肝细胞癌c-fos的表达及其与乙型肝炎病毒的关系*
作者：袁芳平 黄培生 龚华实 王 镛
单位：福建医科大学病理解剖学教研室(福州 350004)
关键词：肝肿瘤；原癌基因c-fos；乙型肝炎病毒；原位杂交；免疫组化
福建医科大学学报990402
目的 研究肝癌组织中c-fos蛋白和c-fos mRNA的表达及其与乙型肝炎病毒(HBV)的关系。 方法 采用免疫组化及原位杂交技术检测59例肝细胞癌组织及56例癌旁组织中HBsAg、HBV DNA、c-fos蛋白及c-fos mRNA的表达。 结果 癌旁肝组织HBsAg阳性率为87.5%(49/56)。肝癌组织HBV DNA阳性率为59.3%(35/59)。肝细胞癌组织、癌旁肝组织c-fos蛋白的阳性率分别为39.0%和53.6%，c-fos mRNA的阳性率分别为33.9%和50.0%。癌旁肝细胞不典型增生组c-fos蛋白、c-fos mRNA的阳性率均显著高于非不典型增生组(P<0.05)，非癌正常对照组均为阴性。癌组织HBV DNA阳性组病例c-fos蛋白、c-fos mRNA的阳性率显著高于癌组织HBV DNA阴性组(P<0.05)。 结论 肝细胞癌组织中存在c-fos癌基因的异常表达，并与HBV DNA有密切关系。
, 百拇医药
Expression of c-fos in Hepatocellular Carcinoma
and its Association with Hepatitis B Virus
Yuan Fangping, Huang Peisheng, Gong Huashi, et al
(Department of Pathology, Fujian Medical University, Fuzhou, 350004)
Objective To study the expression of c-fos in protein and mRNA levels in hepatocellular carcinoma(HCC) and its association with HBV. Methods Using immuno- histochemistry and in situ hybridization to detect HBsAg,HBV DNA,c-fos protein and c-fos mRNA in carcinomas tissue of 59 cases HCC and 56 paratumorous liver tissue. Results Positive rates of HBsAg in paratumorous liver tissue and HBV DNA in tumor tissue were 87.5%(49/56) and 59.3%(35/59) respectively. Positive rates of c-fos protein in tumor tissue and surrounding liver tissue were 39.0% and 53.6% respectively. Positive rates of c-fos mRNA in tumor tissue and surrounding liver tissue were 33.9% and 50.0% respectively. The expression of c-fos protein and c-fos mRNA was increased significantly in dysplastic liver cells (DLC) of paratumorous liver tissue compared with those of non-dysplastic liver cells(NDLC) (P<0.05). c-fos protein and c-fos mRNA were detected in HCC more frequently in patients whose tumor tissues had detectable HBV DNA than in those tumor tissues without detectable HBV DNA(P<0.05). Conclusion There was overexpression of c-fos oncogene in HCC,which was closely associated with HBV DNA.
, 百拇医药
Key words liver neoplasm; proto-oncogene c-fos; hepatitis B virus; in situ hybridization; immunohistochemistry
肝细胞癌变过程涉及多种原癌基因的突变，常表现为相应癌基因产物表达增多。为探讨肝细胞癌发生过程中c-fos癌基因表达的改变及其与乙型肝炎病毒(HBV)感染的关系，笔者采用免疫组化和原位杂交相结合的方法检测人肝细胞癌组织HBsAg、HBV DNA分布及c-fos蛋白、c-fos mRNA的表达状况，并探讨c-fos表达与HBV感染的关系。
