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编号:10241248
反义前S/S基因转移表达抗乙型肝炎病毒的研究
http://www.100md.com 《中国病毒学》 1999年第4期
     作者:季伟 王勤环 斯崇文 于 敏 张国庆 刘 丹

    单位:季伟 解放军302医院感染7区,北京 100039;王勤环 斯崇文 于 敏 张国庆 刘丹 北京医科大学第一临床学院感染疾病科,北京 100034

    关键词:乙型肝炎病毒(HBV);基因治疗;逆转录病毒载体

    中国病毒学990404 摘 要 为了观察反义基因转录表达抗乙型肝炎病毒(HBV)的作用,将HBV ayw前S/S基因(preS/S)片段反向插入逆转录病毒载体质粒,构建preS/S反义基因重组体,经转染PA317细胞后,获得重组逆转录病毒颗粒。用重组病毒转导2.2.15细胞后,第3天即可见细胞培养上清HBV表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)表达量减少,到转导后第5天,细胞培养上清中的HBsAg和HBeAg表达量降到最低水平,HBsAg抑制率为71%,HBeAg抑制率为27%,抑制作用至少可持续到转导后第11天。空载及正向插入基因的重组逆转录病毒转导对2.2.15细胞内HBV抗原表达无抑制作用。
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    Inhibition of Hepatitis B Virus by Retroviral Vectors

    Expressing Antisenses PreS/S

    Ji Wei

    (The Seventh Department of Infectious Diseases, 302 Hospital of the PLA, Beijing 100039)

    Wang Qinghuan Si Chongwen Yu Ming et al

    (Department of Infectious Diseases, The First Affiliated Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034)
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    Abstract Retroviral vector expressing antisense RNA complementary to HBV preS/S (antisense-S) was used to transduce human hepatoblastoma cell 2.2.15, which was transfected with HBV DNA and can express HBV markers. The results showed that the inhibitory effects of antisense gene transfer mediated by retroviral vector antisense-S on the expression of HBV antigens appeared as early as on day 3 after transduction, reached peak level on day 5, and persisted at least for 11 days. The inhibitory rates of HBsAg and HBeAg in the 2.2.15 cells by antisense-S were 71% and 27% on day 5 after transduction, and in comparison to blank or sense-S, the inhibitory effects of antisense-S were highly significant (P<0.01). The viability of transduced 2.2.15 cells was not affected as indicated by MTT assays. The results demonstrated that retroviral vectors containing antisense gene can inhibit HBV, and the antisense retroviral vectors may be potentially useful for anti-HBV gene therapy.
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    Key words Hepatitis B virus (HBV), Gene therapy, Retroviral vector

    乙型肝炎病毒(HBV)感染是我国常见传染病 ,迄今尚无有效的治疗方法。将HBV前C/C (preC/C)基因反向插入逆转录病毒载体,构建表达preC/C反义RNA的重组逆转录病毒颗粒,可以抑制2.2.15细胞HBV复制和表达[1],因而可利用基因转移技术开展抗HBV基因治疗。为了进一步探讨不同靶序列反义基因表达的抗病毒作用,我们又进一步观察了重组逆转录病毒包装细胞系统介导前S/S(preS/S)反义基因转移表达的抗HBV作用。

    1 材料和方法

    1.1 主要材料和试剂

    1.1.1 pDOR质粒由中国医学科学院肿瘤研究所提供。pCP10由美国Mountain Sinai Medical Center提供[1]
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    1.1.2 PA317细胞和NIH3T3细胞由中国医学科学院肿瘤研究所提供。2.2.15细胞由美国Mountain Sinai Medical Center提供[1]

    1.1.3 分子克隆所用各种工具酶、DNA-磷酸钙细胞转染试剂盒、细胞总RNA提取试剂盒均购于Promega公司。G418、DMEM、MEM和胎牛血清为GIBCO公司产品。Polybrene购于Sigma公司。地高辛DNA探针标记试剂盒为Bohringer-Mannheim公司产品。HBV DNA地高辛标记探针试剂盒由中国预防医学科学院病毒研究所提供。HBsAg和HBeAg固相放射免疫试剂盒为中国同位素公司北方免疫试剂研究所产品。

    1.2 方法

    1.2.1 HBV反义基因重组载体质粒的构建和重组逆转录病毒颗粒的获得 用Bgl Ⅱ酶切pCP10,分离2.3 kb的preS/S基因片段。将酶切片段分别正、反向插入pDOR质粒的BamH Ⅰ多克隆位点,经限制性内切酶分析,筛选出preS/S正向、反向插入的重组逆转录病毒载体质粒pDO(SENSE.S)和pDO(ANTI.S)[2]。用磷酸钙共沉淀法将上述两种质粒和空白载体质粒分别转染PA317细胞,经G418筛选及扩增培养后,收获含逆转录病毒颗粒的细胞培养上清液。空白载体病毒为R-control, preS/S反向插入的重组病毒为antisense-S,正向插入的重组病毒为sense-S。重组逆转录病毒贮存于-70 ℃备用。
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    1.2.2 感染2.2.15细胞 将对数生长期的2.2.15细胞以每孔1×104接种于24孔细胞培养板上,20 h后分4组,每组设3个复孔。第一至第三组分别为R-control、sense-S和antisense-S转导组。第四组为不加重组逆转录病毒的空白对照组。以感染倍数5的比例,分别加入相应量的重组病毒上清。最后用完全MEM培养液将每孔细胞培养液补充至2 mL,置37 ℃、5%CO2孵箱中培养,4 h后换液,于换液后第3、5、7、9和11天再分别换液一次。每次换出的培养液放-20 ℃备检,最后用固相放射免疫法,检测培养上清HBsAg和HBeAg含量,结果以cpm表示,并计算HBV抗原表达的抑制率。细胞培养在含10%灭活胎牛血清、0.03%谷氨酰胺、G418 200 μg/mL、100 u/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的MEM培养液中。

