CVB3m对免疫功能低下小鼠心肌损伤的病理观察
作者：刘立志 曲波 周令望 于维汉
单位：刘立志(哈尔滨医科大学，克山病研究所，黑龙江，哈尔滨，150086)；曲波(哈尔滨医科大学，克山病研究所，黑龙江，哈尔滨，150086)；周令望(哈尔滨医科大学，克山病研究所，黑龙江，哈尔滨，150086)；于维汉(哈尔滨医科大学，克山病研究所，黑龙江，哈尔滨，150086)
关键词：病毒；X-射线；心肌损伤；小鼠
中国地方病学杂志000110 摘 要：目的 观察免疫功能低下小鼠感染CVB3m后心肌损伤的特点。方法 雄性昆明小鼠随机分成4组，I对照组；Ⅱ照射组；Ⅲ病毒组；Ⅳ照射+病毒组。照射组4Gy X-射线全身照射；病毒组常规腹腔接种CVB3m；照射+病毒组先照射，于照射后次日接种CVB3m。观察各组小鼠接种病毒后第3、7、14、21天心肌光镜改变，及第14天心肌电镜改变。结果 病毒组小鼠注射病毒后第7天，病变最重，病毒性心肌炎(VMC)检出率为57%，以后逐渐恢复；照射+病毒组第7天VMC检出率为64.7%，第14天为87.5%，第21天为100%，呈逐渐加重趋势。第14天电镜观察：照射+病毒组线粒体明显肿胀，嵴断裂，并伴有严重的空泡变。结论 全身照射条件下小鼠感染CVB3m后，VMC检出率增高，心肌病变加重。
, 百拇医药
中图分类号：R373.23 文献标识码：A
文章编号：1000-4955(2000)01-0026-03
Pathological change of CVB3m-caused damaged myocardium in
hypoimmunologic mice
LIU Li-zhi,QU Bo,ZHOU Ling-wang,et al
(Institute of Keshan Disease,Harbin Medical University,Harbin 150086,China)
Abstract：Objective To relate myocardial damage's feature in hypoimmunologic mice to CVB3m infection. Methods Kunming male mice were randomly divided into four groups:I control group,Ⅱ radiation group,Ⅲ virus group and Ⅳ radiation plus virus group.Mice in groupⅡ were radiated by 4Gy x-ray,in group Ⅲ were intraperitoneally injected CVB3m and in group Ⅳ,after radiating first,then injected CVB3m in the same way at the following day.Myocardial condition of mice in four groups was observed at day 3,7,14,21 through LM and at day 14 through EM.Results Pathological change in myocardium of group Ⅲ mice was the most serious at day 7,in accordance with the highest detectable rate of VMC(57%),and afterwards started to recover gradually. Detection rate of VMC in mice of group Ⅳ was 64.7% at day 7,87.5% at 14 day and 100% at 21 day.EM observation indicates that in group Ⅳ,mitochondrion tumefaction,crista break and severe vacuole degeneration of myocardium were obvious.Conclusions The mice in group Ⅳ,which were hypoimmunologic on the condition of whole body X-ray radiation,after CVB3m infection,showed high VMC detection rate and pathological change of myocardium exacerbated significantly.
