怀山药的离体繁殖△
作者：李明军 李金亭 朱命炜 张嘉宝
单位：河南师范大学生物系(新乡 453002)
关键词：怀山药；节培养；多芽体；再生植株
990428 摘 要 怀山药带节茎段在MS+6-BA 1～2 mg/L+NAA 0.1～1 mg/L的培养基上培养，均能直接形成多芽体，均芽数为3～5。将多芽体转入MS或MS+KT 2 mg/L+NAA 0.02 mg/L+PP333 0.1 mg/L的培养基上均能诱导生根，形成再生植株。但后者形成的苗生长健壮，叶色浓绿，有较强的生活力。
In vitro Propagation of Common Yam (Dioscorea opposita)
Li Mingjun, Li Jinting, Zhu Mingwei, et al.
, http://www.100md.com
(Department of Biology, Henan Normal University, Xinxiang 453002)
Abstract Dioscorea opposita Thunb.was micropropagated from nodal culture.This species produced 3～5 buds per node when cultured on modified MS Medium supplemented with 6-BA 1～2 mg/L and NAA 0.1～1 mg/L. Root could be induced when these multibuds were transplanted onto MS basic Medium or MS basic Medium supplemented with KT 2 mg/L， PP333 0.1 mg/L and NAA 0.02 mg/L. The regenerated plantlets treated with PP333 grew robustly and developed deep green leaves with vigour.
, 百拇医药
Key words Dioscorea opposita Thunb. nodal culture multiple buds regenerated plantlets
怀山药又名薯蓣 Dioscorea opposita Thunb.，为薯蓣科薯蓣属的一种缠绕草本肉质根状茎植物，是我国著名的“四大怀药”之一，主产于河南温县、武陟、沁阳、博爱等地，以根状茎和珠芽(中药称为余零子，俗称山药蛋)入药。具有健脾、固精、补肺、益肾的功能，主治肺虚咳嗽、脾虚、腹泻、糖尿病、遗精尿频、赤白带下等症，因其药用价值高、品质好，故其产品畅销国内外[1、2]。但由于长期进行营养繁殖，致使其品质退化，产量降低，某些优良品种(如铁棍山药)已被广大药农放弃种植，几乎处于濒临灭绝的境地，因此，改善品质，提高产量，并使其优良品种迅速推广种植，已成为怀山药生产中亟待解决的一个重要问题。
植物组织培养技术的发展为植物品种的改良提供了一个重要的手段。70年代中期，植物组织培养技术开始在薯蓣属植物中应用，并在某些种的快速繁殖中获得成功[3、4]。为解决怀山药生产中存在的问题，近年来我们开展了怀山药的组织培养，对茎尖、叶片、茎段、余零子等不同外植体的培养进行了广泛的研究，并通过器官发生途径成功地建立起了植株再生繁殖体系[5]。但这种繁殖方式可能会产生体细胞无性系变异，不利于优良品种的快速繁殖[6]。通过节培法既可以达到快繁的目的，又能使优良品种的优良种性得以保持，这在薯蓣属的某些种中已有报道[7，8]。为此，我们也开展了利用怀山药带芽茎段进行微型繁殖的研究。现将这方面的研究结果报道如下。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 材料：怀山药Dioscorea opposita 优良品种“铁棍山药”，来自河南温县农科所，由王乾琚高级农艺师提供。
1.2 方法：按前法[5]获得无菌试管苗并进行继代培养。将继代培养达3年的无菌苗在超净工作台上切成长0.5 cm左右的带一芽茎段，接种在诱导多芽形成的不同培养基上，40 d后统计结果(表1)。多芽形成后将其转入壮苗生根培养基中，以获得完整的再生植株。
基本培养基为MS，并附加不同种类的植物生长调节剂，如BA、KT、GA和PP333等，蔗糖浓度为3%、6%和8%，琼脂为0.8%，调pH为5.8，在121°C，108 kPa的条件下高压灭菌20 min。
