粪抗原检测法诊断犬细粒棘球绦虫感染的研究*Ⅲ.双抗体夹心ELISA法检测粪抗原诊断家犬细粒棘球绦虫感染的现场评价
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作者：焦 伟 柴君杰 伊斯拉音.乌其曼 付 承 瞿 群
单位：新疆维吾尔自治区地方病防治研究所卫生部包虫病防治培训基地(乌鲁木齐,830002)
关键词：细粒棘球绦虫；犬；槟榔碱；粪抗原
中国人兽共患病杂志990608 摘 要 本文报道用槟榔碱驱虫法对检测粪抗原诊断家犬细粒棘球绦虫感染的应用价值进行现场比较评价的结果。73只受试犬中有16只对槟榔碱无反应。在导泻成功的57只犬中粪抗原阳性者11只阳性率19.2%。其中驱虫阴性的38只犬中粪抗原阳性者仅2只(5.3%)。在10只驱出细粒棘球绦虫的家犬中8只粪抗原阳性。5只驱出泡状带绦虫的犬中粪抗原阳性者1只，但反应强度低。粪抗原的反应强度与细粒棘球绦虫的感染强度呈正相关(r=0.94)。证明本法可用于家犬细粒棘球绦虫感染的调查。
COPROANTIGEN DETECTION ON DOGS INFECTED WITH
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ECHINOCOCCUS GRANULOSUS
Ⅲ.A field evaluation of coproantigen detection in diagnosis of
E.granuosus infection in dogs with double antibody sandwich ELIS A
Jiao Wei Chai Junjie Israyil.Osman Fu Chen Qu Qun
(National Hydatid Disease Centre of China,Xinjing Institute for End emic Diseases Control and Research,Urumqi 830002)
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ABSTRACT A double antibody sandwich ELISA for coproantigen d egection devaloped in our laboratory were compared against arecoline purgation f or diagnosis of natural infection of Echinococcus granulosus in dogs in a village of hydatid disease endemic area in Xinjiang.A total of 73 dogs wer e examined by arecoline purgation,of which 16 dogs(21.9%) did not purge followi ng standard dosing with arecoline hydrobromide,remaning 57 dogs were successfull y purged.And the total positive rate of coproantigen was 15.7%(9/57).The c oproantigen positive was 5.3%(2/38) in purge negative dogs.10 dogs were purge p ositive for E.granulosus adult worms of which 8 were positive in cop roantigen detection(80%).The degree of reactivity of coproantigen correlated wit h the number of adult worm(r=0.94).The cross reactivity were seen in 1 of 5 dog s infected by T.hydatigena.The preliminary results showed that this ELISA method is an usefull tool for antigen detection in diagnosis of E.gr anulosus infection in dogs.
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KEY WORDS Echinococcus granulosus Dog Coproantigen Dia gnosis Field avaluation
我们用细粒棘球绦虫成虫虫体抗原和抗体系统建立的双抗体夹心ELISA方法经系统的实验研究，证实具有足够的敏感性和特异性[1，2]。本文报道在包虫病流行地区对槟榔碱驱虫和粪抗原检测两种方法进行现场比较研究的结果。
1 材料与方法
1.1 现场概况 新疆呼图壁县西树窝子乡居民主要为回族，以农业生产为主，兼营养羊业。几乎每家都养犬。当地属包虫病流行区，每年都有包虫病人出现。
1.2 槟榔碱驱虫试验 氢溴酸槟榔碱(赤峰药厂)用水配成0.66%浓度 ，按每kg体重0.5ml剂量给药。以兽用注射器，装特制的注射头，伸至犬的舌根处注入药液，使它咽下。给药后1h内排便，尽量收集粪样，置黑色瓷盘中加清水澄清后，仔细挑检成虫。家犬在给药1h后，仍不发生腹泻可予重复给药，反复2～3次给药仍不腹泻者，即为无反应犬。从实验中排除。