, 百拇医药
Key words：Virus;X-ray;Myocardial damage;Mice▲
克山病的病因目前尚不清楚。一般认为，硒等某些微量元素和营养物质缺乏或失平衡而干扰或破坏了心肌的代谢，引起心肌损伤[1]。近年发现，在扩张型心肌病(DCM)和克山病病人心肌中存在病毒核酸，提示病毒感染可能在DCM和克山病的发病中起作用[2～4]。另有研究认为，低硒等因素可导致机体不同程度的免疫功能低下或紊乱。因而推测机体免疫功能低下、病毒感染等可能参与了克山病的发生、发展过程。进一步研究机体在免疫力低下时感染病毒所致的心肌损伤，对了解病毒性心肌炎(VMC)的发病机制以及克山病的病因具有一定的参考意义。
1 材料与方法
1.1 动物 5～6周龄雄性昆明小鼠200只，体重16～24g，由哈尔滨医科大学附属第三医院动物室提供。按体重随机分成4组，Ⅰ对照组，40只；Ⅱ照射组，40只；Ⅲ病毒组，50只；Ⅳ照射组+病毒组，70只。
, http://www.100md.com
1.2 放射源及照射方法 放射源采用日本日立公司电子直线加速器生产的X射线。能量：4MeV；总剂量：4Gy；源皮距(SSD)：80cm；照射野：24×24cm2；照射时间：2.98Min；照射剂量率：1.34288Gy/min。通过射线照射造成免疫功能低下的动物模型。
1.3 病毒Coxsackievirus B3m(CVB3m),TCID50:10-7/ml,-70℃冻存。
1.4 病毒接种和病理观察 照射后次日，病毒组和照射+病毒组鼠常规接种0.1ml 1000TCID50 CVB3m。各组动物于接种病毒后第3、7、14和21天分批处死，取心脏待用。取第3、7、14和21天各组小鼠心脏，常规HE染色，观察病理改变。取第14天各组鼠心脏，常规透射电子显微镜观察。
, 百拇医药
1.5 心肌组织病毒分离 取-70℃保存的小鼠心肌组织2.5mm3，无菌条件下匀浆，4℃ 1000r/min离心10min,取上清0.3ml接种于生长状态良好的Hell细胞上。加2%FCS1640维持液，于37℃ 5%CO2孵箱中培养48小时后，反复冻融细胞，收集上清接种到生长状态良好的Hell细胞上，盲传3代后，48～72小时内观察细胞病变情况。
1.6 统计处理 采用χ2检验进行统计学处理，P<0.01表示差异有极显著性意义。
2 结果
2.1 心肌组织光镜检查结果 对照组、照射组鼠各时间段心肌未发现病变；病毒组小鼠感染CVB3m后7天，光镜可见心肌细胞变性坏死，肌纤维溶解消失，炎细胞浸润，以淋巴细胞和单核细胞为主，形成散在炎性病灶及坏死灶，至第14天，坏死灶多数已被修复，及至第21天时，已完全修复；照射+病毒组小鼠心肌感染CVB3m后7天，光镜可见心肌细胞变性坏死，肌纤维溶解消失，伴有炎细胞浸润，至第14天时，心肌各层可见大量多发性坏死灶，呈凝固性坏死，伴有炎细胞浸润；及至第21天时，心肌全层可见多量坏死灶，呈播散性分布，有的坏死灶互相连接成片，偶见旧、新病灶交替出现。
, 百拇医药
2.2 小鼠VMC检出率 见表1，对照组和照射组小鼠各时间段均未检出VMC；病毒组小鼠感染CVB3m后7天，VMC检出率为57%，至第14天时，VMC检出率降至12.5%；及至第21天时，已完全修复；照射+病毒组小鼠心肌感染CVB3m后7天，VMC检出率为64.7%，至第14天和21天VMC检出率分别为87.5%和100%，显著高于病毒组(P<0.01)。
表1 小鼠病毒性心肌炎(VMC)检出结果 分组
VMC检出率%(发病小鼠/感染小鼠)
第3天
第7天
第14天
第21天
, http://www.100md.com
对照组
照射组
病毒组
照射+病毒组
0(0/10)
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57(8/14)
64.7(11/17)
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0(0/10)
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12.5(2/16)
87.5(14/16)*
0(0/10)
0(0/10)
0(0/9)
100(10/10)*
