乙型肝炎病毒C基因逆转录病毒载体的构建及在永生化人外周血B细胞中的表达
作者：周福元 隋礼丽 骆抗先
单位：510515 广州，第一军医大学南方医院
关键词：肝炎病毒，乙型；变异；载体
中华传染病杂志990401 【摘要】 目的 体外研究乙型肝炎病毒C(HBV/C)基因变异的生物学意义。方法 应用逆转录病毒载体pXT1构建HBV/C基因表达载体，并转染永生化人外周血B细胞使之稳定表达HBcAg。结果 重组质粒pXT1-HBV/C经聚合酶链反应(PCR)和BglⅡ及XhoⅠ双酶切鉴定均阳性，转染后的永生化人外周血B细胞PCR鉴定含目的DNA，流式细胞仪分析显示，约47.4%的细胞膜上表达了HBcAg。结论 HBV/C基因逆转录病毒表达载体有较高的转染效率，目的基因能在宿主细胞中稳定表达，有利于系列研究HBV/C基因变异的生物学意义。
Construction of hepatitis B virus C gene retroviral vector and its expression in immortalized human peripheral blood B cell lines
, http://www.100md.com
ZHOU Fuyuan, SUI Lili, LUO Kangxian.
Department of Infectious Diseases, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515
【Abstract】 Objective In order to study the biological significance of HBV/C gene variant in vitro. Methods Retroviral vector pXT1 was used to construct the HBV/C gene expression vector and the recombinant plasmid pXT1-HBV/C was used to transfect immortalized human peripheral blood B cell lines to express HBcAg steadily in the host cells.Results plasmid pXT1-HBV/C was detected positive by PCR as well as enzyme digestion with BglⅡ and XhoⅠ. Meanwhile, transfected cells was detected to contain HBV/C gene by PCR and HBcAg was expressed in 47.4% of the cells by means of flow cytometry. Conclusion Retroviral expression vector with HBV/C gene can transfect into eucaryotic cells effectively and express the goal gene steadily. The recombinant cells may be used in the systematic studies on the biological significance of HBV/C gene variant.
, http://www.100md.com
【Key words】 Hepatitis B virus Mutation Vector
乙型肝炎病毒(HBV)的核心抗原(HBcAg)是HBV特异性的杀伤性T淋巴细胞(CTL)的主要靶抗原，在乙型肝炎的发病机制中起着重要作用[1]。为研究HBV/C基因变异的生物学意义，我们采用逆转录病毒载体pXT1构建了HBV/C基因的表达载体，并在EB病毒永生化的人外周血B细胞中表达了HBcAg。
材料与方法
一、质粒pXT1
逆转录病毒表达载体pXT1由重庆医科大学任红教授惠赠，其结构示意图见图1。
BglⅡ和XhoⅠ：两个克隆位点；TK：单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子；neo：新霉素抗性基因；SA、SD：分别为剪切受体和供体
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图1 质粒pXT1的结构示意图
二、引物设计
5′端引物为P1： 5′-CGTAGATCTGGCTTTG-
GGGCATGGACATT-3′；3′端引物为P2：5′-GCGC-
TCGAGCTAACATTGAGATTCCCG-3′，扩增区段位于HBV nt1890～2452，包含HBV/C区，5′端引物含BglⅡ酶切位点，3′端引物含XhoⅠ酶切位点。
三、目的基因的制备
以质粒pCP10(含双拷贝HBV全基因组，ayw亚型)为模板，以引物P1、P2扩增HBV/C区基因，经BglⅡ、XhoⅠ双酶切后，低溶点琼脂糖回收。
