细胞系可作为HSC的替代细胞模型.
4 展望
虽然HSC细胞系可作为常规分离培养的HSC的理想替代细胞模型，但与刚分离的HSC相比，尚存在一定不足，不能完全取代HSC的重新分离与培养. 由于目前所建立的HSC细胞系多为从正常、纤维化肝脏中分离出HSC进行转染或多次传代培养以及对HSC来源的肿瘤细胞进行传代培养后所获得，这些细胞系均已获得了永生性，其表型类似MFBLC的表型，而且这种表型往往不能逆转，只能在一定程度上进行调节，因此在对静息的HSC的功能特别是对HSC活化的机制进行研究时，尚需从肝脏中重新分离HSC供研究之用. 尽管如此，HSC细胞系的建立仍将对HSC的细胞学研究特别是对针对HSC的抗纤维化药物研究产生较大的推动作用. 随着时间的推移，HSC细胞系将会得到越来越广泛的作用，更多的HSC细胞系将会被建立.
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通讯作者 朱永红
5 参考文献
[1] Gressner AM, Bachem MG. Molecular mechanisms of liver fibrogenesis-A homage to the role of activated fat-storing cells. Digestion, 1995;56:335-346
[2] Friedman SL. Molecular mechanisms of hepatic fibrosis and principles of therapy. J Gastroenterol, 1997;32:424-430
[3] 朱永红，聂青和. 储脂细胞与肝脏循环. 国外医学流行病学传染病学分册，1998；25：17-20
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[4] Bissell DM. Hepatic fibrosis as wound repair: a progress report. J Gastroenterol, 1998;33:295-302
[5] Alpini G, Phillips JO, Vroman B, Larusso NF. Recent advances in the isolation of liver cells. Hepatology, 1994;20:494-514
[6] De Leeuw AM, McCarthy SP, Geerts A, Knook DL. Purified rat liver fat-storing cells in culture divide and contain collagen. Hepatology, 1984;4:392-403
[7] Tsutsumi M, Takasa A, Takase S. Characterization of desmin-positive rat liver sinusoidal cells. Hepatology, 1987;7:277-284
, 百拇医药
[8] Bachem MG, Meyer D, Schafer W, Riess U, Melchior R, Sell KM, Gressner AM. The response of rat liver perisinusoidal lipocytes to polypeptide growth regulator changes with their transdifferentiation into myofibroblast-like cells in culture. J Hepatol, 1993;18:40-52
[9] Friedman SL, Rockey DC, McGuire RF, Maher JJ, Boyles JK, Yamasaki G. Isolated hepatic lipocytes and Kupffer cells from normal human liver: morphological and functional characteristics in primary culture. Hepatology, 1992;15:234-243
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[10] Greenwel P, Schwartz M, Rossas M, Peyrol S, Grimaud JA, Rojkind M. Characterization of fat-storing cell lines derived form normal and CCl4-cirrhotic livers. Lab Invest, 1991;65:644-653
[11] Kitamura Y, Tanigawa T, Katsumoto T, Tomita T, Wang HR, Hirai K, Ichihara K, Terada T. Cell growth and differentiation of a novel mouse Ito (fat-storing) cell line transformed by a temperature-sensitive mutant of simian virus 40. Hepatology, 1997;26:323-329
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[12] Murakami K, Abe T, Miyazawa M, Yamaguchi M, Masuda T, Matsuura T, Nagamori S, Takeuchi K, Abe K, Kyogoku M. Establishment of a new human cell line, L190, exhibiting characteristics of hepatic Ito (fat-storing) cells. Lab Invest, 1995;72:731-739