1 材料和方法
1.1 材料 收集福建地区人肝细胞癌(HCC)59例,10%中性福尔马林固定,常规石蜡包埋,5 μm连续切片。59例HCC中有56例含癌旁肝组织,其中伴有肝细胞不典型增生(dysplastic liver cell,DLC)29例，非不典型增生者(non-dysplastic liver cell,NDLC)27例。(肝细胞不典型增生参照Anthony[1]的标准判定)。另收集14例尸检的正常肝组织作为对照组。
, http://www.100md.com
1.2 方法
1.2.1 免疫组化方法 鼠抗HBsAg单克隆抗体及SP试剂盒购自福州迈新公司，抗c-fos多克隆抗体购自北京中山试剂公司，采用SP法，DAB显色，苏木素复染。
1.2.2 原位杂交方法 随机引物法合成的生物素标记的HBV DNA探针，双链c-fos cDNA探针由北京医科大学分子病理系合成。组织切片经0.04%DEPC处理后贴附于涂过多聚赖氨酸的玻片上，60℃ 3 h烤片。切片经脱蜡，乙醇逐级水化，蛋白酶K(25μg/ml)37℃ 10 min;0.2%甘氨酸/PBS 15 min；4%多聚甲醛后固定10 min；0.1 mol/L三乙醇胺/0.25%醋酐15 min；逐级乙醇脱水，空气干燥，预杂交45℃ 3 h,3%BSA 37℃ 30 min，吸去多余的预杂交液，每片滴加50 μl杂交液(含预先98℃变性的探针，终浓度为1 μg/ml)，加封口膜，45℃过夜。(检测HBV DNA时，组织切片预杂交后经98℃变性10 min)。杂交后洗涤；3%H2O2 20 min，SP 37℃ 30 min，DAB显色，结果满意后，水洗中断，透明封片，苏木素复染。以上实验均设阳性、阴性对照。
, http://www.100md.com
1.2.3 结果判断 实验阳性结果参照Shimizu[2]标准进行判定，统计采用卡方检验。
2 结 果
2.1 阳性分布形式
HBsAg定位于肝癌细胞或癌旁肝细胞胞浆内。癌组织中HBV DNA均定位于癌细胞核内，癌旁HBV DNA可分布于肝细胞胞核及胞浆内，以胞浆为主。c-fos蛋白阳性位于胞浆、核内或核膜上，同一病例可同时有胞浆、核内表达(图1)。c-fos mRNA定位于细胞浆内(图2)。
图1 HCC癌细胞核膜上、核内或胞浆c-fos蛋白阳性(×400)
, http://www.100md.com
图2 HCC癌旁不典型增生肝细胞浆内c-fos
mRNA阳性(×400)
2.2 HBsAg、HBV DNA、c-fos在HCC中的阳性表达
癌旁肝组织HBsAg的阳性率为87.7%(49/56)，癌组织HBV DNA阳性率为59.3%(35/59)。c-fos在HCC中的阳性表达见表1。
表1 c-fos在HCC癌组织、癌旁肝组织中的阳性表达(n,%)
n
c-fos蛋白
c-fos mRNA
正常肝组织
, 百拇医药
14
0(0)
0(0)
HCC
59
23(39.0)*
20(33.9)*
癌旁肝组织
56
30(53.6)
28(50.0)
DLC
, 百拇医药
29
21(75.0)1)
22(75.9)
NDLC
27
9(33.3)*
6(22.2)*
HCC:人肝细胞癌； DLC：肝细胞不典型增生； NDLC：非不典型增生。
1.实际检测数为28例.与DLC相比，*:P<0.05.
经χ2检验表明，癌组织、癌旁肝组织c-fos蛋白、c-fos mRNA的表达率显著高于对照组(P<0.05)，癌旁DLC组c-fos蛋白、c-fos mRNA的阳性率均显著高于癌旁NDLC组及癌组织(P<0.05)。
, http://www.100md.com
2.3 癌组织c-fos表达与HBV的关系(表2)
表2 HCC癌组织c-fos表达与HBsAg、HBV DNA的关系
c-fos蛋白
c-fos mRNA
阳性
阴性
阳性
阴性
癌旁HBsAg
阳性
19
30
, http://www.100md.com
16
33
(n=56)
阴性
3
4
2
5
癌区HBV DNA
阳性
18
17
18
, 百拇医药 17
(n=59)
阴性
5
19
2
22
经χ2检验表明，癌组织c-fos蛋白、c-fos mRNA的表达与癌旁HBsAg存在与否无显著关系(P>0.05)。而癌组织HBV DNA阳性组其c-fos蛋白、c-fos mRNA的表达率显著高于癌组织HBV DNA阴性组(P<0.05)。
3 讨 论
一般认为c-fos原癌基因是瞬息基因，其表达产物为55 kD的c-fos蛋白，存在于胎肝、中枢神经系统中。成年后的大部分组织中产生的c-fos mRNA极不稳定；而在异常情况下则能在细胞内大量蓄积,与c-jun形成二聚体,并与DNA结合作为转录活化因子参与转录机制。单独的c-fos基因对细胞的生长、分化可能不起主要作用[3]。由化学诱导的鼠肝癌中[4,5]及人肝癌组织中[6,7]均有c-fos的表达，而本研究显示肝癌组织及癌旁肝组织中均有c-fos的过度表达，且与正常对照组相比有显著差异，进一步提示c-fos癌基因产物的过度表达参与人HCC的癌变过程；也表明癌旁c-fos阳性肝细胞已处于“癌前状态”。
