应用双重PCR技术快速鉴定结核与非结核分支杆菌
作者:李国利 庄玉辉 赵铭 孙桂芝
单位:李国利(解放军309医院结核病中心研究室 100091);庄玉辉(解放军309医院结核病中心研究室 100091);赵铭(解放军309医院结核病中心研究室 100091);孙桂芝(北京胸科医院检验科 100095)
关键词:双重PCR;结核分支杆菌;非结核分支杆菌
中国现代医学杂志000107目的:建立双重PCR技术快速鉴定结核与非结核分支杆菌。方法:通过试验选择双重PCR最佳反应条件,检测引物A1、A2和B1、B2扩增分支杆菌的特异性及扩增结核分支杆菌的敏感性,并对34株结核分支杆菌和非结核分支杆菌临床分离株鉴定。结果:引物A1、A2能扩增所试24种分支杆菌,B1、B2仅扩增结核分支杆菌复合体菌种,两对引物扩增12种非分支杆菌均为阴性。结果表明,用引物A1、A2扩增分支杆菌属共有的65 Kda抗原基因383 bp片段和B1、B2扩增结核分支杆菌复合体特异的插入序列IS1081 238 bp片段鉴定结核与非结核分支杆菌是特异的。两对引物双重PCR检测结核分支杆菌DNA的敏感性分别为1 Pg和100 fg。双重PCR检测34株临床分离株,结核分支杆菌可见383 bp和238 bp两条扩增带,非结核分支杆菌仅见383 bp一条扩增带。据此差别,能将结核与非结核分支杆菌鉴别开,并能在1~2 d完成试验。结论:双重PCR技术为结核及非结核分支杆菌的快速鉴定提供了一个可供选择的手段。
, 百拇医药
分类号:R52▲
近年来,分支杆菌病谱有所改变,非结核分支杆菌感染明显增加。结核与非结核分支杆菌在临床上引起的疾病难以区别,但两者对抗结核药物敏感性大小相同,故正确鉴定分支杆菌在疾病诊断及治疗中至关重要。传统的生物学鉴定方法主要依据细菌生长速度、色素产生、对药物耐受性、生化反应等,方法复杂、费时,在得到分离培养物后仍需2~4周方能获得结果。本文应用双重PCR技术,在同一反应体系中加入两对引物同时扩增分支杆菌属共有的和结核分支杆菌复合体特有的特异性基因标志,据此对两者进行鉴别。双重PCR可作为一种快速鉴别结核与非结核分支杆菌的方法。
1 材料和方法
1.1 菌株来源
附表所列菌株除短小棒状杆菌、红色红球菌、星状诺卡氏菌来自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心外,其它分支杆菌和非分支杆菌由中国药品生物制品鉴定所提供。结核和非结构临床分离株分别由北京胸科医院及河北省胸科医院提供。临床分离株已依据“全国结核病诊断细菌学检验规程”方法鉴定。
, 百拇医药
1.2 细菌DNA的制备
取标准菌株及临床分离菌株培养物混悬于TE缓冲液内,加溶菌酶至终浓度2mg/ml,37℃孵育2 h,再加蛋白酶E和SDS分别至终浓度1mg/ml和1%(W/V),56℃孵育2h,酚、氯仿抽提后,无水乙醇沉淀提取DNA,-20℃保存备用。
1.3 PCR扩增
引物A1、A2和B1、B2均由中国科学院微生物研究所合成。A1、A2[1]扩增分支杆菌属共有的编码65kDa抗原的基因区域,产生383bp片段。B1、B2[2]扩增结核分支杆菌复合体特异的插入序列IS 1081区域,产生238bp片段。试验选择最佳PCR扩增条件后,用上述两对引物对表1所列分支杆菌、非分支杆菌标准株DNA分别进行—对引物PCR,用两对引物对分支杆菌标准株和临床分离菌株DNA进行双重PCR,扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳紫外检测。
, 百拇医药
2 结果
2.1 双重PCR扩增条件选择
2.1.1 引物浓度 比较了两对引物0.2μM/L,0.4μM/L,0.8μM/L 3种引物浓度。结果表明B1、B2-对引物扩增时,所试结核分支杆菌复合体菌种,即结核分支杆菌H37RV和H37Ra株、牛分支杆菌、牛分支杆菌BCG株,三种浓度均能扩增出理想结果。A1、A2-对引物扩增时0.4μM/L,0.8 μM/L分支杆菌能扩增出理想结果。两对引物双重PCR时IS 1081引物0.4μM/L,65KDa抗原基因引物0.8 μM/L扩增较为理想。
2.1.2 复性温度 分别比较了两对引物65 ℃,60℃,55℃三种复性温度,可见所试结核分支杆菌复合体菌种IS 1081基因238bp片段在三种温度均可扩增。65KDa抗原基因383bp片段在65℃,60℃时堪萨斯、胃、耻垢分支杆菌不扩增,55℃时所试分支杆菌均扩增。两对引物双重PCR时,其循环参数采用94℃1min,55℃2min,40个循环,延伸7min,扩增效果理想。
, 百拇医药
2.2 引物特异性和双重PCR敏感性试验