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四、载体的制备
小量抽提质粒pXT1，经BglⅡ、XhoⅠ双酶切后，低溶点琼脂糖回收。
五、目的基因和载体的连接、转化
目的基因和载体在T4连接酶的作用下，15℃连接过夜。取连接产物2μl转化感受态细菌XL1-blue，在Amp抗性培养板中37℃温育过夜。
六、重组质粒的鉴定
同时采用聚合酶链反应(PCR)和双酶消化2种方法。
七、重组质粒转染永生化人外周血B细胞株
采用脂质体介导方法。收集2×106EB病毒永生化的人外周血B细胞(本室建立，稳定传10代以上)，用不含血清和抗生素的DMEM培养液洗2次，再以0.8ml DMEM培养液混合并重悬细胞。2μg重组质粒和10μl脂质体(Gibco)加入到总体积200μl的不含血清和抗生素的DMEM培养液中混合30分钟。缓慢加入到细胞中，5小时后加4ml完全1640培养液，24小时后更换完全1640培养液，继续培养48小时后1∶15传代，加新霉素400μg/ml筛选，每3.5天换液。
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八、重组质粒在宿主细胞中表达的检测
采用流式细胞方法。新霉素筛选6周后，收集2×106筛选阳性的细胞，以PBS洗1次，200μl重悬与兔抗HBcAg抗体(美国Zymed实验室)室温下温育45分钟，洗3次，再以FITC标记的鹅抗兔IgG温育45分钟，流式细胞仪检测分析5 000个细胞。
结果
一、重组质粒pXT1-HBV/C的构建
以引物P1、P2扩增HBV/C区片段，克隆到载体pXT1中，并转染大肠杆菌XL1-blue，在Amp抗性培养板中37℃温育过夜，可见散在的抗性克隆菌落生长。
二、重组质粒pXT1-HBV/C的鉴定
见图2。以重组质粒为模板，以引物P1、P2可扩增出与目的DNA相同大小的片段(Lane4)；重组质粒经BglⅡ、XhoⅠ双酶切后，可得到分别与目的DNA和载体相同大小的2个片段。
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1 PCR阴性对照；2 λ DNA HindⅢ/EcoRⅠ;3 PCR阳性对照；
4 重组质粒PCR结果；5 重组质粒BglⅡ、XhoⅠ酶切结果；
6、7 分别为重组质粒BglⅡ或XhoⅠ酶切结果；8 未消化的重组质粒图谱
图2 pXT1-HBV/C重组质粒PCR和酶切鉴定结果
三、重组质粒转染B细胞的筛选
利用脂质体介导重组质粒pXT1-HBV/C转染的B细胞，在新霉素选择培养6天后，对照的B细胞全部死亡；转染的B细胞中也有大量死亡，仅见小量散在的新霉素抗性细胞生长，减半抗生素浓度培养3周后传代扩增，继续培养2周后可用于检测。
四、转染的B细胞目的DNA的检测
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常规提取宿主细胞基因组DNA为模板，以引物P1、P2可扩增出与目的DNA相同大小的片段。并同时检测到neo基因。
五、重组质粒pXT1-HBV/C在永生化人外周血B细胞中的表达
流式细胞检测结果见图3。以未转染的永生化B细胞为阴性对照，在检测重组质粒转染的B细胞中，表达HBcAg的细胞占47.4%。
检测细胞数为4 219个,阳性数为2 000个,阳性率为47.4%;M1：阳性细胞荧光强度域值
图3 重组质粒在永生化人B细胞中表达的流式
细胞仪检测结果
讨论
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HBcAg是HBV特异性CTL的主要靶抗原，在乙型肝炎的发病机制中起着重要作用[1]。HBV/C区碱基突变，往往影响HBcAg特异性的CTL作用表位，从而与疾病活动有关[2，3]。但HBV变异引起疾病活动改变的机制至今尚未阐明。为研究HBV/C基因变异的生物学意义，我们应用逆转录病毒载体构建了HBV/C基因的表达载体，并在永生化的人外周血B细胞中表达目的蛋白，为研究HBV/C基因变异的生物学意义打下基础。
质粒pXT1为复制缺陷型逆转录病毒并能在胚胎细胞和成人细胞中高效持续表达外源基因[4]。它是在质粒pXm5的基础上，加上Moloney白血病病毒的长末段复制片段(LTRs)和部分gag基因区段，LTRs启动新霉素抗性基因的表达；单纯疱疹病毒TK启动子启动外源基因的表达。逆转录病毒载体介导的基因转移是将外源性基因导入靶细胞的有效手段，它不但能高效地将外源基因转入靶细胞，而且能将外源基因有效地整合到宿主细胞基因组中，并随细胞分裂传给子代，使外源基因在宿主细胞中永久表达。为此，我们利用逆转录病毒转移外源基因的高效性和在宿主细胞中表达的持久性，构建了逆转录病毒表达载体pXT1-HBV/C重组质粒，并在人永生化的B细胞中得以持久表达，为系列观察HBV/C基因变异的生物学活性创造条件。