    1.2.3 重组逆转录病毒转导,对2.2.15细胞活性的观察 重组逆转录病毒转导细胞后第5天,按文献[3]方法进行MTT细胞毒试验。
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    1.3 统计处理

    各组数据以x±s表示。多组资料用秩检验(rank test)处理。两组资料用t或t′检验。

    2 结果

    2.1 重组逆转录病毒转导2.2.15细胞对HBV抗原表达的影响

    antisense-S转导2.2.15细胞后第3天,HBsAg和HBeAg表达均受到抑制。转导后第5天,抑制率达高峰,并持续到转导后第11天。随后因细胞老化濒于死亡而未继续观察。空白及正向插入的重组逆转录病毒转导,对2.2.15细胞HBV抗原表达均无抑制作用(见表1、表2、图1及图2)。

    图1 antisense-S对HBsAg抑制作用的动态观察
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    Fig.1 Inhibitory effects of antisense-S on HBsAg expression

    图2 antisense-S对HBeAg表达抑制作用的动态观察

    Fig.1 Inhibitory effects of antisense-S on HBeAg expression

    表1 重组逆转录病毒转导对2.2.15细胞HBsAg表达的影响(cpm,±s)

    Table 1 HBsAg expression in the 2.2.15 cells transduced with recombinant retroviruses (cpm,±s) 实验分组
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    Groups

    转导后时间 Time after transduction (d)

    3

    5

    7

    9

    11

    Blank

    370±34

    615±25

    642±47

    621±20
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    632±41

    R-control

    351±60

    605±37

    619±27

    617±15

    605±30

    sense-S

    335±55

    612±20

    617±37

    606±14
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    589±20

    antisense-S

    223±22

    178±29

    189±29

    182±32

    192±41

    表2 重组逆转录病毒转导对2.2.15细胞HBeAg表达的影响(cpm,±s)

    Table 2 HBeAg expression in the 2.2.15 cells transduced with recombinant retroviruses (cpm,±s) 实验分组
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    Groups

    转导后时间 Time after transduction (d)

    3

    5

    7

    9

    11

    Blank

    615±23

    1418±104

    1725±67

    1750±94
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    1626±121

    R-control

    599±15

    1399±95

    1687±144

    1744±99

    1593±92

    sense-S

    604±17

    1407±104

    1668±70

    1600±159
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    1565±57

    antisense-S

    469±21

    1031±73

    1327±70

    1428±348

    1356±106

    2.2 反义基因重组逆转录病毒转导对2.2.15细胞HBV抗原抑制作用的比较

    重组逆转录病毒转导2.2.15细胞后第5天,antisense-S对HBsAg的抑制率为71%,对HBeAg的抑制率为27%,两者相比差别非常显著,P<0.01(表3)。表3 antisense-S对2.2.15细胞HBV抗原表达抑制作用的比较(±s)
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    Table 3 Comparison of inhibitory effects of recombinant

    retroviruses on HBV antigens expressions in the transduced

    2.2.15 cells on day 5(±s) 分组

    Groups

    抑制率(%) Inhibitory rates (%)

    P值*

    Value*
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    HBsAg

    HBeAg

    R-control

    1.6

    1.3

    >0.05

    sense-S

    0.5**

    0.8**

    >0.05

    antisense-S

    71.1***
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    27.3***

    <0.01

    注:n=3;*HBsAg组与HBeAg组之间比较;

    Note: n=3;*comparison between HBsAg and HBeAg;

    **与R-control组比较,P>0.05;

    **Comparison with R-control,P>0.05

    ***与R-control组比较,P<0.01

    ***Comparison with R-control, P<0.01
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    2.3 重组逆转录病毒转导对2.2.15细胞活性的影响

    重组逆转录病毒转导2.2.15细胞后第5天,进行MTT细胞毒试验。结果表明,重组逆转录病毒感染对2.2.15细胞无毒性作用(结果未列出)。

    3 讨论

    逆转录病毒载体质粒pDOR是由莫氏小鼠白血病病毒改建的载体。将HBV ayw基因组preS/S片段插入此载体中的多克隆位点上,经转染逆转录病毒包装细胞系PA317后,获得重组逆转录病毒。体外用重组病毒转导2.2.15细胞可抑制HBV抗原表达。与我们以前的研究结果类似,虽然表达HBV preS/S反义基因的重组逆转录病毒antisense-S对HBsAg和HBeAg均有抑制作用,但是它对HBsAg表达的抑制作用比对HBeAg的抑制作用强,表明反义基因转移表达的抗病毒作用具有特异性。由于实验设计的反义基因片段长约2.3 kb,它不仅包括了所有preS/S基因片段,而且也重叠有HBV其它基因序列,因此构建的反义基因重组逆转录病毒不仅能够特异地抑制HBsAg表达,对HBeAg和HBV DNA也具有抑制作用。但重组病毒转导对靶细胞本身无毒性作用。
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    参考文献

    1 季伟,王勤环,斯崇文等.反义前C/C基因转移表达抗乙型肝炎病毒作用的研究.中国病毒学,1997,12(3):214~218

    2 季伟,王勤环,斯崇文等.逆转录病毒载体介导乙型肝炎病毒反义基因的转录表达.中华实验和临床病毒学杂志,1997,11(4):325~328

    3 Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods, 1983,65:55

    *收稿日期:1998-07-06,修回日期:1998-11-09, http://www.100md.com