注：*与病毒组比较P<0.01
2.3 心肌组织电镜检查结果 注射病毒后第15天，对照组小鼠心肌电镜检查未见异常；照射组小鼠心肌细胞可见线粒体轻度肿胀；病毒组小鼠心肌细胞可见线粒体轻度肿胀、嵴断裂；照射+病毒组小鼠可见线粒体肿胀、嵴断裂、严重空泡样变及细胞核异形变、染色质浓缩边聚。
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2.4 心肌组织病毒分离结果 由表2可见，对照组及照射组各时间段均未分离到病毒，病毒组心肌组织第3天、7天分离到病毒，至第14天未检出。照射+病毒组心肌组织第3天、7天、14天和21天均分离到病毒。
表2 小鼠心肌组织病毒分离结果 分组
第3天
第7天
第14天
第21天
对照组
照射组
病毒组
照射+病毒组
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3 讨论
现实生活中，很多因素均可导致机体不同程度的免疫功能低下或紊乱，诸如蛋白质摄入不足，维生素类和某些微量元素的缺乏(如缺硒)或失平衡，生活环境的变迁，过劳，寒冷，食物中一些毒素的作用等等，而多种因素长期蓄积以及相互间的联合作用可进一步加重对免疫系统的损伤作用。
X射线是波长更小、能量更大、穿透力更强的一种辐射波，被照射机体获得辐射波的能量后，内部微观结构由相对静止状态转变为活跃状态，出现这种改变的强弱程度与该组织细胞的辐射敏感性和照射剂量直接相关。一般认为本实验的4Gy射线照射主要引起机体免疫系统的改变，而对机体其它系统的改变可忽略不计[5～8]。所以，中等剂量射线照射可使动物免疫功能降低，能够稳定地复制出免疫功能低下的动物模型。
, 百拇医药
病毒组小鼠通过腹腔接种0.1ml 1000TCID50 CVB3m，造成急性VMC动物模型。感染病毒后7天，心肌可出现灶状炎性病变，14天坏死灶开始修复，电镜显示线粒体肿胀，至21天坏死灶已完全修复，VMC检出率7天左右最高，为57%，并分离到病毒，以后逐渐下降，14、21天均分离不到病毒，与孙国贤[9]等报道的小鼠VMC实验结果基本相符。而免疫功能低下小鼠，很难通过细胞免疫和体液免疫机制将侵入机体的病毒清除，致使CVB3m在体内持续存在，大量复制。
结合心肌病理改变提示病毒的持续存在与否与心肌病变的轻重有一定的关系，病毒的持续存在可能是VMC进一步加重的条件。1984年Schnurr等报道用CVB3感染N：NIH(S)-11无胸腺小鼠，感染后第94天仍能在心肌中检测到病毒并伴有严重的心肌病变。由于心肌损害而最后形成类似扩张型心肌病(DCM)的病程，认为在免疫缺陷小鼠中，CVB3可在心肌中持续感染很长时间，这种持续感染可形成慢性心肌炎病程[10]。
, http://www.100md.com
综上所述，免疫功能低下小鼠感染CVB3m后，病毒可在心肌中持续存在，病变加重。该研究对进一步探讨扩张型心肌病和克山病病因可能具有一定的参考意义。■
作者简介：刘立志，男，1967年生，主治医师，硕士
参考文献：
[1]于维汉.克山病[A](陈灏珠主编.内科学)[M].第4版，北京：人民卫生出版社，1998，312-313.
[2]彭天庆，徐 岩，杨英珍，等.cDNA探针检测柯萨奇病毒RNA[J].中华医学检验杂志，1994，17：29-30.
[3]蒋金法，邓南伟，杨英珍.急性病毒性心肌炎与扩张型心肌病关系探讨[J].中华心血管病杂志，1992，20：4.
, 百拇医药 [4]陈灏珠.关于病毒性心肌炎与扩张型心肌病[J].中华心血管病杂志，1992，20：3.
[5]刘树铮.电离辐射对免疫[A].杨贵贞主编.医用免疫学[M].长春：吉林人民出版社，1980，228-242.
[6]刘树铮.电离辐射对免疫系统的作用[A].刘及等主编.放射损伤学[M].北京：原子能出版社，1981，174-192.
[7]刘树铮.电离辐射的致病作用[A].魏文汉主编.病理生理学[M].上海科技出版社，1984，612-614.
[8]郭 鹞，王克为，王子灿.放射损伤病理学[M].北京：人民卫生出版社，1987.275-289.
[9]孙国贤，林久治，王慧英.柯萨奇B3m病毒所致Balb/c鼠急性病毒性心肌炎模型[J].中华微生物学和免疫学杂志，1987，7：25.