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人外周血B细胞经EB病毒永生化后，可长久地传代，由于人外周血B细胞取自于被研究的宿主，HLA亚型与宿主其它细胞匹配，经转染目的基因后，不仅可研究目的基因在宿主细胞中的表达情况，还可作为靶细胞与自身的HBcAg特异性CTL相互作用，以观察细胞毒作用。
本课题受国家自然科学基金资助(编号：39570037)
参考文献
1 Ferrari C, Penna A, Bertoletti A,et al. Cellular immune response to hepatitis B virus-encoded antigens in acute and chronic hepatitis B virus infection. J Immunol, 1990,145:3443-3449.
2 骆抗先，朱幼芙，杨洁，等.乙型肝炎病毒感染时的C基因热点变异.中华实验和临床病毒学杂志，1997，11：29-32.
3 骆抗先，侯金林，梁炽森.乙型肝炎病毒感染及病毒变异.中华传染病杂志，1996，14：101-104.
4 Boulter CA, Wagner EF. A universal retroviral vector for efficient constitutive expression of exogenous genes. Nucleic Acids Research, 1987, 15:7194-7195.
(收稿：1998-12-07 修回：1999-04-02), http://www.100md.com
单位：510515 广州，第一军医大学南方医院
关键词：肝炎病毒，乙型；变异；载体
中华传染病杂志990401 【摘要】 目的 体外研究乙型肝炎病毒C(HBV/C)基因变异的生物学意义。方法 应用逆转录病毒载体pXT1构建HBV/C基因表达载体，并转染永生化人外周血B细胞使之稳定表达HBcAg。结果 重组质粒pXT1-HBV/C经聚合酶链反应(PCR)和BglⅡ及XhoⅠ双酶切鉴定均阳性，转染后的永生化人外周血B细胞PCR鉴定含目的DNA，流式细胞仪分析显示，约47.4%的细胞膜上表达了HBcAg。结论 HBV/C基因逆转录病毒表达载体有较高的转染效率，目的基因能在宿主细胞中稳定表达，有利于系列研究HBV/C基因变异的生物学意义。
Construction of hepatitis B virus C gene retroviral vector and its expression in immortalized human peripheral blood B cell lines
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ZHOU Fuyuan, SUI Lili, LUO Kangxian.
Department of Infectious Diseases, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515
【Abstract】 Objective In order to study the biological significance of HBV/C gene variant in vitro. Methods Retroviral vector pXT1 was used to construct the HBV/C gene expression vector and the recombinant plasmid pXT1-HBV/C was used to transfect immortalized human peripheral blood B cell lines to express HBcAg steadily in the host cells.Results plasmid pXT1-HBV/C was detected positive by PCR as well as enzyme digestion with BglⅡ and XhoⅠ. Meanwhile, transfected cells was detected to contain HBV/C gene by PCR and HBcAg was expressed in 47.4% of the cells by means of flow cytometry. Conclusion Retroviral expression vector with HBV/C gene can transfect into eucaryotic cells effectively and express the goal gene steadily. The recombinant cells may be used in the systematic studies on the biological significance of HBV/C gene variant.