, http://www.100md.com
白咸勇等[4]报道由对二乙基亚硝胺(DEN)诱导的小鼠肝癌发生中，肝细胞c-fos蛋白表达随诱癌发展进程而逐步增强。而本研究却发现无论是在蛋白水平，还是在mRNA水平，癌旁c-fos的表达均比肝癌组织显著得多，这可能说明：(1)c-fos参与了肝细胞癌变的启动过程；(2)肝细胞完全癌变还有其他原癌基因被激活，抑制了c-fos的转录、表达[6]，使c-fos的参与作用减弱。癌旁DLC组c-fos表达高于NDLC组，提示c-fos参与肝细胞癌变的早期过程。
本组HCC病例癌旁HBsAg阳性率达87.5%，提示该组HCC的发生与HBV感染有密切关系。通过研究发现HCC癌组织c-fos的表达与癌旁HBsAg表达无关，而与癌组织HBV DNA存在有密切关系(P<0.05)，在这里HBsAg阳性只是作为HBV感染的指标之一，本研究中癌组织HBV DNA均分布于癌细胞核内，而核内HBV DNA存在与否与病毒整合有密切关系[8]，故c-fos基因产物的过度表达可能与HBV的整合有一定关系。目前认为HBV引起肝癌c-fos过度表达的可能机制为：(1)HBV整合时发生基因重排，产生羧基末端部分丢失的病毒短肽链，这些短肽链中的一部分有促进细胞内c-fos转录的功能；(2)HBV DNA含有一小段开放阅读框架x基因，其编码的X多肽(HBxAg)能应用PKC依赖性的转录因子Ap-1/Ap-2反式激活c-fos转录[9]。故上述的癌组织c-fos表达比癌旁DLC组明显少，可能就是由于肝细胞癌变病毒复制减少，HBV合成X多肽减少而导致c-fos转录、表达减少所致。有关HBxAg与c-fos转录、表达的确切关系值得进一步探讨。
, 百拇医药
*:福建省科委八五攻关项目课题(85003-01-13)
参考文献
1 Anthony PP,Vogel CL,Barker LE,et al. Liver cell dysplasia—a premalignant condition. J Clin Pathol, 1973;26:217
2 Shimizu M,Saitoh Y,Itoh H. Immunohistochemical staining of Ha-ras oncogene product in normal,benign,and malignant human pancreatic tissues. Hum Pathol, 1990; 21:607
3 Field SJ,Johnson RS,Mortensen RM,et al. Growth and differentiation of embryonic stem cell that lack an intact c-fos gene. Proc Natl Acad Sci USA, 1992;89:9306
, 百拇医药
4 白咸勇，贾秀红，成令忠，等. c-fos蛋白在大鼠肝癌发生中的表达及意义. 滨州医学院学报, 1997;20:313
5 Chai KJ,Kim JS,Lee HK. Expression of c-fos and c-myc genes during 3'-methyl-4 -dimethylaminoazonen-zene(3'-MeDAB) induced rat hepatocarcinoma. Yonsei Med J, 1992;33:246
6 Arbuthnot P,Kew M,Fitschen W. c-fos and c-myc oncoprotein expression in human hepatocellular carcinomas. Anticancer,Res, 1991;11:921
7 Wang Z,Xiang Q,Li D. Correlation between gene expression and chromatin conformation of c-fos and N-ras in human liver and hepatoma. Chin Med Sci J, 1991;6:6
, 百拇医药
8 Blum HE,Haase AT,Vyas GN. Molecular pathogenesis of hpatitis B virus infection: simultaneous detection of viral DNA and antigen in paraffin-embedded liver section. Lancet, 1984;Ⅱ:771
9 Kekkule AS,Lauer U,Weiss L. Hepatitis B virus transactivator HBX use a tumor promotor signalling pathway. Nature, 1993;361:742