[10]李家宜，孙国贤.小儿病毒性心肌炎[M].哈尔滨：黑龙江科学技术出版社，1993.33-34.
收稿日期：1999-08-25
修订日期：1999-10-15, 百拇医药
单位：刘立志(哈尔滨医科大学，克山病研究所，黑龙江，哈尔滨，150086)；曲波(哈尔滨医科大学，克山病研究所，黑龙江，哈尔滨，150086)；周令望(哈尔滨医科大学，克山病研究所，黑龙江，哈尔滨，150086)；于维汉(哈尔滨医科大学，克山病研究所，黑龙江，哈尔滨，150086)
关键词：病毒；X-射线；心肌损伤；小鼠
中国地方病学杂志000110 摘 要：目的 观察免疫功能低下小鼠感染CVB3m后心肌损伤的特点。方法 雄性昆明小鼠随机分成4组，I对照组；Ⅱ照射组；Ⅲ病毒组；Ⅳ照射+病毒组。照射组4Gy X-射线全身照射；病毒组常规腹腔接种CVB3m；照射+病毒组先照射，于照射后次日接种CVB3m。观察各组小鼠接种病毒后第3、7、14、21天心肌光镜改变，及第14天心肌电镜改变。结果 病毒组小鼠注射病毒后第7天，病变最重，病毒性心肌炎(VMC)检出率为57%，以后逐渐恢复；照射+病毒组第7天VMC检出率为64.7%，第14天为87.5%，第21天为100%，呈逐渐加重趋势。第14天电镜观察：照射+病毒组线粒体明显肿胀，嵴断裂，并伴有严重的空泡变。结论 全身照射条件下小鼠感染CVB3m后，VMC检出率增高，心肌病变加重。
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中图分类号：R373.23 文献标识码：A
文章编号：1000-4955(2000)01-0026-03
Pathological change of CVB3m-caused damaged myocardium in
hypoimmunologic mice
LIU Li-zhi,QU Bo,ZHOU Ling-wang,et al
(Institute of Keshan Disease,Harbin Medical University,Harbin 150086,China)
Abstract：Objective To relate myocardial damage's feature in hypoimmunologic mice to CVB3m infection. Methods Kunming male mice were randomly divided into four groups:I control group,Ⅱ radiation group,Ⅲ virus group and Ⅳ radiation plus virus group.Mice in groupⅡ were radiated by 4Gy x-ray,in group Ⅲ were intraperitoneally injected CVB3m and in group Ⅳ,after radiating first,then injected CVB3m in the same way at the following day.Myocardial condition of mice in four groups was observed at day 3,7,14,21 through LM and at day 14 through EM.Results Pathological change in myocardium of group Ⅲ mice was the most serious at day 7,in accordance with the highest detectable rate of VMC(57%),and afterwards started to recover gradually. Detection rate of VMC in mice of group Ⅳ was 64.7% at day 7,87.5% at 14 day and 100% at 21 day.EM observation indicates that in group Ⅳ,mitochondrion tumefaction,crista break and severe vacuole degeneration of myocardium were obvious.Conclusions The mice in group Ⅳ,which were hypoimmunologic on the condition of whole body X-ray radiation,after CVB3m infection,showed high VMC detection rate and pathological change of myocardium exacerbated significantly.