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【Key words】 Hepatitis B virus Mutation Vector
乙型肝炎病毒(HBV)的核心抗原(HBcAg)是HBV特异性的杀伤性T淋巴细胞(CTL)的主要靶抗原，在乙型肝炎的发病机制中起着重要作用[1]。为研究HBV/C基因变异的生物学意义，我们采用逆转录病毒载体pXT1构建了HBV/C基因的表达载体，并在EB病毒永生化的人外周血B细胞中表达了HBcAg。
材料与方法
一、质粒pXT1
逆转录病毒表达载体pXT1由重庆医科大学任红教授惠赠，其结构示意图见图1。
BglⅡ和XhoⅠ：两个克隆位点；TK：单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子；neo：新霉素抗性基因；SA、SD：分别为剪切受体和供体
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图1 质粒pXT1的结构示意图
二、引物设计
5′端引物为P1： 5′-CGTAGATCTGGCTTTG-
GGGCATGGACATT-3′；3′端引物为P2：5′-GCGC-
TCGAGCTAACATTGAGATTCCCG-3′，扩增区段位于HBV nt1890～2452，包含HBV/C区，5′端引物含BglⅡ酶切位点，3′端引物含XhoⅠ酶切位点。
三、目的基因的制备
以质粒pCP10(含双拷贝HBV全基因组，ayw亚型)为模板，以引物P1、P2扩增HBV/C区基因，经BglⅡ、XhoⅠ双酶切后，低溶点琼脂糖回收。
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四、载体的制备
小量抽提质粒pXT1，经BglⅡ、XhoⅠ双酶切后，低溶点琼脂糖回收。
五、目的基因和载体的连接、转化
目的基因和载体在T4连接酶的作用下，15℃连接过夜。取连接产物2μl转化感受态细菌XL1-blue，在Amp抗性培养板中37℃温育过夜。
六、重组质粒的鉴定
同时采用聚合酶链反应(PCR)和双酶消化2种方法。
七、重组质粒转染永生化人外周血B细胞株
采用脂质体介导方法。收集2×106EB病毒永生化的人外周血B细胞(本室建立，稳定传10代以上)，用不含血清和抗生素的DMEM培养液洗2次，再以0.8ml DMEM培养液混合并重悬细胞。2μg重组质粒和10μl脂质体(Gibco)加入到总体积200μl的不含血清和抗生素的DMEM培养液中混合30分钟。缓慢加入到细胞中，5小时后加4ml完全1640培养液，24小时后更换完全1640培养液，继续培养48小时后1∶15传代，加新霉素400μg/ml筛选，每3.5天换液。
, 百拇医药
八、重组质粒在宿主细胞中表达的检测
采用流式细胞方法。新霉素筛选6周后，收集2×106筛选阳性的细胞，以PBS洗1次，200μl重悬与兔抗HBcAg抗体(美国Zymed实验室)室温下温育45分钟，洗3次，再以FITC标记的鹅抗兔IgG温育45分钟，流式细胞仪检测分析5 000个细胞。
结果
一、重组质粒pXT1-HBV/C的构建
以引物P1、P2扩增HBV/C区片段，克隆到载体pXT1中，并转染大肠杆菌XL1-blue，在Amp抗性培养板中37℃温育过夜，可见散在的抗性克隆菌落生长。
二、重组质粒pXT1-HBV/C的鉴定
见图2。以重组质粒为模板，以引物P1、P2可扩增出与目的DNA相同大小的片段(Lane4)；重组质粒经BglⅡ、XhoⅠ双酶切后，可得到分别与目的DNA和载体相同大小的2个片段。
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1 PCR阴性对照；2 λ DNA HindⅢ/EcoRⅠ;3 PCR阳性对照；
4 重组质粒PCR结果；5 重组质粒BglⅡ、XhoⅠ酶切结果；
6、7 分别为重组质粒BglⅡ或XhoⅠ酶切结果；8 未消化的重组质粒图谱