(收稿：1999-08-02 修回：1999-10-10), 百拇医药
单位：福建医科大学病理解剖学教研室(福州 350004)
关键词：肝肿瘤；原癌基因c-fos；乙型肝炎病毒；原位杂交；免疫组化
福建医科大学学报990402
目的 研究肝癌组织中c-fos蛋白和c-fos mRNA的表达及其与乙型肝炎病毒(HBV)的关系。 方法 采用免疫组化及原位杂交技术检测59例肝细胞癌组织及56例癌旁组织中HBsAg、HBV DNA、c-fos蛋白及c-fos mRNA的表达。 结果 癌旁肝组织HBsAg阳性率为87.5%(49/56)。肝癌组织HBV DNA阳性率为59.3%(35/59)。肝细胞癌组织、癌旁肝组织c-fos蛋白的阳性率分别为39.0%和53.6%，c-fos mRNA的阳性率分别为33.9%和50.0%。癌旁肝细胞不典型增生组c-fos蛋白、c-fos mRNA的阳性率均显著高于非不典型增生组(P<0.05)，非癌正常对照组均为阴性。癌组织HBV DNA阳性组病例c-fos蛋白、c-fos mRNA的阳性率显著高于癌组织HBV DNA阴性组(P<0.05)。 结论 肝细胞癌组织中存在c-fos癌基因的异常表达，并与HBV DNA有密切关系。
, 百拇医药
Expression of c-fos in Hepatocellular Carcinoma
and its Association with Hepatitis B Virus
Yuan Fangping, Huang Peisheng, Gong Huashi, et al
(Department of Pathology, Fujian Medical University, Fuzhou, 350004)
Objective To study the expression of c-fos in protein and mRNA levels in hepatocellular carcinoma(HCC) and its association with HBV. Methods Using immuno- histochemistry and in situ hybridization to detect HBsAg,HBV DNA,c-fos protein and c-fos mRNA in carcinomas tissue of 59 cases HCC and 56 paratumorous liver tissue. Results Positive rates of HBsAg in paratumorous liver tissue and HBV DNA in tumor tissue were 87.5%(49/56) and 59.3%(35/59) respectively. Positive rates of c-fos protein in tumor tissue and surrounding liver tissue were 39.0% and 53.6% respectively. Positive rates of c-fos mRNA in tumor tissue and surrounding liver tissue were 33.9% and 50.0% respectively. The expression of c-fos protein and c-fos mRNA was increased significantly in dysplastic liver cells (DLC) of paratumorous liver tissue compared with those of non-dysplastic liver cells(NDLC) (P<0.05). c-fos protein and c-fos mRNA were detected in HCC more frequently in patients whose tumor tissues had detectable HBV DNA than in those tumor tissues without detectable HBV DNA(P<0.05). Conclusion There was overexpression of c-fos oncogene in HCC,which was closely associated with HBV DNA.
, 百拇医药
Key words liver neoplasm; proto-oncogene c-fos; hepatitis B virus; in situ hybridization; immunohistochemistry
肝细胞癌变过程涉及多种原癌基因的突变，常表现为相应癌基因产物表达增多。为探讨肝细胞癌发生过程中c-fos癌基因表达的改变及其与乙型肝炎病毒(HBV)感染的关系，笔者采用免疫组化和原位杂交相结合的方法检测人肝细胞癌组织HBsAg、HBV DNA分布及c-fos蛋白、c-fos mRNA的表达状况，并探讨c-fos表达与HBV感染的关系。