培养条件为温度25°C，光强2 000 lx，每天光照 16 h。
, 百拇医药
2 结果与讨论
将带节茎段接种在表1的12种培养基中，3 d后有芽萌发生长(如10号)。7 d后，大部分茎段上的芽也开始膨大、生长，如CK：1、2、3、4、5、6、9、10号等。14 d后开始形成多芽体(如10号)。30 d后，除CK(只有单芽)外，所有培养基中都有2个以上的芽(即多芽体)的形成，其中7号培养茎中芽最多(图1)。40 d后，培养茎段的出芽率及每个茎段的平均芽数(即均芽数)见表1。
表1 不同激素及其组合对带芽茎段多芽体形成的影响 培养基
序号
激素浓度
(mg/L)
蔗糖浓度(%)
茎段数
, 百拇医药
(个)
芽数
(个)
出芽率
(%)
均芽数
(个)
CK
0
3
12
12
100
1
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1
6-BA 1+NAA 0.1
3
24
24
100
3
2
6-BA 1+NAA 0.5
3
27
20
55.6
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3
3
6-BA 1+NAA 1
3
21
20
71.4
4
4
6-BA 2+NAA 0.1
3
24
24
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100
3
5
6-BA 2+NAA 0.5
3
24
18
75
4
6
6-BA 2+NAA 1
3
18
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18
100
5
7
6-BA 1+NAA 0.1
3
24
18
75
7
+PP333 0.5
8
6-BA 1+NAA 0.1
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3
24
18
75
2
+GA 0.5
9
6-BA 8
3
21
12
57.1
2
, 百拇医药 10
6-BA 8
6
24
15
62.5
3
11
6-BA 8
8
21
18
85.7
4
, 百拇医药
图1 怀山药带芽茎段形成的多芽体
在不附加任何外源激素的MS培养基上，叉蕊薯蓣带芽段不能增长[8]，而怀山药带芽茎段不仅可以萌发，而且出芽率为100%(表1)，造成这种差别的原因除了植物种类不同外，可能与离体培养的时间有关，前者直接从田间取材，后者则采用离体培养达3 年之久的无菌苗。这样就造成了两种植物的相同外植体(带芽茎段)内源激素水平的不同。同时还发现，芽茎段虽然能在无任何外源激素的MS培养基上萌发，且分化的苗生长旺盛(高达5 cm左右，有少量白色细根出现)，但由于每个带芽茎段仅能形成一个单芽，繁殖系数较低，不能用于优良品种的大量繁殖。
6-BA(1～2)与NAA(0.1～1)配合使用可以使带芽茎段形成多芽体，使均芽数达到3～5个，其中1、4、6号培养基中出芽率分别为100%。而6号培养基中均芽数最高(为5)，这些组合中芽的生长速度虽然不及对照快，但由于繁殖系数高，适用于优良种苗的离体繁殖，这些结果与Lahzer等(1992)和张宗勤等(1998)报道的结果基本一致。
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从表1可以看出，PP333和GA都降低了带芽茎段的出芽率，但PP333却大大地提高了均芽数，在所有处理中为最高(达到7)，而GA却降低了均芽数(与1号相比，仅为2)。从形态上来看，GA使芽形成的苗细高(约3 cm)，而PP333却使苗矮壮(高约1 cm)。GA是一种促进植物生长的激素，而PP333则是专一地抑制GA生物合成的一种植物生长延缓剂[9]。本实验结果表明：GA不利于芽的分化：PP333对多芽体的形成有显著的促进作用，它可能是通过降低植物体内GA的含量而实现的。
图2 多芽体诱导生根
张宗勤的实验指出，在MS单独附加6-BA 8 mg/L时，无论蔗糖浓度为30 g/L或80 g/L，经1 个月的培养均能使叉蕊薯蓣的带芽茎段形成微型薯蓣[8]。在相同的条件下，我们在怀山药带芽茎段的培养中却始终未观察到这种现象。但却发现，随着蔗糖浓度的提高，带芽茎段的出芽率和均芽数均增加(表1)。这说明，高浓度的蔗糖可以促进芽的萌发和多芽体的形成。需要指出的是，高浓度的6-BA 与高浓度的蔗糖组合形成的多芽比较短粗、饱满，但不利于后期生长(因为这样的多芽体无根且生长缓慢，转入生根培养基后，不易生根且生长也非常缓慢)，有时还观察到畸形苗的出现，故这样的组合不能用于优良品种的快速繁殖。