[13] Weil FX, Blazejewski S, Blanc JF, Huet S, Gauthier JM, Neaud V, Olaso E, Dubuisson L, Azais-Braesco V, Vidal-Vanaclocha F, Balabaud C, Bioulac-sage P, Rosenbaum J. Characterization of a new human liver myofibroblast cell line: transcriptional regulation of plasminogen activator inhibitor type Ⅰ by transforming growth factor β1. Lab Invest, 1997;77:63-70
[14] Hernandez-Munoz I, Torre PDL, Sanchez-Alcazar JA, Garcia I, Santiago E, Munoz-Yague MT, Solis-Herruzo JA. Tumor necrosis factor α inhibits collagen α1 (Ⅰ) gene expression in rat hepatic stellate cells through a G protein. Gastroenterology, 1997;113:625-640
收稿日期 1998-08-27 修回日期 1999-01-04, http://www.100md.com
单位：第三军医大学西南医院全军传染病专科中心 重庆市 400038
关键词：肝/细胞学；星形细胞；细胞，培养的；细胞株
世界华人消化杂志990423
Subject headings liver/cytology; stellate cell; cells, cultured; cell lines
中国图书资料分类号 R329.2
肝脏星形细胞(hepatic stellate cells, HSCs)，又称为储脂细胞(fat-storing cells, FSCs)、Ito细胞、窦周脂肪细胞(persinusoidal lipocytes)、储存维生素A细胞(vitamin A-storing cells)及肝脏特异性周皮细胞(liver-specific pericytes)等，是肝脏的一种非实质细胞. 该细胞位于Disse隙内，围绕在肝窦周围，其主要生理功能为摄取并储存维生素A. 目前一致认为，激活的HSC为肝纤维化时产生各种细胞外基质(ECM)成分的主要细胞群[1，2]. 此外，激活的HSC还可能在门静脉高压的形成中发挥着重要作用[3，4]. 对HSC的功能特点及其激活调控机制的研究已成为近年来肝纤维化发生机制及抗肝纤维化药物研究中的热点之一. 自从1982年Knook et al建立起大鼠HSC的分离纯化方法以来，有关HSC的研究取得了突破性进展. 但由于HSC分离纯化的方法繁杂，且产量低，在分离人HSC时，尚存在标本来源困难的问题，这些均给研究工作带来了很大困难. 因此，不少学者试图通过建立HSC的细胞系来代替每次实验时需重新分离的HSC，满足实验中对HSC的大量需求.
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1 正常HSC的常规分离、鉴定及培养
1.1 HSC的分离 HSC约占肝脏非实质细胞总数的5%～10%[5]或约占肝细胞数的3.6%～6%，后者又称为肝脏HSC指数[1]. 大鼠、小鼠及人HSC的分离方法相似，其分离纯化主要分两步进行. 第1步为从肝组织中获得肝脏非实质细胞. 一般采用链霉蛋白酶(pronase)和胶原酶合并消化法. 链霉蛋白酶能选择性破坏肝细胞，减少肝细胞对HSC的粘附，从而提高HSC的产量. 第2步为从肝脏非实质细胞中分离出HSC. 一般采用不连续密度梯度离心进行分离. 由于HSC富含脂滴，其平均密度在所有肝脏细胞中最低，采用合适的密度梯度进行离心，可使获得的HSC纯度达97%以上. 常用的密度梯度递质有Nycodenz，Metrizamide，Percoll及Stractan等. 此外，也有采用离心淘析(centrifugal elutriation)或流式细胞仪技术来分离HSC的. 由于HSC在肝脏中的总量不多，不管采用何种分离技术，HSC的最终产量均不是很高，从1×106/g肝组织至3×106/g肝组织不等[5].
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1.2 HSC的鉴定及培养 光镜下观察，刚从正常大鼠肝脏中分离的单个HSC很像一串葡萄，据此特点能很容易地将其与混杂的肝窦内皮细胞及Kupffer细胞相区别，这一特点可能与HSC胞质中富含脂滴有关. 透射电镜下观察，HSC的细胞轮廓不规则，具有较多突起，胞质中含有大量脂滴. 荧光显微镜下观察，胞质中脂质在波长为328nm的紫外光激发下呈现典型的自发荧光. 免疫组化染色显示，胞质中结蛋白(desmin)表达阳性，α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达阴性. 将分离的HSC接种培养，24h内细胞即贴壁并生长，48h后，细胞伸展已非常显著，细胞变扁，直径增加3～5倍，呈现星形外观，显微镜下见脂滴围绕在细胞核周围，在胞质周围可见明显的细胞骨架，表现为大量纤维束. 培养3d～4d后，细胞进一步伸展，直径进一步增大，核/浆比例变小，细胞突起宽而扁. 随着培养时间的延长，胞质中脂滴及维生素A荧光强度逐渐降低，结蛋白表达增加. 培养7d～10d时，α-SMA表达阳性，传代后α-SMA表达均阳性，此时细胞转化为肌纤维母细胞样细胞(myofibroblast-like cells, MFBLCs). 在传代培养过程中，HSC均保持MFBLC的特征，这些特征包括：①胞质突起长；②出现应力纤维(stress fiber)；③一至二个核仁；④粗面内质网扩张，嵴的数量增加；⑤出现低密度分散的核染色质；⑥脂滴数量减少或脂滴消失；⑦α-SMA表达阳性；⑧合成胶原蛋白等ECM成分增加；⑨获得收缩性[3，6-8]. 对人肝HSC进行鉴定及培养研究发现，人HSC与大鼠HSC具有相似的形态学、标志物及培养生长特点[9].