选择最佳反应条件,即25μl反应体系中,4种dNTP终浓度各为0.2 mmol/L,引物终浓度A1,A2各为0.8μmol/L,或/和B1、B2为0.4μmol/L,各菌种DNA模板均为20~30ng,TaqDNA聚合酶1u。置DNA热循环仪94℃1min,55℃2min,72℃2min,40个循环,延伸7min,对附表所列所有分支杆菌及非分支杆菌标准菌进行一对引物PCR和两对引物双重PCR。结果表明,一对引物PCR时,引物A1、A2能扩增所试所有分支杆菌标准株,12株非分支杆菌扩增均为阴性;引物B1、B2仅扩增所试结核分支杆菌复合杆菌种,非结核分支杆菌及非分支杆菌均不扩增;两对引物双重PCR时,琼脂糖凝胶电泳检测结核分支杆菌复合体菌种可见238bp和383bp两条扩增带,非结核分支杆菌仅见383bp扩增带(见附表)。
附表 双重PCR检测所试菌株结果 菌 株
, http://www.100md.com
扩增产物(383 bp)
扩增产物(238 bp)
分支杆菌
结核分支杆菌(H37RV)
+
+
结核分支杆菌(H37Ra)
+
+
牛分支杆菌
+
+
牛分支杆菌(BCG)
, 百拇医药
+
+
堪萨斯分支杆菌
+
-
海分支杆菌
+
-
瘰疬分支杆菌
+
-
胞内分支杆菌
+
, 百拇医药 -
鸟分支杆菌
+
-
猿猴分支杆菌
+
-
苏加分支杆菌
+
-
胃分支杆菌
+
-
蟾蜍分支杆菌
, 百拇医药
+
-
戈登分支杆菌
+
-
偶然分支杆菌
+
-
付偶然分支杆菌
+
-
龟分支杆菌亚种
+
, http://www.100md.com -
龟分支杆菌脓肿亚种
+
-
迪氏分支杆菌
+
-
不产色分支杆菌
+
-
母牛分支杆菌
+
-
, http://www.100md.com 浅黄分支杆菌
+
-
耻垢分支杆菌
+
-
草分支杆菌
+
-
非分支杆菌
金黄色葡萄球菌
-
-
, 百拇医药 表皮葡萄球菌
-
-
假白喉杆菌
-
-
甲型链球菌
-
-
肺炎克雷白杆菌
-
-
绿脓杆菌
-
, 百拇医药
-
卡他球菌
-
-
大肠杆菌
-
-
肺炎球菌
-
-
短小棒状杆菌
-
-
红色红球菌
, 百拇医药
-
-
星状诺卡氏菌
-
-
临床分离株
结核分支杆菌(28株)
+
+
堪萨斯分支杆菌
+
-
龟分支杆菌龟亚种
, 百拇医药
+
-
偶然分支杆菌
+
-
付偶然分支杆菌
+
-
母牛分支杆菌
+
-
浅黄分支杆菌
+
, http://www.100md.com -
将纯化结核分支杆菌H37RV基因组DNA10倍稀释至10ng,1ng,100pg,10pg,1pg,100fg,10fg/uL。用上述反应条件进行双重PCR,结果表明,引物A1、A2扩增敏感性为1pg,引物B1、B2为100fg。
2.3 双重PCR检测临床分离菌株
用上述最佳反应条件对临床分离株进行双重PCR,琼脂糖凝胶电泳检测可见28株结核分支杆菌具有238bp和383bp两条扩增带,6株非结核分支杆菌菌株仅见383bp扩增带(见附表、图)。据此差别可将结核及非结核分支杆菌进行鉴别。
附图 结核分支杆菌及非结核分支杆菌临床分离株双重PCR2%琼脂糖电泳结果
, http://www.100md.com 1.PBR322DNA/Hinf I marker 2.结核分支杆菌 临床 分离株
3.堪萨斯分支杆菌临床分离株 4.龟分支杆菌临床分离株
5.偶发分支杆菌临床分离株 6.付偶发分支杆菌临床分离株
7.母牛分支杆菌临床分离株 8.淡黄分支杆菌临床分离株
9.结核分支杆菌H37RV标准侏
3 讨论
多重或多重PCR技术与一对引物的PCR操作基本一样,只是在同一反应体系中同时加入多对引物,这样可同时扩增出不同特异性靶基因序列片段,依据这一特性,在同一反应体系中同时对分支杆菌属、结核分支杆菌复合体、分支杆菌菌种特异性靶基因序列标志进行扩增,即可达到分支杆菌鉴定的目的。
, 百拇医药
近年来,国内外有大量文献报导应用PCR技术快速检测、鉴定分支杆菌,其特异性、敏感性与所选择的扩增靶基因序列是否为该分支杆菌的特异片段有关。目前为止,PCR检测、鉴定结核分支杆菌复合体最广泛应用的是IS 6110插入序列。但随着研究的深入,最近有报导[2~4]除结核分支杆菌复合体外,IS 6110同源序列也存在于溃疡分枝杆菌、浅黄分支杆菌等6种非结核分支杆菌中和肺炎链球菌、Pyogenes链球菌、fumigatus曲霉菌中,同时发现某些结核分支杆菌菌株缺乏IS 6110插入序列,前者可能是用PCR扩增该靶基因序列检测鉴定结核分支杆菌复合体产生假阳性的原因之一,后者则是产生假阴性的原因之一。本文双重PCR中选用编码分支杆菌65 KDa抗原的分支杆菌属共有的HSP65基因片段和结核分支杆菌复合体特有的IS 1081插入序列片段为靶基因,试验证明其有高度特异性。且目前文献资料也未见结核分支杆菌复合体缺乏IS 1081插入序列的报导,选用IS 1081插入序列为检测鉴定结核分支杆菌复合体靶基因序列具有一定敏感性。
, 百拇医药
