基因重组碱性成纤维细胞生长因子对急性坏死性胰腺炎犬肠道细菌移位的影响
作者：吴承堂 黄祥成 齐德林 黎沾良
单位：吴承堂 黄祥成 齐德林 第一军医大学南方医院普外科，广州，510515；黎沾良 中国人民解放军304医院普外科，北京，100037)
关键词：碱性成纤维细胞生长因子；胰腺炎；细菌移位
基因重组碱性成纤维细胞生长因子对急性坏死性胰腺炎犬肠道细菌移位的影响摘要：目的 探讨基因重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对急性坏死性胰腺炎 (ANP) 犬肠道细菌移位的影响。方法 杂种犬23只，分对照组(n=7)、ANP组(n=8)和bFGF组(n=8)。bFGF组犬复制ANP模型后，每日静脉注射bFGF(5μg/kg)。结果 bFGF治疗后，ANP犬肠粘膜损伤明显减轻，脏器细菌培养阳性率下降50%，细菌移位数量减少93.3%～96.7%，肠粘膜蛋白质、DNA含量显著增加(P<0.05)，丙二醛含量明显减少(P<0.05)。结论 bFGF可显著减少ANP时肠道细菌移位，其机制可能是通过增加肠粘膜蛋白质合成，促进肠粘膜损伤修复。
, 百拇医药
中图分类号：R576
Effects of basic fibroblast growth factor on reducing intestinal bacterial translocation in acute necrotizing pancreatitis in dogs
Wu Chengtang1, Huang Xiangcheng1, Qi Delin1, Li Zhanliang2
1 Department of General Surgery, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510515; 2304th Hospital of PLA, Beijing, 100037Abstract: Objective To observe the effects of basic fibroblast growth factor (bFGF) on intestinal bacterial translocation in dogs with acute necrotizing pancreatitis (ANP). Methods 23 mongrel dogs were divided into three groups: control group (n=7), ANP group (n=8) and bFGF group (n=8). The dogs in bFGF group were treated by intravenous injection of bFGF (5 μg/kg). Results After treatment with bFGF, the injury of intestinal mucosa abated, the levels of protein and DNA of ileal mucosa were increased significantly (P<0.05), but malodialdehyde level was reduced. As a result, intestinal bacterial translocation (BT) rate of the organs was decreased by 50%, BT and the number of translocated bacteria reduced by 93.3%～96.7%. Conclusion bFGF can reduce intestinal bacterial translocation in ANP, and the pathogensis is related to the increase of protein synthesis of intestinal mucosa and the improvement of the repair of intestinal mucosa.
, 百拇医药
Key words: pancreatitis; bacterial translocation; basic fibroblast growth factor
急性坏死性胰腺炎(Acute necrotizing pancreatitis, ANP)可引起肠粘膜屏障功能破坏、肠通透性增加，促发肠道细菌移位和内毒素血症[1,2]，同时也可造成多器官功能衰竭。已观察到应用基因重组碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor, bFGF)可减轻肠系膜动脉夹闭所致肠道、肝、肾等脏器损伤，同时证明它能显著减少肠道细菌移位发生率[3]。本研究观察bFGF对ANP时肠道细菌移位的影响，并就其作用机制进行探讨。
1材料和方法
1.1动物模型与分组 杂种犬23只，雌雄不限，体质量(15±2)kg，随机分为三组：ANP组(n=8)、对照组(n=7)和bFGF治疗组(n=8)。对照组仅行简单剖腹手术；ANP组入腹后，沿十二指肠系膜缘找到主胰管，分离解剖主胰管后，将其肠端结扎，胰端切开并置入直径2 mm的塑料管，并以7.6 kPa恒定压力向胰管内注入5%牛磺胆酸钠(0.5 ml/kg)和胰蛋白酶(3 000 U/kg)，维持15 min，即可见胰腺包膜下出血、水肿；bFGF组手术复制ANP模型后，术后每天经静脉注射bFGF(5μg/kg)。所有动物术后第7天处死。
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1.2病理学观察 各组犬活杀后取胰、回肠组织，HE和细菌染色后光镜观察。另取回肠组织标本，用3%戊二醛固定，1%四氧化锇后固定，Epon812树脂包埋，做超薄切片，醋酸铀、枸椽酸铅染色，JME-1200EX透射电镜观察。