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1.3 犬粪标本的收集 用塑料采粪器插入犬的肛门约6cm深处，轻轻捻转后取出，插入已盛有2ml犬粪保存液的试管中，轻轻振摇使犬粪形成悬液，放冰瓶中，经3000r /min离心10min，取上清分装在Eppendorf管中密封，置-20℃下待检。犬粪保存液为pH7.2,0.15mol/L PBS,含0.02%NaN3,0.3%Tween-20,0.05%牛血红蛋白。
1.4 双抗体夹心ELISA:将抗原亲和层析法纯化的免抗E.granulosus虫体抗原的IgG，用pH9.6包被液稀释成10μg/ml浓度，包被PVC板，每孔150 μl，4℃18h后，用0.3%PBS-T洗3次。加含有10%灭活小牛血清的PBS-T 100μl,37℃下封闭1h，洗板，加犬粪标本和灭活小牛血清各50μl，37℃1h,洗板，加1∶200 标记物，37℃1h，洗板，加TMB底物液100μl,37℃30′后加2M H2SO4 50μl，终止反应，读各孔A450。每孔设已知阳性和阴性犬粪质控标本。每份标本均设2孔，以1 8只健康家犬粪便标本为正常对照，取其A450的x+4s为阳性临界值。
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2 结果
2.1 家犬槟榔碱试验结果 受检家犬共73只。采取粪样后进行槟榔碱试验 。16只犬对槟榔碱试验无反应。57只犬导泻成功。驱虫结果见表1。
表1 57只家犬槟榔碱驱虫结果
Tab.1 Results of arecoline purgation in 57 dogs 受试犬数
No.of
dogs tested
感染犬数(%)
No.of dogs infected(%)
细粒棘球绦虫
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E.granulosus
泡状带绦虫
T.hydatigena
多头绦虫
M.multiceps
犬复殖孔绦虫
D.caninum
犬弓首蛔虫
T.caninum
57
10
(17.5)
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5
(8.7)
2
(3.5)
1
(1.8)
2
(3.5)
注：其中细粒棘球绦虫与泡状带绦虫和多头绦虫混合感染各1只。
2.2 粪抗原检测的阳性率 57只家犬中粪抗原阳性者9只，阳性率19.2%。其中感染细粒棘球绦虫的10只犬中，粪抗原阳性者8只。感染泡状带绦虫的5只犬中粪抗原阳性者1只。感染多头绦虫，犬复殖孔绦虫和犬弓首蛔虫的4只犬，均为阴性。在槟榔碱驱虫阴性的38只犬中，粪抗原阳性者仅2只(5.3%)。
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2.3 家犬感染肠道蠕虫的种类、数量与粪抗原检测的关系 由图1可见，细粒棘球绦虫感染的家犬其粪抗原的反应强度随寄生数量增加而增强(r=0.94)，在驱出2条成虫的2只犬中，有1只粪抗原为阳性。在1只细粒棘球绦虫和泡状带绦虫混合感染的犬中，粪抗原的反应强度较高，显示这两种绦虫的粪抗原有相加效应，单纯感染泡状带绦虫的5只犬中有1只粪抗原阳性。
图1 自然感染各种肠道蠕虫的家犬粪抗原检测结果
Fig.1 Fesults of coproantigen detection in dogs
naturally infected with various helmiuths
3 讨论
利用槟榔碱驱虫结果为标准，对粪抗原检测的应用价值进行评价并不是一个完全可靠的指标，因为槟榔碱驱虫效果只有70%[3]。也就是说在槟榔碱驱虫结果为阴性的犬中还可能存在着感染犬。因此，在本次驱虫阴性的38只犬中2只粪抗原阳性犬并不能完全排除细粒棘球绦虫感染的可能。在关于本法特异性的实验研究中，我们已经发现泡状带绦虫抗原与细粒棘球绦虫抗原之间存在着明显的交叉反应。通过降低包被抗体的浓度，可以在很大程度上消除这种交叉反应[2]。本次在1只驱出4条泡状带绦虫的犬粪中检出低滴度粪抗原可能主要是交叉反应的影响，当然也不能完全排除在粪检时漏掉小量细粒棘球绦虫感染的可能性。对于泡状带绦虫感染犬粪中存在的这种低滴度交叉反应需进一步研究。P.S.Craig等在乌拉圭以槟榔碱驱虫法对粪抗原检测诊断犬细粒棘球绦虫感染的价值进行比较研究的结果，在26只驱出细粒棘球绦虫的犬中，有20只粪抗原阳性(76.9%)。而在64只驱虫阴性的犬中仅有1只粪抗原阳性(1.6%)[4]，这些结果与本次研究的结果相近。在犬细粒棘球绦虫感染的诊断上用粪抗原检测来代替传统的槟榔碱驱虫法已经具备了现实的可能性。
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*卫生部科研基金项目(96-1-371)
4 参考文献
1.焦伟，柴君杰，等.粪抗原检测诊断犬细粒棘球绦虫感染的研究Ⅰ.用细粒棘球绦虫虫体抗原—抗体系统检测粪抗原方法的建立.地方病通报，1998,13(2):16.
2.焦伟，柴君杰，等.粪抗原检测法诊断犬细粒棘球绦虫感染的研究Ⅱ.粪抗原检测的敏感性 、特异性及实验感染犬排出粪抗原的动态观察.中国人兽共患病杂志，1999,15(6):.
3.WHO.Guidline for surveillance,prevention and control of Echinococcosis/Hydatid osis.J Eckert(Editor).FAO/UNEP/WHO 1981.WHO,Genera,Switgerland.
4.Gaig PS et al.Diagnosis of canine echinococcosis:Comparison of coproantigen an d serum antibody tests with arecoline purgation in uraguay.Vet parasitol,1995,56 :293.
1998年7月20日收稿, 百拇医药