1 材料和方法
1.1 材料 收集福建地区人肝细胞癌(HCC)59例,10%中性福尔马林固定,常规石蜡包埋,5 μm连续切片。59例HCC中有56例含癌旁肝组织,其中伴有肝细胞不典型增生(dysplastic liver cell,DLC)29例，非不典型增生者(non-dysplastic liver cell,NDLC)27例。(肝细胞不典型增生参照Anthony[1]的标准判定)。另收集14例尸检的正常肝组织作为对照组。
, http://www.100md.com
1.2 方法
1.2.1 免疫组化方法 鼠抗HBsAg单克隆抗体及SP试剂盒购自福州迈新公司，抗c-fos多克隆抗体购自北京中山试剂公司，采用SP法，DAB显色，苏木素复染。
1.2.2 原位杂交方法 随机引物法合成的生物素标记的HBV DNA探针，双链c-fos cDNA探针由北京医科大学分子病理系合成。组织切片经0.04%DEPC处理后贴附于涂过多聚赖氨酸的玻片上，60℃ 3 h烤片。切片经脱蜡，乙醇逐级水化，蛋白酶K(25μg/ml)37℃ 10 min;0.2%甘氨酸/PBS 15 min；4%多聚甲醛后固定10 min；0.1 mol/L三乙醇胺/0.25%醋酐15 min；逐级乙醇脱水，空气干燥，预杂交45℃ 3 h,3%BSA 37℃ 30 min，吸去多余的预杂交液，每片滴加50 μl杂交液(含预先98℃变性的探针，终浓度为1 μg/ml)，加封口膜，45℃过夜。(检测HBV DNA时，组织切片预杂交后经98℃变性10 min)。杂交后洗涤；3%H2O2 20 min，SP 37℃ 30 min，DAB显色，结果满意后，水洗中断，透明封片，苏木素复染。以上实验均设阳性、阴性对照。
, http://www.100md.com
1.2.3 结果判断 实验阳性结果参照Shimizu[2]标准进行判定，统计采用卡方检验。
2 结 果
2.1 阳性分布形式
HBsAg定位于肝癌细胞或癌旁肝细胞胞浆内。癌组织中HBV DNA均定位于癌细胞核内，癌旁HBV DNA可分布于肝细胞胞核及胞浆内，以胞浆为主。c-fos蛋白阳性位于胞浆、核内或核膜上，同一病例可同时有胞浆、核内表达(图1)。c-fos mRNA定位于细胞浆内(图2)。
图1 HCC癌细胞核膜上、核内或胞浆c-fos蛋白阳性(×400)
, http://www.100md.com
图2 HCC癌旁不典型增生肝细胞浆内c-fos
mRNA阳性(×400)
2.2 HBsAg、HBV DNA、c-fos在HCC中的阳性表达
癌旁肝组织HBsAg的阳性率为87.7%(49/56)，癌组织HBV DNA阳性率为59.3%(35/59)。c-fos在HCC中的阳性表达见表1。
表1 c-fos在HCC癌组织、癌旁肝组织中的阳性表达(n,%)
n
c-fos蛋白
c-fos mRNA
正常肝组织
, 百拇医药
14
0(0)
0(0)
HCC
59
23(39.0)*
20(33.9)*
癌旁肝组织
56
30(53.6)
28(50.0)
DLC
, 百拇医药
29
21(75.0)1)
22(75.9)
NDLC
27
9(33.3)*
6(22.2)*
HCC:人肝细胞癌； DLC：肝细胞不典型增生； NDLC：非不典型增生。
1.实际检测数为28例.与DLC相比，*:P<0.05.
经χ2检验表明，癌组织、癌旁肝组织c-fos蛋白、c-fos mRNA的表达率显著高于对照组(P<0.05)，癌旁DLC组c-fos蛋白、c-fos mRNA的阳性率均显著高于癌旁NDLC组及癌组织(P<0.05)。
, http://www.100md.com
2.3 癌组织c-fos表达与HBV的关系(表2)
表2 HCC癌组织c-fos表达与HBsAg、HBV DNA的关系
c-fos蛋白
c-fos mRNA
阳性
阴性
阳性
阴性
癌旁HBsAg
阳性
19
30
, http://www.100md.com
16
33
(n=56)
阴性
3
4
2
5
癌区HBV DNA
阳性
18
17
18
, 百拇医药 17
(n=59)
阴性
5
19
2
22
经χ2检验表明，癌组织c-fos蛋白、c-fos mRNA的表达与癌旁HBsAg存在与否无显著关系(P>0.05)。而癌组织HBV DNA阳性组其c-fos蛋白、c-fos mRNA的表达率显著高于癌组织HBV DNA阴性组(P<0.05)。
3 讨 论
一般认为c-fos原癌基因是瞬息基因，其表达产物为55 kD的c-fos蛋白，存在于胎肝、中枢神经系统中。成年后的大部分组织中产生的c-fos mRNA极不稳定；而在异常情况下则能在细胞内大量蓄积,与c-jun形成二聚体,并与DNA结合作为转录活化因子参与转录机制。单独的c-fos基因对细胞的生长、分化可能不起主要作用[3]。由化学诱导的鼠肝癌中[4,5]及人肝癌组织中[6,7]均有c-fos的表达，而本研究显示肝癌组织及癌旁肝组织中均有c-fos的过度表达，且与正常对照组相比有显著差异，进一步提示c-fos癌基因产物的过度表达参与人HCC的癌变过程；也表明癌旁c-fos阳性肝细胞已处于“癌前状态”。