1.3回肠粘膜绒毛形态学测量 采用CIAS图像分析系统(301医院计算机室)测量回肠粘膜绒毛高度、宽度和面积。
1.4检测指标 术后第1、2、4、7天分别采血并分离血浆，采用改良新过氯酸法预处理血浆，鲎试剂基质显色定量测定血浆中内毒素(LPS)浓度(所用试剂盒系日本化学工业株式会社(LS-1)及上海医学化验所产品)。上述时间点采血留取血清，碘-淀粉法测定血清胰淀粉酶(AMY)活性。第七天活杀时，无菌剪取肝、胰、脾、肺、肾和肠系膜淋巴结(MLN)进行细菌培养，计算细菌移位率。取回肠组织0.1～0.2g，制成匀浆液，进行DNA提取，同时测定匀浆液中蛋白含量[4]；肠组织丙二醛(MDA)采用南京建成生物研究所提供的试剂盒检测。
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1.5统计学处理 数据作F检验，结果以
±s表示。
2结果
2.1病理学检查 对照组犬胰腺腺泡、肠粘膜于光镜及电镜下观察均无异常。光镜下ANP组犬胰腺腺泡大片出血、坏死，大量中性白细胞浸润；肠粘膜上皮绒毛脱落、变短，破损处有细菌侵入。bFGF组胰腺仅残留极少数坏死腺泡，间质轻度充血水肿，少量炎性细胞浸润，大部分腺泡结构恢复正常；肠粘膜上皮尚完整，未见细菌侵入。电镜下ANP组肠粘膜微绒毛长短不一，排列不整齐，部分上皮脱落、减少。bFGF组肠粘膜微绒毛排列整齐，胞内细胞器结构大致正常。
2.2回肠粘膜绒毛形态学测量 与ANP组比较，bFGF组肠粘膜绒毛高度、宽度显著增加(P<0.01～0.05)，面积扩大(P<0.01)。
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2.3脏器细菌培养结果 对照组除两只犬肠系膜淋巴结中检出细菌外，其余脏器培养均为阴性。ANP组MLN全部培养阳性，胰、肝的阳性率为7/8，肺、肾、脾脏最低为4/8。BFGF组各脏器细菌培养阳性结果：MLN4/8，胰肝3/8，肺、肾、脾2/8。bFGF组脏器移位细菌数量减少93.3%～96.7%(表1，P<0.01)。
表1 术后第7天各脏器移位细菌计数 (CFUlog/g，±s)
Tab. 1 Population of bacterial translocation of organs at the 7th postoperative day Group
n
, 百拇医药
Pancreas
Liver
Spleen
Kidneys
Lungs
MLN
Control
7
0**
0**
0**
0**
0**
, 百拇医药
2.54±0.39**
ANP
8
3.76±0.54
3.71±0.55
3.52±0.49
3.24±0.39
3.83±0.56
4.13±0.59
bFGF
8
2.12±0.34**
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2.08±0.22**
2.14±0.23**
2.08±0.15**
2.27±0.24**
2.16±0.44**
** P <0.01 vs the ANP group
2.4回肠组织蛋白、DNA含量和MDA水平 与ANP组相比，bFGF组回肠组织蛋白含量增加40%(P<0.05)、DNA含量显著增加120%(P<0.05)，MDA含量则减少58%(P<0.05)。
2.5血浆LPS 与ANP组相比，bFGF组血浆内毒素水平第2天以后显著降低，于第7天降至正常水平(P<0.01，表2)。
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表2 术后血浆LPS水平(Eu/L)
Tab. 2 Plasma levels of LPS in preoperative day Group
D1
D2
D4
D7
Control
68±5**
74±8**
64±9**
66±7**
, 百拇医药
ANP
217±85
346±127
268±54
107±64
bFGF
205±96
185±76*
106±22*
59±9*
* P <0.05 ** P<0.01 vs the ANP group; LPS: Lipopolysaccharide
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2.6血清AMY 与ANP组相比，bFGF组术后第2天始血中胰淀粉酶显著降低50%(P<0.01)，并于第7天降至正常水平(P<0.01)。
3讨论
基因重组碱性成纤维细胞生长因子是一种多功能生物活性物质，通过其促有丝分裂效应和非促分裂激素样活性，对来源于中胚层及神经外胚层的细胞具有营养和促增殖作用[5]。此外，bFGF具有上皮细胞和成纤维细胞化学趋化剂的作用，可促使这两种细胞有丝分裂，促进肉芽组织生长，参与并促进组织损伤修复。目前研究表明[3,5]，bFGF可明显减轻肝、肾、肠缺血性损伤和加速手术创面的愈合，减少细菌移位的发生率。提示bFGF在保护脏器损伤和促进肠粘膜损伤修复方面可能具有广阔的应用前景。
本研究结果表明，静脉注射基因重组bFGF，可显著降低ANP时血中淀粉酶水平，增加肠组织中蛋白质和DNA含量，并使肠组织MDA产量下降。提示bFGF对急性坏死性胰腺炎时肠道损伤具有显著保护效应，其机制可能是通过如下作用实现的：(1)bFGF的两种生物学效应可促进脏器组织中细胞增殖，加速创面修复。(2)诱导细胞DNA表达，增加肠粘膜等脏器蛋白质合成。(3)bFGF参与细胞内外钙离子调节，减轻缺血条件下细胞内钙离子超负荷所致细胞毒性作用[3]。(4)促进脏器抗氧化酶的转化，减轻氧自由基对脏器的损伤。(5)使血中淀粉酶水平降低，减轻ANP时胰酶对脏器组织的破坏。
, 百拇医药