, 百拇医药
形成的多芽体在40 d时一般无根产生。将这些多芽体转入MS或MS+KT 2mg/L+PP333 0.1 mg/L+NAA 0.02 mg/h培养基中培养15 d后即可诱导生根。但前者形成的根细长，后者形成的根则短粗(图2)。从整株形态来看，前者生长的苗高而细弱，叶色淡绿，而后者形成的苗则健壮，叶色浓绿，更适合移栽入大田。造成这种差异的原因可能与PP333能够改善试管苗的素质，并使其根系发达，生长健壮，适应外界环境能力较强[10]有关。
*Address:Li Mingjun ,Department of Biology ,Henan Normal University ,Xinxiang
李明军，男，副教授，1985年获中国科学院植物研究所理学硕士学位。现在河南师范大学生物系任教，多年来一直从事植物生理学的地毯学与植物组织培养方面的研究工作。近年来在国内外学术期刊上发表或在学术会议上交流的研究论文30余篇，参编专著3部，主持“四大杯药产业化技术研究”等四项河南省科技攻关项目和省科委、省教委的自然科学基金研究项目。主持的“怀山药快繁体系的建立”项目获河南省高等校成果暨全省科技成果展示会银奖。
, 百拇医药
△河南省自然科学基金和省科技攻关项目
参 考 文 献
1 江苏新医学院编.中药大词典.上册.上海：上海科技出版社，1977：167
2 姚宗凡，等主编.常用中药种植技术.北京：金盾出版社，1993：70
3 Lakshmi SG,et al.J Hort.Sci 1976，51：551
4 Mantell SH,et al.J Hort Sci,1978,53:95
5 李明军，等.植物生理学通讯，1997，33(4)：275
6 Thanutong P I,et al.Theor Appl Genet,1983,66:209
7 Lauzer D,et al.Plant Cell Tissue and Organ Culture,1992,28(2):215
8 张宗勤，等.生物技术，1998，8(1)：18
9 李明军.植物学通报，1995，12(2)：27
10 李明军，等.作物学报，1997，23(6)：759
(1998-07-20收稿), 百拇医药
单位：河南师范大学生物系(新乡 453002)
关键词：怀山药；节培养；多芽体；再生植株
990428 摘 要 怀山药带节茎段在MS+6-BA 1～2 mg/L+NAA 0.1～1 mg/L的培养基上培养，均能直接形成多芽体，均芽数为3～5。将多芽体转入MS或MS+KT 2 mg/L+NAA 0.02 mg/L+PP333 0.1 mg/L的培养基上均能诱导生根，形成再生植株。但后者形成的苗生长健壮，叶色浓绿，有较强的生活力。
In vitro Propagation of Common Yam (Dioscorea opposita)
Li Mingjun, Li Jinting, Zhu Mingwei, et al.
, http://www.100md.com
(Department of Biology, Henan Normal University, Xinxiang 453002)
Abstract Dioscorea opposita Thunb.was micropropagated from nodal culture.This species produced 3～5 buds per node when cultured on modified MS Medium supplemented with 6-BA 1～2 mg/L and NAA 0.1～1 mg/L. Root could be induced when these multibuds were transplanted onto MS basic Medium or MS basic Medium supplemented with KT 2 mg/L， PP333 0.1 mg/L and NAA 0.02 mg/L. The regenerated plantlets treated with PP333 grew robustly and developed deep green leaves with vigour.