, http://www.100md.com
白咸勇等[4]报道由对二乙基亚硝胺(DEN)诱导的小鼠肝癌发生中，肝细胞c-fos蛋白表达随诱癌发展进程而逐步增强。而本研究却发现无论是在蛋白水平，还是在mRNA水平，癌旁c-fos的表达均比肝癌组织显著得多，这可能说明：(1)c-fos参与了肝细胞癌变的启动过程；(2)肝细胞完全癌变还有其他原癌基因被激活，抑制了c-fos的转录、表达[6]，使c-fos的参与作用减弱。癌旁DLC组c-fos表达高于NDLC组，提示c-fos参与肝细胞癌变的早期过程。
本组HCC病例癌旁HBsAg阳性率达87.5%，提示该组HCC的发生与HBV感染有密切关系。通过研究发现HCC癌组织c-fos的表达与癌旁HBsAg表达无关，而与癌组织HBV DNA存在有密切关系(P<0.05)，在这里HBsAg阳性只是作为HBV感染的指标之一，本研究中癌组织HBV DNA均分布于癌细胞核内，而核内HBV DNA存在与否与病毒整合有密切关系[8]，故c-fos基因产物的过度表达可能与HBV的整合有一定关系。目前认为HBV引起肝癌c-fos过度表达的可能机制为：(1)HBV整合时发生基因重排，产生羧基末端部分丢失的病毒短肽链，这些短肽链中的一部分有促进细胞内c-fos转录的功能；(2)HBV DNA含有一小段开放阅读框架x基因，其编码的X多肽(HBxAg)能应用PKC依赖性的转录因子Ap-1/Ap-2反式激活c-fos转录[9]。故上述的癌组织c-fos表达比癌旁DLC组明显少，可能就是由于肝细胞癌变病毒复制减少，HBV合成X多肽减少而导致c-fos转录、表达减少所致。有关HBxAg与c-fos转录、表达的确切关系值得进一步探讨。
, 百拇医药
*:福建省科委八五攻关项目课题(85003-01-13)
参考文献
1 Anthony PP,Vogel CL,Barker LE,et al. Liver cell dysplasia—a premalignant condition. J Clin Pathol, 1973;26:217
2 Shimizu M,Saitoh Y,Itoh H. Immunohistochemical staining of Ha-ras oncogene product in normal,benign,and malignant human pancreatic tissues. Hum Pathol, 1990; 21:607
3 Field SJ,Johnson RS,Mortensen RM,et al. Growth and differentiation of embryonic stem cell that lack an intact c-fos gene. Proc Natl Acad Sci USA, 1992;89:9306
, 百拇医药
4 白咸勇，贾秀红，成令忠，等. c-fos蛋白在大鼠肝癌发生中的表达及意义. 滨州医学院学报, 1997;20:313
5 Chai KJ,Kim JS,Lee HK. Expression of c-fos and c-myc genes during 3'-methyl-4 -dimethylaminoazonen-zene(3'-MeDAB) induced rat hepatocarcinoma. Yonsei Med J, 1992;33:246
6 Arbuthnot P,Kew M,Fitschen W. c-fos and c-myc oncoprotein expression in human hepatocellular carcinomas. Anticancer,Res, 1991;11:921
7 Wang Z,Xiang Q,Li D. Correlation between gene expression and chromatin conformation of c-fos and N-ras in human liver and hepatoma. Chin Med Sci J, 1991;6:6
, 百拇医药
8 Blum HE,Haase AT,Vyas GN. Molecular pathogenesis of hpatitis B virus infection: simultaneous detection of viral DNA and antigen in paraffin-embedded liver section. Lancet, 1984;Ⅱ:771
9 Kekkule AS,Lauer U,Weiss L. Hepatitis B virus transactivator HBX use a tumor promotor signalling pathway. Nature, 1993;361:742
(收稿：1999-08-02 修回：1999-10-10), 百拇医药