本研究还进一步发现，应用基因重组bFGF治疗ANP后，肝、胰、脾、肺、肾和肠系膜淋巴结细菌培养阳性率减少50%，脏器细菌移位数量则减少了93.3%～96.7%，表明静脉注射bFGF能显著降低ANP时脏器细菌移位的发生率。bFGF减少ANP时细菌移位，可能是与促进受损肠粘膜修复有关。由于肠上皮细胞上存在bFGF受体，补充外源性bFGF与之结合后，可增加其高亲和力受体的表达，使受体数目增加而发挥其生物学作用，加速肠粘膜上皮的增殖和修复，肠粘膜上皮完整则可有效阻止肠道细菌和毒素的入侵和移位。
注：全军重点科研基金资助项目
作者简介：吴承堂，男，1967年出生；1996年毕业于解放军军医进修学院；硕士、主治医师、讲师：电话85141695
参考文献
1 吴承堂，黎沾良. 急性坏死性胰腺炎时肠通透性及病理改变实验观察. 第一军医大学学报，1999,19(1):28
, 百拇医药
2 吴承堂，黎沾良. 急性坏死性胰腺炎并发感染的机理研究. 中华外科杂志，1998,36(4):230
3 付小兵，王亚平，叶一秀等. 碱性成纤维细胞生长因子对肠道与肝缺血性损伤的影响. 解放军医学杂志，1996,21:121
4 Brodford MM. Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle protein-dye binding. Anal Biochem, 1976,72:248
5 Cuevas P, Carceller F, Ortega R et al. Hypotensive activity of fibroblast growth factor. Science, 1992,254:1208
(收稿日期：1998-11-02), 百拇医药
单位：吴承堂 黄祥成 齐德林 第一军医大学南方医院普外科，广州，510515；黎沾良 中国人民解放军304医院普外科，北京，100037)
关键词：碱性成纤维细胞生长因子；胰腺炎；细菌移位
基因重组碱性成纤维细胞生长因子对急性坏死性胰腺炎犬肠道细菌移位的影响摘要：目的 探讨基因重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对急性坏死性胰腺炎 (ANP) 犬肠道细菌移位的影响。方法 杂种犬23只，分对照组(n=7)、ANP组(n=8)和bFGF组(n=8)。bFGF组犬复制ANP模型后，每日静脉注射bFGF(5μg/kg)。结果 bFGF治疗后，ANP犬肠粘膜损伤明显减轻，脏器细菌培养阳性率下降50%，细菌移位数量减少93.3%～96.7%，肠粘膜蛋白质、DNA含量显著增加(P<0.05)，丙二醛含量明显减少(P<0.05)。结论 bFGF可显著减少ANP时肠道细菌移位，其机制可能是通过增加肠粘膜蛋白质合成，促进肠粘膜损伤修复。
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中图分类号：R576
Effects of basic fibroblast growth factor on reducing intestinal bacterial translocation in acute necrotizing pancreatitis in dogs
Wu Chengtang1, Huang Xiangcheng1, Qi Delin1, Li Zhanliang2
1 Department of General Surgery, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510515; 2304th Hospital of PLA, Beijing, 100037Abstract: Objective To observe the effects of basic fibroblast growth factor (bFGF) on intestinal bacterial translocation in dogs with acute necrotizing pancreatitis (ANP). Methods 23 mongrel dogs were divided into three groups: control group (n=7), ANP group (n=8) and bFGF group (n=8). The dogs in bFGF group were treated by intravenous injection of bFGF (5 μg/kg). Results After treatment with bFGF, the injury of intestinal mucosa abated, the levels of protein and DNA of ileal mucosa were increased significantly (P<0.05), but malodialdehyde level was reduced. As a result, intestinal bacterial translocation (BT) rate of the organs was decreased by 50%, BT and the number of translocated bacteria reduced by 93.3%～96.7%. Conclusion bFGF can reduce intestinal bacterial translocation in ANP, and the pathogensis is related to the increase of protein synthesis of intestinal mucosa and the improvement of the repair of intestinal mucosa.