应用双重PCR技术时,由于不同引物扩增要求有不同的最适反应条件,除注意设计选择引物外,应特别注意优化PCR反应条件[5]。本试验对有关实验条件进行了研究,表明除应注意TagDNA聚合酶量、模块DNA量、4×dNTP量外,引物浓度、循环温度及时间,特别是复性温度是本试验成败的关键。故在采用不同引物多重PCR扩增时,应进行实验,确定实验条件。
本实验结果表明,双重PCR技术可对结核及非结核分支杆菌进行鉴别,并能在1~2 d内完成试验,该技术为结核与非结核分支杆菌的快速鉴定提供了又一可供选择的手段。■
参考文献:
[1]Hance A.J,Grand champ B,Levy-Frebault v, et al.Detection and identification of mycobacteria by amplification of mycobacterial DNA.Molec Microbiol,1989;3:843
, http://www.100md.com
[2]Lie Bana E,Aranaz A,Francis B,et al.Assessment of genetic markers for species differentiation within the mycobacterium tuberculosis complex. J Clin Microbiol,1996;34:933
[3]Kent L,McHugh TD,Billington O,et al.Demonstration of homology between Is6110 of mycobacterium tuberculosis and DNA of other mycobacterium spp.J Clin Microbiol,1995;33:2290
[4]Magdalena J,Vachee A,Supply P,et al.Identification of a new DNA region specific for members of mycobacterium tuberculosis complex.J Clin Microbiol,1998;36:937
[5]吴寇芸,方福德.基因诊断技术及应用.北京:中国医科大学.中国协和医科大学联合出版社,1992:209~210
谭欣审稿 唐小玲编辑
1999-01-26收稿, 百拇医药
单位:李国利(解放军309医院结核病中心研究室 100091);庄玉辉(解放军309医院结核病中心研究室 100091);赵铭(解放军309医院结核病中心研究室 100091);孙桂芝(北京胸科医院检验科 100095)
关键词:双重PCR;结核分支杆菌;非结核分支杆菌
中国现代医学杂志000107目的:建立双重PCR技术快速鉴定结核与非结核分支杆菌。方法:通过试验选择双重PCR最佳反应条件,检测引物A1、A2和B1、B2扩增分支杆菌的特异性及扩增结核分支杆菌的敏感性,并对34株结核分支杆菌和非结核分支杆菌临床分离株鉴定。结果:引物A1、A2能扩增所试24种分支杆菌,B1、B2仅扩增结核分支杆菌复合体菌种,两对引物扩增12种非分支杆菌均为阴性。结果表明,用引物A1、A2扩增分支杆菌属共有的65 Kda抗原基因383 bp片段和B1、B2扩增结核分支杆菌复合体特异的插入序列IS1081 238 bp片段鉴定结核与非结核分支杆菌是特异的。两对引物双重PCR检测结核分支杆菌DNA的敏感性分别为1 Pg和100 fg。双重PCR检测34株临床分离株,结核分支杆菌可见383 bp和238 bp两条扩增带,非结核分支杆菌仅见383 bp一条扩增带。据此差别,能将结核与非结核分支杆菌鉴别开,并能在1~2 d完成试验。结论:双重PCR技术为结核及非结核分支杆菌的快速鉴定提供了一个可供选择的手段。
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分类号:R52▲
近年来,分支杆菌病谱有所改变,非结核分支杆菌感染明显增加。结核与非结核分支杆菌在临床上引起的疾病难以区别,但两者对抗结核药物敏感性大小相同,故正确鉴定分支杆菌在疾病诊断及治疗中至关重要。传统的生物学鉴定方法主要依据细菌生长速度、色素产生、对药物耐受性、生化反应等,方法复杂、费时,在得到分离培养物后仍需2~4周方能获得结果。本文应用双重PCR技术,在同一反应体系中加入两对引物同时扩增分支杆菌属共有的和结核分支杆菌复合体特有的特异性基因标志,据此对两者进行鉴别。双重PCR可作为一种快速鉴别结核与非结核分支杆菌的方法。
1 材料和方法
1.1 菌株来源
附表所列菌株除短小棒状杆菌、红色红球菌、星状诺卡氏菌来自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心外,其它分支杆菌和非分支杆菌由中国药品生物制品鉴定所提供。结核和非结构临床分离株分别由北京胸科医院及河北省胸科医院提供。临床分离株已依据“全国结核病诊断细菌学检验规程”方法鉴定。