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2 各种HSC细胞系的建立及其特点
2.1 来源于大鼠的HSC细胞系 1991年，美国的Greenwel et al[10]从正常及CCl4诱发的肝硬变大鼠中分离出HSC，分别进行培养，细胞自发地获得了永生性(immortalization)，由此获得了2个HSC细胞系，分别命名为NFSC及CFSC. 对这2个细胞系传代培养30代以上，其生长特性及表达ECM成分的特性均保持稳定，细胞冻存后复苏培养，其特点保持不变. 这2个细胞系除了不表达Ⅳ型胶原外，其余特点均与原代培养后期及传代的HSC相似.
2.2 来源于小鼠的HSC细胞系 1997年，日本的Kitamura et al[11]采用SV40的温度敏感突变体tsA640转化小鼠HSC，获得了一个小鼠HSC的细胞系，命名为A640-IS. 该细胞系在不同温度下展示出不同的功能特点. 当培养温度为33℃时，A640-IS表达大T抗原(large T antigen)，此时，细胞生长旺盛. 而当培养温度为39℃时，大T抗原表达受抑制，此时细胞不发生增殖，但若将温度从39℃降为33℃，细胞又开始增殖并表达大T抗原. 这一特点提示A640-IS细胞的生长及大T抗原的表达具有温度敏感性. 形态学观察发现，A640-IS细胞在33℃时类似成纤维细胞，在39℃时与HSC相似，为星形形态. 油红染色可见A640-IS胞质内含有脂滴，荧光显微镜观察，这些脂滴中显示维生素A荧光. 当培养温度从33℃增加到39℃时，脂滴数量及维生素A荧光强度均增加. 与HSC一样，A640-IS也表达Ⅰ，Ⅲ及Ⅳ型胶原，纤维连接蛋白(FN)及板层素(LM)也易于在胞质中检出. 免疫印迹分析发现，A640-IS经TGF-β1剌激后，Ⅲ型胶原、FN及LM表达出现少量增加. 对HSC激活标志物α-SMA进行检测发现，A640-IS也表达α-SMA，但在39℃时，α-SMA的表达呈密度依赖性，高密度培养时，α-SMA表达停止. 使用A640-IS具有两大优点：①由于该细胞系在33℃时生长旺盛，可在此条件下获得足够的细胞数量；②在39℃时，该细胞系具有HSC的功能及形态特点. 可在此温度下对HSC的功能及分化特点加以研究. 由于A640-IS的许多功能及生长特性似乎受到大T抗原的调节，因此，该细胞系有可能成为研究HSC分化及功能的非常有用的模型.
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2.3 来源于人的HSC细胞系
2.3.1 来源于肝脏非实质细胞肿瘤的HSC细胞系 该细胞系(命 名为L190)来源于1名55岁的女性患者，在对该患者行胆囊切除术时发现其患有肝脏间充质肿瘤，根据该肿瘤的组织病理学特点，将其诊断为上皮样血管内皮瘤(epithelioid hemangioendothelioma). 对该肿瘤细胞进行原代培养发现，胞体较大，为多角形及纺锤形. 传代培养5～7代时，细胞形态以多角形为主，胞质丰富，胞质中富含纤维丝，细胞核呈卵圆形. 当细胞继续增殖时，可形成多细胞结节，过度融合时，可形成“山和谷”(hills-and-valleys)样结构. L190在体外传代培养30代以上，其在含10%胎牛血清的培养递质中的倍增时间约为60h. 免疫组化研究发现，L190能表达α-SMA及多种结缔组织成分如Ⅰ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ,Ⅵ型胶原以及FN和LM，但缺乏单核巨噬细胞及内皮细胞标志. 在含维生素A的培养液中，L190胞质中也形成脂肪滴，并呈现维生素A荧光. 此外，将L190细胞免疫小鼠，获得了3株单克隆抗体(mAb)，这3株mAb均能与人肝脏组织中的HSC发生特异性反应. 对含7×105个噬菌体克隆的人肝脏cDNA文库进行免疫筛选，发现与这3株mAb发生反应的抗原为腱蛋白(tenascin)，这提示L190细胞为腱蛋白的丰富来源. L190细胞的上述形态及功能特点提示该细胞系来源于HSC[12]. L190的建立为研究人HSC的生物学功能提供了一个有用的细胞模型.