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Key words: pancreatitis; bacterial translocation; basic fibroblast growth factor
急性坏死性胰腺炎(Acute necrotizing pancreatitis, ANP)可引起肠粘膜屏障功能破坏、肠通透性增加，促发肠道细菌移位和内毒素血症[1,2]，同时也可造成多器官功能衰竭。已观察到应用基因重组碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor, bFGF)可减轻肠系膜动脉夹闭所致肠道、肝、肾等脏器损伤，同时证明它能显著减少肠道细菌移位发生率[3]。本研究观察bFGF对ANP时肠道细菌移位的影响，并就其作用机制进行探讨。
1材料和方法
1.1动物模型与分组 杂种犬23只，雌雄不限，体质量(15±2)kg，随机分为三组：ANP组(n=8)、对照组(n=7)和bFGF治疗组(n=8)。对照组仅行简单剖腹手术；ANP组入腹后，沿十二指肠系膜缘找到主胰管，分离解剖主胰管后，将其肠端结扎，胰端切开并置入直径2 mm的塑料管，并以7.6 kPa恒定压力向胰管内注入5%牛磺胆酸钠(0.5 ml/kg)和胰蛋白酶(3 000 U/kg)，维持15 min，即可见胰腺包膜下出血、水肿；bFGF组手术复制ANP模型后，术后每天经静脉注射bFGF(5μg/kg)。所有动物术后第7天处死。
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1.2病理学观察 各组犬活杀后取胰、回肠组织，HE和细菌染色后光镜观察。另取回肠组织标本，用3%戊二醛固定，1%四氧化锇后固定，Epon812树脂包埋，做超薄切片，醋酸铀、枸椽酸铅染色，JME-1200EX透射电镜观察。
1.3回肠粘膜绒毛形态学测量 采用CIAS图像分析系统(301医院计算机室)测量回肠粘膜绒毛高度、宽度和面积。
1.4检测指标 术后第1、2、4、7天分别采血并分离血浆，采用改良新过氯酸法预处理血浆，鲎试剂基质显色定量测定血浆中内毒素(LPS)浓度(所用试剂盒系日本化学工业株式会社(LS-1)及上海医学化验所产品)。上述时间点采血留取血清，碘-淀粉法测定血清胰淀粉酶(AMY)活性。第七天活杀时，无菌剪取肝、胰、脾、肺、肾和肠系膜淋巴结(MLN)进行细菌培养，计算细菌移位率。取回肠组织0.1～0.2g，制成匀浆液，进行DNA提取，同时测定匀浆液中蛋白含量[4]；肠组织丙二醛(MDA)采用南京建成生物研究所提供的试剂盒检测。
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1.5统计学处理 数据作F检验，结果以
±s表示。2结果
2.1病理学检查 对照组犬胰腺腺泡、肠粘膜于光镜及电镜下观察均无异常。光镜下ANP组犬胰腺腺泡大片出血、坏死，大量中性白细胞浸润；肠粘膜上皮绒毛脱落、变短，破损处有细菌侵入。bFGF组胰腺仅残留极少数坏死腺泡，间质轻度充血水肿，少量炎性细胞浸润，大部分腺泡结构恢复正常；肠粘膜上皮尚完整，未见细菌侵入。电镜下ANP组肠粘膜微绒毛长短不一，排列不整齐，部分上皮脱落、减少。bFGF组肠粘膜微绒毛排列整齐，胞内细胞器结构大致正常。
2.2回肠粘膜绒毛形态学测量 与ANP组比较，bFGF组肠粘膜绒毛高度、宽度显著增加(P<0.01～0.05)，面积扩大(P<0.01)。
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2.3脏器细菌培养结果 对照组除两只犬肠系膜淋巴结中检出细菌外，其余脏器培养均为阴性。ANP组MLN全部培养阳性，胰、肝的阳性率为7/8，肺、肾、脾脏最低为4/8。BFGF组各脏器细菌培养阳性结果：MLN4/8，胰肝3/8，肺、肾、脾2/8。bFGF组脏器移位细菌数量减少93.3%～96.7%(表1，P<0.01)。
表1 术后第7天各脏器移位细菌计数 (CFUlog/g，
±s)Tab. 1 Population of bacterial translocation of organs at the 7th postoperative day Group
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Pancreas
Liver
Spleen
Kidneys
Lungs
MLN
Control
7
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2.54±0.39**