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Key words：Virus;X-ray;Myocardial damage;Mice▲
克山病的病因目前尚不清楚。一般认为，硒等某些微量元素和营养物质缺乏或失平衡而干扰或破坏了心肌的代谢，引起心肌损伤[1]。近年发现，在扩张型心肌病(DCM)和克山病病人心肌中存在病毒核酸，提示病毒感染可能在DCM和克山病的发病中起作用[2～4]。另有研究认为，低硒等因素可导致机体不同程度的免疫功能低下或紊乱。因而推测机体免疫功能低下、病毒感染等可能参与了克山病的发生、发展过程。进一步研究机体在免疫力低下时感染病毒所致的心肌损伤，对了解病毒性心肌炎(VMC)的发病机制以及克山病的病因具有一定的参考意义。
1 材料与方法
1.1 动物 5～6周龄雄性昆明小鼠200只，体重16～24g，由哈尔滨医科大学附属第三医院动物室提供。按体重随机分成4组，Ⅰ对照组，40只；Ⅱ照射组，40只；Ⅲ病毒组，50只；Ⅳ照射组+病毒组，70只。
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1.2 放射源及照射方法 放射源采用日本日立公司电子直线加速器生产的X射线。能量：4MeV；总剂量：4Gy；源皮距(SSD)：80cm；照射野：24×24cm2；照射时间：2.98Min；照射剂量率：1.34288Gy/min。通过射线照射造成免疫功能低下的动物模型。
1.3 病毒Coxsackievirus B3m(CVB3m),TCID50:10-7/ml,-70℃冻存。
1.4 病毒接种和病理观察 照射后次日，病毒组和照射+病毒组鼠常规接种0.1ml 1000TCID50 CVB3m。各组动物于接种病毒后第3、7、14和21天分批处死，取心脏待用。取第3、7、14和21天各组小鼠心脏，常规HE染色，观察病理改变。取第14天各组鼠心脏，常规透射电子显微镜观察。
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1.5 心肌组织病毒分离 取-70℃保存的小鼠心肌组织2.5mm3，无菌条件下匀浆，4℃ 1000r/min离心10min,取上清0.3ml接种于生长状态良好的Hell细胞上。加2%FCS1640维持液，于37℃ 5%CO2孵箱中培养48小时后，反复冻融细胞，收集上清接种到生长状态良好的Hell细胞上，盲传3代后，48～72小时内观察细胞病变情况。
1.6 统计处理 采用χ2检验进行统计学处理，P<0.01表示差异有极显著性意义。
2 结果
2.1 心肌组织光镜检查结果 对照组、照射组鼠各时间段心肌未发现病变；病毒组小鼠感染CVB3m后7天，光镜可见心肌细胞变性坏死，肌纤维溶解消失，炎细胞浸润，以淋巴细胞和单核细胞为主，形成散在炎性病灶及坏死灶，至第14天，坏死灶多数已被修复，及至第21天时，已完全修复；照射+病毒组小鼠心肌感染CVB3m后7天，光镜可见心肌细胞变性坏死，肌纤维溶解消失，伴有炎细胞浸润，至第14天时，心肌各层可见大量多发性坏死灶，呈凝固性坏死，伴有炎细胞浸润；及至第21天时，心肌全层可见多量坏死灶，呈播散性分布，有的坏死灶互相连接成片，偶见旧、新病灶交替出现。
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2.2 小鼠VMC检出率 见表1，对照组和照射组小鼠各时间段均未检出VMC；病毒组小鼠感染CVB3m后7天，VMC检出率为57%，至第14天时，VMC检出率降至12.5%；及至第21天时，已完全修复；照射+病毒组小鼠心肌感染CVB3m后7天，VMC检出率为64.7%，至第14天和21天VMC检出率分别为87.5%和100%，显著高于病毒组(P<0.01)。
表1 小鼠病毒性心肌炎(VMC)检出结果 分组
VMC检出率%(发病小鼠/感染小鼠)
第3天
第7天
第14天
第21天
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对照组
照射组
病毒组
照射+病毒组
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57(8/14)
64.7(11/17)
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12.5(2/16)
87.5(14/16)*
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0(0/9)