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1.2 细菌DNA的制备
取标准菌株及临床分离菌株培养物混悬于TE缓冲液内,加溶菌酶至终浓度2mg/ml,37℃孵育2 h,再加蛋白酶E和SDS分别至终浓度1mg/ml和1%(W/V),56℃孵育2h,酚、氯仿抽提后,无水乙醇沉淀提取DNA,-20℃保存备用。
1.3 PCR扩增
引物A1、A2和B1、B2均由中国科学院微生物研究所合成。A1、A2[1]扩增分支杆菌属共有的编码65kDa抗原的基因区域,产生383bp片段。B1、B2[2]扩增结核分支杆菌复合体特异的插入序列IS 1081区域,产生238bp片段。试验选择最佳PCR扩增条件后,用上述两对引物对表1所列分支杆菌、非分支杆菌标准株DNA分别进行—对引物PCR,用两对引物对分支杆菌标准株和临床分离菌株DNA进行双重PCR,扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳紫外检测。
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2 结果
2.1 双重PCR扩增条件选择
2.1.1 引物浓度 比较了两对引物0.2μM/L,0.4μM/L,0.8μM/L 3种引物浓度。结果表明B1、B2-对引物扩增时,所试结核分支杆菌复合体菌种,即结核分支杆菌H37RV和H37Ra株、牛分支杆菌、牛分支杆菌BCG株,三种浓度均能扩增出理想结果。A1、A2-对引物扩增时0.4μM/L,0.8 μM/L分支杆菌能扩增出理想结果。两对引物双重PCR时IS 1081引物0.4μM/L,65KDa抗原基因引物0.8 μM/L扩增较为理想。
2.1.2 复性温度 分别比较了两对引物65 ℃,60℃,55℃三种复性温度,可见所试结核分支杆菌复合体菌种IS 1081基因238bp片段在三种温度均可扩增。65KDa抗原基因383bp片段在65℃,60℃时堪萨斯、胃、耻垢分支杆菌不扩增,55℃时所试分支杆菌均扩增。两对引物双重PCR时,其循环参数采用94℃1min,55℃2min,40个循环,延伸7min,扩增效果理想。
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2.2 引物特异性和双重PCR敏感性试验
选择最佳反应条件,即25μl反应体系中,4种dNTP终浓度各为0.2 mmol/L,引物终浓度A1,A2各为0.8μmol/L,或/和B1、B2为0.4μmol/L,各菌种DNA模板均为20~30ng,TaqDNA聚合酶1u。置DNA热循环仪94℃1min,55℃2min,72℃2min,40个循环,延伸7min,对附表所列所有分支杆菌及非分支杆菌标准菌进行一对引物PCR和两对引物双重PCR。结果表明,一对引物PCR时,引物A1、A2能扩增所试所有分支杆菌标准株,12株非分支杆菌扩增均为阴性;引物B1、B2仅扩增所试结核分支杆菌复合杆菌种,非结核分支杆菌及非分支杆菌均不扩增;两对引物双重PCR时,琼脂糖凝胶电泳检测结核分支杆菌复合体菌种可见238bp和383bp两条扩增带,非结核分支杆菌仅见383bp扩增带(见附表)。
附表 双重PCR检测所试菌株结果 菌 株
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扩增产物(383 bp)
扩增产物(238 bp)
分支杆菌
结核分支杆菌(H37RV)
+
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结核分支杆菌(H37Ra)
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牛分支杆菌
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牛分支杆菌(BCG)
, 百拇医药
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堪萨斯分支杆菌
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海分支杆菌
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瘰疬分支杆菌
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胞内分支杆菌
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鸟分支杆菌
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猿猴分支杆菌