ANP
8
3.76±0.54
3.71±0.55
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bFGF
8
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2.08±0.22**
2.14±0.23**
2.08±0.15**
2.27±0.24**
2.16±0.44**
** P <0.01 vs the ANP group
2.4回肠组织蛋白、DNA含量和MDA水平 与ANP组相比，bFGF组回肠组织蛋白含量增加40%(P<0.05)、DNA含量显著增加120%(P<0.05)，MDA含量则减少58%(P<0.05)。
2.5血浆LPS 与ANP组相比，bFGF组血浆内毒素水平第2天以后显著降低，于第7天降至正常水平(P<0.01，表2)。
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表2 术后血浆LPS水平(Eu/L)
Tab. 2 Plasma levels of LPS in preoperative day Group
D1
D2
D4
D7
Control
68±5**
74±8**
64±9**
66±7**
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ANP
217±85
346±127
268±54
107±64
bFGF
205±96
185±76*
106±22*
59±9*
* P <0.05 ** P<0.01 vs the ANP group; LPS: Lipopolysaccharide
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2.6血清AMY 与ANP组相比，bFGF组术后第2天始血中胰淀粉酶显著降低50%(P<0.01)，并于第7天降至正常水平(P<0.01)。
3讨论
基因重组碱性成纤维细胞生长因子是一种多功能生物活性物质，通过其促有丝分裂效应和非促分裂激素样活性，对来源于中胚层及神经外胚层的细胞具有营养和促增殖作用[5]。此外，bFGF具有上皮细胞和成纤维细胞化学趋化剂的作用，可促使这两种细胞有丝分裂，促进肉芽组织生长，参与并促进组织损伤修复。目前研究表明[3,5]，bFGF可明显减轻肝、肾、肠缺血性损伤和加速手术创面的愈合，减少细菌移位的发生率。提示bFGF在保护脏器损伤和促进肠粘膜损伤修复方面可能具有广阔的应用前景。
本研究结果表明，静脉注射基因重组bFGF，可显著降低ANP时血中淀粉酶水平，增加肠组织中蛋白质和DNA含量，并使肠组织MDA产量下降。提示bFGF对急性坏死性胰腺炎时肠道损伤具有显著保护效应，其机制可能是通过如下作用实现的：(1)bFGF的两种生物学效应可促进脏器组织中细胞增殖，加速创面修复。(2)诱导细胞DNA表达，增加肠粘膜等脏器蛋白质合成。(3)bFGF参与细胞内外钙离子调节，减轻缺血条件下细胞内钙离子超负荷所致细胞毒性作用[3]。(4)促进脏器抗氧化酶的转化，减轻氧自由基对脏器的损伤。(5)使血中淀粉酶水平降低，减轻ANP时胰酶对脏器组织的破坏。
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注：全军重点科研基金资助项目
作者简介：吴承堂，男，1967年出生；1996年毕业于解放军军医进修学院；硕士、主治医师、讲师：电话85141695
参考文献
1 吴承堂，黎沾良. 急性坏死性胰腺炎时肠通透性及病理改变实验观察. 第一军医大学学报，1999,19(1):28
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2 吴承堂，黎沾良. 急性坏死性胰腺炎并发感染的机理研究. 中华外科杂志，1998,36(4):230
3 付小兵，王亚平，叶一秀等. 碱性成纤维细胞生长因子对肠道与肝缺血性损伤的影响. 解放军医学杂志，1996,21:121
4 Brodford MM. Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle protein-dye binding. Anal Biochem, 1976,72:248
5 Cuevas P, Carceller F, Ortega R et al. Hypotensive activity of fibroblast growth factor. Science, 1992,254:1208
(收稿日期：1998-11-02), 百拇医药