图2 pXT1-HBV/C重组质粒PCR和酶切鉴定结果
三、重组质粒转染B细胞的筛选
利用脂质体介导重组质粒pXT1-HBV/C转染的B细胞，在新霉素选择培养6天后，对照的B细胞全部死亡；转染的B细胞中也有大量死亡，仅见小量散在的新霉素抗性细胞生长，减半抗生素浓度培养3周后传代扩增，继续培养2周后可用于检测。
四、转染的B细胞目的DNA的检测
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常规提取宿主细胞基因组DNA为模板，以引物P1、P2可扩增出与目的DNA相同大小的片段。并同时检测到neo基因。
五、重组质粒pXT1-HBV/C在永生化人外周血B细胞中的表达
流式细胞检测结果见图3。以未转染的永生化B细胞为阴性对照，在检测重组质粒转染的B细胞中，表达HBcAg的细胞占47.4%。
检测细胞数为4 219个,阳性数为2 000个,阳性率为47.4%;M1：阳性细胞荧光强度域值
图3 重组质粒在永生化人B细胞中表达的流式
细胞仪检测结果
讨论
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HBcAg是HBV特异性CTL的主要靶抗原，在乙型肝炎的发病机制中起着重要作用[1]。HBV/C区碱基突变，往往影响HBcAg特异性的CTL作用表位，从而与疾病活动有关[2，3]。但HBV变异引起疾病活动改变的机制至今尚未阐明。为研究HBV/C基因变异的生物学意义，我们应用逆转录病毒载体构建了HBV/C基因的表达载体，并在永生化的人外周血B细胞中表达目的蛋白，为研究HBV/C基因变异的生物学意义打下基础。
质粒pXT1为复制缺陷型逆转录病毒并能在胚胎细胞和成人细胞中高效持续表达外源基因[4]。它是在质粒pXm5的基础上，加上Moloney白血病病毒的长末段复制片段(LTRs)和部分gag基因区段，LTRs启动新霉素抗性基因的表达；单纯疱疹病毒TK启动子启动外源基因的表达。逆转录病毒载体介导的基因转移是将外源性基因导入靶细胞的有效手段，它不但能高效地将外源基因转入靶细胞，而且能将外源基因有效地整合到宿主细胞基因组中，并随细胞分裂传给子代，使外源基因在宿主细胞中永久表达。为此，我们利用逆转录病毒转移外源基因的高效性和在宿主细胞中表达的持久性，构建了逆转录病毒表达载体pXT1-HBV/C重组质粒，并在人永生化的B细胞中得以持久表达，为系列观察HBV/C基因变异的生物学活性创造条件。
, http://www.100md.com
人外周血B细胞经EB病毒永生化后，可长久地传代，由于人外周血B细胞取自于被研究的宿主，HLA亚型与宿主其它细胞匹配，经转染目的基因后，不仅可研究目的基因在宿主细胞中的表达情况，还可作为靶细胞与自身的HBcAg特异性CTL相互作用，以观察细胞毒作用。
本课题受国家自然科学基金资助(编号：39570037)
参考文献
1 Ferrari C, Penna A, Bertoletti A,et al. Cellular immune response to hepatitis B virus-encoded antigens in acute and chronic hepatitis B virus infection. J Immunol, 1990,145:3443-3449.
2 骆抗先，朱幼芙，杨洁，等.乙型肝炎病毒感染时的C基因热点变异.中华实验和临床病毒学杂志，1997，11：29-32.
3 骆抗先，侯金林，梁炽森.乙型肝炎病毒感染及病毒变异.中华传染病杂志，1996，14：101-104.
4 Boulter CA, Wagner EF. A universal retroviral vector for efficient constitutive expression of exogenous genes. Nucleic Acids Research, 1987, 15:7194-7195.
(收稿：1998-12-07 修回：1999-04-02), http://www.100md.com