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苏加分支杆菌
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胃分支杆菌
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蟾蜍分支杆菌
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戈登分支杆菌
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偶然分支杆菌
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付偶然分支杆菌
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龟分支杆菌亚种
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龟分支杆菌脓肿亚种
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迪氏分支杆菌
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不产色分支杆菌
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母牛分支杆菌
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耻垢分支杆菌
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草分支杆菌
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非分支杆菌
金黄色葡萄球菌
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, 百拇医药 表皮葡萄球菌
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假白喉杆菌
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甲型链球菌
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肺炎克雷白杆菌
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绿脓杆菌
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卡他球菌
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大肠杆菌
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肺炎球菌
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短小棒状杆菌
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红色红球菌
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星状诺卡氏菌
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临床分离株
结核分支杆菌(28株)
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堪萨斯分支杆菌
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龟分支杆菌龟亚种
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偶然分支杆菌
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付偶然分支杆菌
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母牛分支杆菌
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浅黄分支杆菌
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将纯化结核分支杆菌H37RV基因组DNA10倍稀释至10ng,1ng,100pg,10pg,1pg,100fg,10fg/uL。用上述反应条件进行双重PCR,结果表明,引物A1、A2扩增敏感性为1pg,引物B1、B2为100fg。
2.3 双重PCR检测临床分离菌株
用上述最佳反应条件对临床分离株进行双重PCR,琼脂糖凝胶电泳检测可见28株结核分支杆菌具有238bp和383bp两条扩增带,6株非结核分支杆菌菌株仅见383bp扩增带(见附表、图)。据此差别可将结核及非结核分支杆菌进行鉴别。
附图 结核分支杆菌及非结核分支杆菌临床分离株双重PCR2%琼脂糖电泳结果
, http://www.100md.com 1.PBR322DNA/Hinf I marker 2.结核分支杆菌 临床 分离株
3.堪萨斯分支杆菌临床分离株 4.龟分支杆菌临床分离株
5.偶发分支杆菌临床分离株 6.付偶发分支杆菌临床分离株
7.母牛分支杆菌临床分离株 8.淡黄分支杆菌临床分离株
9.结核分支杆菌H37RV标准侏
3 讨论
多重或多重PCR技术与一对引物的PCR操作基本一样,只是在同一反应体系中同时加入多对引物,这样可同时扩增出不同特异性靶基因序列片段,依据这一特性,在同一反应体系中同时对分支杆菌属、结核分支杆菌复合体、分支杆菌菌种特异性靶基因序列标志进行扩增,即可达到分支杆菌鉴定的目的。
, 百拇医药
近年来,国内外有大量文献报导应用PCR技术快速检测、鉴定分支杆菌,其特异性、敏感性与所选择的扩增靶基因序列是否为该分支杆菌的特异片段有关。目前为止,PCR检测、鉴定结核分支杆菌复合体最广泛应用的是IS 6110插入序列。但随着研究的深入,最近有报导[2~4]除结核分支杆菌复合体外,IS 6110同源序列也存在于溃疡分枝杆菌、浅黄分支杆菌等6种非结核分支杆菌中和肺炎链球菌、Pyogenes链球菌、fumigatus曲霉菌中,同时发现某些结核分支杆菌菌株缺乏IS 6110插入序列,前者可能是用PCR扩增该靶基因序列检测鉴定结核分支杆菌复合体产生假阳性的原因之一,后者则是产生假阴性的原因之一。本文双重PCR中选用编码分支杆菌65 KDa抗原的分支杆菌属共有的HSP65基因片段和结核分支杆菌复合体特有的IS 1081插入序列片段为靶基因,试验证明其有高度特异性。且目前文献资料也未见结核分支杆菌复合体缺乏IS 1081插入序列的报导,选用IS 1081插入序列为检测鉴定结核分支杆菌复合体靶基因序列具有一定敏感性。
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应用双重PCR技术时,由于不同引物扩增要求有不同的最适反应条件,除注意设计选择引物外,应特别注意优化PCR反应条件[5]。本试验对有关实验条件进行了研究,表明除应注意TagDNA聚合酶量、模块DNA量、4×dNTP量外,引物浓度、循环温度及时间,特别是复性温度是本试验成败的关键。故在采用不同引物多重PCR扩增时,应进行实验,确定实验条件。
本实验结果表明,双重PCR技术可对结核及非结核分支杆菌进行鉴别,并能在1~2 d内完成试验,该技术为结核与非结核分支杆菌的快速鉴定提供了又一可供选择的手段。■
参考文献:
[1]Hance A.J,Grand champ B,Levy-Frebault v, et al.Detection and identification of mycobacteria by amplification of mycobacterial DNA.Molec Microbiol,1989;3:843
, http://www.100md.com
[2]Lie Bana E,Aranaz A,Francis B,et al.Assessment of genetic markers for species differentiation within the mycobacterium tuberculosis complex. J Clin Microbiol,1996;34:933
[3]Kent L,McHugh TD,Billington O,et al.Demonstration of homology between Is6110 of mycobacterium tuberculosis and DNA of other mycobacterium spp.J Clin Microbiol,1995;33:2290
[4]Magdalena J,Vachee A,Supply P,et al.Identification of a new DNA region specific for members of mycobacterium tuberculosis complex.J Clin Microbiol,1998;36:937
[5]吴寇芸,方福德.基因诊断技术及应用.北京:中国医科大学.中国协和医科大学联合出版社,1992:209~210
谭欣审稿 唐小玲编辑
1999-01-26收稿, 百拇医药