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2.3.2 转染获得的人HSC细胞系 最近，法国的Weil et al[13]将含多瘤病毒大T抗原编码序列的质粒CMVLT2转染人肝MFBLC，转染2d后用胰蛋白酶消化，低密度(200个细胞/cm2)接种，选取具有生长优势的细胞继续传代培养，由此获得了一个具有活跃生长能力的细胞系，命名为GREF-X. 对GREF-X进行检测发现，该细胞系并不表达大T抗原，但该细胞系已连续传代近1a，提示该细胞系已具有永生性. GREF-X的形态学与原代培养的人肝MFBLC相似，其倍增时间约为72h，细胞生长具有血清依赖性. 将GREF-X接种裸鼠，未能诱导肿瘤形成，提示该细胞系未发生转化. GREF-X能表达MFBLC的标志物如α-SMA及波形蛋白(vimentin)，以及表达各种ECM成分如Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅵ型胶原、FN及LM等，还能摄取维生素A并使之发生酯化，这些均提示GREF-X来源于HSC. 此外，GREF-X在TGF-β1剌激下，FN及Ⅰ型纤溶酶激活物抑制剂的分泌增加，这与正常HSC相似. 由于GREF-X并不表达大T抗原，因此其永生性的获得可能系培养过程中自发形成的结果. 采用相同的转染方法，Weil et al同时从另一分离的人肝MFBLC中获得了另一个细胞系，命名为GREF-Y，但未对其进行细致鉴定.
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3 HSC细胞系的应用
由于建立的HSC细胞系具有与HSC相似的形态学及功能特点，因此可作为进行HSC基因表达调控、抗纤维化药物作用及肝纤维化发生机制等研究的理想细胞模型. 到目前为止，采用HSC细胞系的应用研究尚不多. 最近，Hernandez-Munoz et al[14]采用Greenwel et al建立的大鼠HSC细胞系CFSC，研究了G蛋白在TNFα抑制胶原基因表达中的作用. 结果发现，TNF-α抑制胶原基因表达的作用可能是通过百日咳毒素敏感性G蛋白介导的，而鞘磷脂/神经酰胺可能为其细胞内信号传导通路. 研究还发现，多种药物对CFSCⅠ型胶原基因表达的影响与这些药物对常规分离培养的正常大鼠HSC的作用相似，这进一步提示HSC细胞系可作为HSC的替代细胞模型.
4 展望
虽然HSC细胞系可作为常规分离培养的HSC的理想替代细胞模型，但与刚分离的HSC相比，尚存在一定不足，不能完全取代HSC的重新分离与培养. 由于目前所建立的HSC细胞系多为从正常、纤维化肝脏中分离出HSC进行转染或多次传代培养以及对HSC来源的肿瘤细胞进行传代培养后所获得，这些细胞系均已获得了永生性，其表型类似MFBLC的表型，而且这种表型往往不能逆转，只能在一定程度上进行调节，因此在对静息的HSC的功能特别是对HSC活化的机制进行研究时，尚需从肝脏中重新分离HSC供研究之用. 尽管如此，HSC细胞系的建立仍将对HSC的细胞学研究特别是对针对HSC的抗纤维化药物研究产生较大的推动作用. 随着时间的推移，HSC细胞系将会得到越来越广泛的作用，更多的HSC细胞系将会被建立.
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通讯作者 朱永红
5 参考文献
[1] Gressner AM, Bachem MG. Molecular mechanisms of liver fibrogenesis-A homage to the role of activated fat-storing cells. Digestion, 1995;56:335-346
[2] Friedman SL. Molecular mechanisms of hepatic fibrosis and principles of therapy. J Gastroenterol, 1997;32:424-430
[3] 朱永红，聂青和. 储脂细胞与肝脏循环. 国外医学流行病学传染病学分册，1998；25：17-20
, http://www.100md.com
[4] Bissell DM. Hepatic fibrosis as wound repair: a progress report. J Gastroenterol, 1998;33:295-302
[5] Alpini G, Phillips JO, Vroman B, Larusso NF. Recent advances in the isolation of liver cells. Hepatology, 1994;20:494-514
[6] De Leeuw AM, McCarthy SP, Geerts A, Knook DL. Purified rat liver fat-storing cells in culture divide and contain collagen. Hepatology, 1984;4:392-403
[7] Tsutsumi M, Takasa A, Takase S. Characterization of desmin-positive rat liver sinusoidal cells. Hepatology, 1987;7:277-284
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[8] Bachem MG, Meyer D, Schafer W, Riess U, Melchior R, Sell KM, Gressner AM. The response of rat liver perisinusoidal lipocytes to polypeptide growth regulator changes with their transdifferentiation into myofibroblast-like cells in culture. J Hepatol, 1993;18:40-52
[9] Friedman SL, Rockey DC, McGuire RF, Maher JJ, Boyles JK, Yamasaki G. Isolated hepatic lipocytes and Kupffer cells from normal human liver: morphological and functional characteristics in primary culture. Hepatology, 1992;15:234-243
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收稿日期 1998-08-27 修回日期 1999-01-04, http://www.100md.com