, 百拇医药
Key words Dioscorea opposita Thunb. nodal culture multiple buds regenerated plantlets
怀山药又名薯蓣 Dioscorea opposita Thunb.，为薯蓣科薯蓣属的一种缠绕草本肉质根状茎植物，是我国著名的“四大怀药”之一，主产于河南温县、武陟、沁阳、博爱等地，以根状茎和珠芽(中药称为余零子，俗称山药蛋)入药。具有健脾、固精、补肺、益肾的功能，主治肺虚咳嗽、脾虚、腹泻、糖尿病、遗精尿频、赤白带下等症，因其药用价值高、品质好，故其产品畅销国内外[1、2]。但由于长期进行营养繁殖，致使其品质退化，产量降低，某些优良品种(如铁棍山药)已被广大药农放弃种植，几乎处于濒临灭绝的境地，因此，改善品质，提高产量，并使其优良品种迅速推广种植，已成为怀山药生产中亟待解决的一个重要问题。
植物组织培养技术的发展为植物品种的改良提供了一个重要的手段。70年代中期，植物组织培养技术开始在薯蓣属植物中应用，并在某些种的快速繁殖中获得成功[3、4]。为解决怀山药生产中存在的问题，近年来我们开展了怀山药的组织培养，对茎尖、叶片、茎段、余零子等不同外植体的培养进行了广泛的研究，并通过器官发生途径成功地建立起了植株再生繁殖体系[5]。但这种繁殖方式可能会产生体细胞无性系变异，不利于优良品种的快速繁殖[6]。通过节培法既可以达到快繁的目的，又能使优良品种的优良种性得以保持，这在薯蓣属的某些种中已有报道[7，8]。为此，我们也开展了利用怀山药带芽茎段进行微型繁殖的研究。现将这方面的研究结果报道如下。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 材料：怀山药Dioscorea opposita 优良品种“铁棍山药”，来自河南温县农科所，由王乾琚高级农艺师提供。
1.2 方法：按前法[5]获得无菌试管苗并进行继代培养。将继代培养达3年的无菌苗在超净工作台上切成长0.5 cm左右的带一芽茎段，接种在诱导多芽形成的不同培养基上，40 d后统计结果(表1)。多芽形成后将其转入壮苗生根培养基中，以获得完整的再生植株。
基本培养基为MS，并附加不同种类的植物生长调节剂，如BA、KT、GA和PP333等，蔗糖浓度为3%、6%和8%，琼脂为0.8%，调pH为5.8，在121°C，108 kPa的条件下高压灭菌20 min。
培养条件为温度25°C，光强2 000 lx，每天光照 16 h。
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2 结果与讨论
将带节茎段接种在表1的12种培养基中，3 d后有芽萌发生长(如10号)。7 d后，大部分茎段上的芽也开始膨大、生长，如CK：1、2、3、4、5、6、9、10号等。14 d后开始形成多芽体(如10号)。30 d后，除CK(只有单芽)外，所有培养基中都有2个以上的芽(即多芽体)的形成，其中7号培养茎中芽最多(图1)。40 d后，培养茎段的出芽率及每个茎段的平均芽数(即均芽数)见表1。
表1 不同激素及其组合对带芽茎段多芽体形成的影响 培养基
序号
激素浓度
(mg/L)
蔗糖浓度(%)
茎段数
, 百拇医药
(个)
芽数
(个)
出芽率
(%)
均芽数
(个)
CK
0
3
12
12
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1
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1
6-BA 1+NAA 0.1
3
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24
100
3
2
6-BA 1+NAA 0.5
3
27
20
55.6
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3
3
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3
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20
71.4
4
4
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3
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100
3
5
6-BA 2+NAA 0.5
3
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18
75
4
6
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3
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18
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6-BA 1+NAA 0.1
3
24
18
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7
+PP333 0.5
8
6-BA 1+NAA 0.1
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3