100(10/10)*
注：*与病毒组比较P<0.01
2.3 心肌组织电镜检查结果 注射病毒后第15天，对照组小鼠心肌电镜检查未见异常；照射组小鼠心肌细胞可见线粒体轻度肿胀；病毒组小鼠心肌细胞可见线粒体轻度肿胀、嵴断裂；照射+病毒组小鼠可见线粒体肿胀、嵴断裂、严重空泡样变及细胞核异形变、染色质浓缩边聚。
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2.4 心肌组织病毒分离结果 由表2可见，对照组及照射组各时间段均未分离到病毒，病毒组心肌组织第3天、7天分离到病毒，至第14天未检出。照射+病毒组心肌组织第3天、7天、14天和21天均分离到病毒。
表2 小鼠心肌组织病毒分离结果 分组
第3天
第7天
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3 讨论
现实生活中，很多因素均可导致机体不同程度的免疫功能低下或紊乱，诸如蛋白质摄入不足，维生素类和某些微量元素的缺乏(如缺硒)或失平衡，生活环境的变迁，过劳，寒冷，食物中一些毒素的作用等等，而多种因素长期蓄积以及相互间的联合作用可进一步加重对免疫系统的损伤作用。
X射线是波长更小、能量更大、穿透力更强的一种辐射波，被照射机体获得辐射波的能量后，内部微观结构由相对静止状态转变为活跃状态，出现这种改变的强弱程度与该组织细胞的辐射敏感性和照射剂量直接相关。一般认为本实验的4Gy射线照射主要引起机体免疫系统的改变，而对机体其它系统的改变可忽略不计[5～8]。所以，中等剂量射线照射可使动物免疫功能降低，能够稳定地复制出免疫功能低下的动物模型。
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病毒组小鼠通过腹腔接种0.1ml 1000TCID50 CVB3m，造成急性VMC动物模型。感染病毒后7天，心肌可出现灶状炎性病变，14天坏死灶开始修复，电镜显示线粒体肿胀，至21天坏死灶已完全修复，VMC检出率7天左右最高，为57%，并分离到病毒，以后逐渐下降，14、21天均分离不到病毒，与孙国贤[9]等报道的小鼠VMC实验结果基本相符。而免疫功能低下小鼠，很难通过细胞免疫和体液免疫机制将侵入机体的病毒清除，致使CVB3m在体内持续存在，大量复制。
结合心肌病理改变提示病毒的持续存在与否与心肌病变的轻重有一定的关系，病毒的持续存在可能是VMC进一步加重的条件。1984年Schnurr等报道用CVB3感染N：NIH(S)-11无胸腺小鼠，感染后第94天仍能在心肌中检测到病毒并伴有严重的心肌病变。由于心肌损害而最后形成类似扩张型心肌病(DCM)的病程，认为在免疫缺陷小鼠中，CVB3可在心肌中持续感染很长时间，这种持续感染可形成慢性心肌炎病程[10]。
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综上所述，免疫功能低下小鼠感染CVB3m后，病毒可在心肌中持续存在，病变加重。该研究对进一步探讨扩张型心肌病和克山病病因可能具有一定的参考意义。■
作者简介：刘立志，男，1967年生，主治医师，硕士
参考文献：
[1]于维汉.克山病[A](陈灏珠主编.内科学)[M].第4版，北京：人民卫生出版社，1998，312-313.
[2]彭天庆，徐 岩，杨英珍，等.cDNA探针检测柯萨奇病毒RNA[J].中华医学检验杂志，1994，17：29-30.
[3]蒋金法，邓南伟，杨英珍.急性病毒性心肌炎与扩张型心肌病关系探讨[J].中华心血管病杂志，1992，20：4.
, 百拇医药 [4]陈灏珠.关于病毒性心肌炎与扩张型心肌病[J].中华心血管病杂志，1992，20：3.
[5]刘树铮.电离辐射对免疫[A].杨贵贞主编.医用免疫学[M].长春：吉林人民出版社，1980，228-242.
[6]刘树铮.电离辐射对免疫系统的作用[A].刘及等主编.放射损伤学[M].北京：原子能出版社，1981，174-192.
[7]刘树铮.电离辐射的致病作用[A].魏文汉主编.病理生理学[M].上海科技出版社，1984，612-614.
[8]郭 鹞，王克为，王子灿.放射损伤病理学[M].北京：人民卫生出版社，1987.275-289.
[9]孙国贤，林久治，王慧英.柯萨奇B3m病毒所致Balb/c鼠急性病毒性心肌炎模型[J].中华微生物学和免疫学杂志，1987，7：25.
[10]李家宜，孙国贤.小儿病毒性心肌炎[M].哈尔滨：黑龙江科学技术出版社，1993.33-34.
收稿日期：1999-08-25
修订日期：1999-10-15, 百拇医药