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2
+GA 0.5
9
6-BA 8
3
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12
57.1
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62.5
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85.7
4
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图1 怀山药带芽茎段形成的多芽体
在不附加任何外源激素的MS培养基上，叉蕊薯蓣带芽段不能增长[8]，而怀山药带芽茎段不仅可以萌发，而且出芽率为100%(表1)，造成这种差别的原因除了植物种类不同外，可能与离体培养的时间有关，前者直接从田间取材，后者则采用离体培养达3 年之久的无菌苗。这样就造成了两种植物的相同外植体(带芽茎段)内源激素水平的不同。同时还发现，芽茎段虽然能在无任何外源激素的MS培养基上萌发，且分化的苗生长旺盛(高达5 cm左右，有少量白色细根出现)，但由于每个带芽茎段仅能形成一个单芽，繁殖系数较低，不能用于优良品种的大量繁殖。
6-BA(1～2)与NAA(0.1～1)配合使用可以使带芽茎段形成多芽体，使均芽数达到3～5个，其中1、4、6号培养基中出芽率分别为100%。而6号培养基中均芽数最高(为5)，这些组合中芽的生长速度虽然不及对照快，但由于繁殖系数高，适用于优良种苗的离体繁殖，这些结果与Lahzer等(1992)和张宗勤等(1998)报道的结果基本一致。
, http://www.100md.com
从表1可以看出，PP333和GA都降低了带芽茎段的出芽率，但PP333却大大地提高了均芽数，在所有处理中为最高(达到7)，而GA却降低了均芽数(与1号相比，仅为2)。从形态上来看，GA使芽形成的苗细高(约3 cm)，而PP333却使苗矮壮(高约1 cm)。GA是一种促进植物生长的激素，而PP333则是专一地抑制GA生物合成的一种植物生长延缓剂[9]。本实验结果表明：GA不利于芽的分化：PP333对多芽体的形成有显著的促进作用，它可能是通过降低植物体内GA的含量而实现的。
图2 多芽体诱导生根
张宗勤的实验指出，在MS单独附加6-BA 8 mg/L时，无论蔗糖浓度为30 g/L或80 g/L，经1 个月的培养均能使叉蕊薯蓣的带芽茎段形成微型薯蓣[8]。在相同的条件下，我们在怀山药带芽茎段的培养中却始终未观察到这种现象。但却发现，随着蔗糖浓度的提高，带芽茎段的出芽率和均芽数均增加(表1)。这说明，高浓度的蔗糖可以促进芽的萌发和多芽体的形成。需要指出的是，高浓度的6-BA 与高浓度的蔗糖组合形成的多芽比较短粗、饱满，但不利于后期生长(因为这样的多芽体无根且生长缓慢，转入生根培养基后，不易生根且生长也非常缓慢)，有时还观察到畸形苗的出现，故这样的组合不能用于优良品种的快速繁殖。
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形成的多芽体在40 d时一般无根产生。将这些多芽体转入MS或MS+KT 2mg/L+PP333 0.1 mg/L+NAA 0.02 mg/h培养基中培养15 d后即可诱导生根。但前者形成的根细长，后者形成的根则短粗(图2)。从整株形态来看，前者生长的苗高而细弱，叶色淡绿，而后者形成的苗则健壮，叶色浓绿，更适合移栽入大田。造成这种差异的原因可能与PP333能够改善试管苗的素质，并使其根系发达，生长健壮，适应外界环境能力较强[10]有关。
*Address:Li Mingjun ,Department of Biology ,Henan Normal University ,Xinxiang
李明军，男，副教授，1985年获中国科学院植物研究所理学硕士学位。现在河南师范大学生物系任教，多年来一直从事植物生理学的地毯学与植物组织培养方面的研究工作。近年来在国内外学术期刊上发表或在学术会议上交流的研究论文30余篇，参编专著3部，主持“四大杯药产业化技术研究”等四项河南省科技攻关项目和省科委、省教委的自然科学基金研究项目。主持的“怀山药快繁体系的建立”项目获河南省高等校成果暨全省科技成果展示会银奖。
, 百拇医药
△河南省自然科学基金和省科技攻关项目
参 考 文 献
1 江苏新医学院编.中药大词典.上册.上海：上海科技出版社，1977：167
2 姚宗凡，等主编.常用中药种植技术.北京：金盾出版社，1993：70
3 Lakshmi SG,et al.J Hort.Sci 1976，51：551
4 Mantell SH,et al.J Hort Sci,1978,53:95
5 李明军，等.植物生理学通讯，1997，33(4)：275
6 Thanutong P I,et al.Theor Appl Genet,1983,66:209
7 Lauzer D,et al.Plant Cell Tissue and Organ Culture,1992,28(2):215
8 张宗勤，等.生物技术，1998，8(1)：18
9 李明军.植物学通报，1995，12(2)：27
10 李明军，等.作物学报，1997，23(6)：759
(1998-07-20收稿), 百拇医药