白细胞介素-6单独或与其他细胞因子联合应用对白血病细胞的影响
作者：胡波 杨科 孔祥英 王鑫 巩伟丽
单位：
胡波(北京军区总医院血液科(北京，100700))；杨科(北京军区总医院血液科(北京，100700))；孔祥英 (重庆第三军医大学西南医院儿科)；王鑫(北京军区总医院血液科(北京，100700))；巩伟丽(北京军区总医院血液科(北京，100700))
关键词：白细胞介素-6；白血病细胞，急性
临床血液学杂志000112 摘要：目的：观察rhIL-6对急性白血病原代细胞体外生长的作用。方法：应用MTT、CFU-L及间接免疫荧光法对18例急性白血病进行观察。结果：IL-6体外单独应用对急性白血病原代细胞无明显促增殖及诱导分化作用，但与G-CSF联合则常可抑制原代白血病细胞增殖。结论：IL-6与G-CSF联合用于化疗、放疗后的骨髓抑制更安全。
, http://www.100md.com
The effects of interleukin-6 single or combined with other growth factors on blast cells in acute leukemias
HU Bo YANG Ke WANG Xin GONG Wei-li
(Hospital of Beijing Commend,Beijing,100700)
KONG Xiang-ying
(Xilan Hospital,The Third Military Medical University)
Abstract：Objective：To study the effects of recombinant interleukin-6 (rhIL-6) on blast cells proliferation.Method：18 patients with acute leukemias were studied by in vitro using MTT,CFU-L and indirect immune fluorescence.Result：Interleukin-6 had slight growth-proliferation effect on blast cells.IL-6 combined with G-CSF often inhibited blast cells growth of acute myeloblastic leukemias in vitro.Conclusion：IL-6 and G-CSF used for the restoration of Chemotherapy-induced bone marrow inhibition might be safer than that of combinations of IL-6 with other growth factors in the study.
, 百拇医药
Key words：Interleukin-6 Leukemic blast cell,acute▲
白细胞介素-6(IL-6)是具有多种生物学活性的细胞因子，在肿瘤细胞形成或分化过程中起重要作用，可抑制人或小鼠髓系白血病细胞的增殖，并诱导其向巨噬细胞、粒细胞方向分化〔1，2〕，但亦有不同意见〔3〕。我们观察了IL-6对18例急性白血病患者原代细胞体外增殖活性、分化的影响。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
IL-6：活性1×109 U/g蛋白(军事医学科学院提供)，重组白细胞介素-3(IL-3)：50 mg/L(北京医科大学)，重组粒细胞集落刺激因子(G-CSF) 150 mg/g(日本麒麟公司)，重组粒-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF) 150 mg/g(军事医学科学院)。MTT和羊抗鼠IgG荧光抗体购自邦定公司，鼠抗人CD系列抗体购自中国医学科学院血液研究所。
, 百拇医药
1.2 研究对象
18例急性白血病患者，均为初治或复发未缓解患者，其中急性淋巴细胞白血病(ALL)2例，急性髓系白血病(AML)13例，慢性粒细胞白血病急性变2例，骨髓增生异常综合征转为急性白血病1例。诊断按1986年全国白血病诊断分型标准〔4〕，FAB分型。
1.3 IL-6及其与其它细胞因子组合对白血病细胞集落形成的作用
将各例AML和ALL细胞分别于6孔培养板(Costar)中做琼脂半固体培养，加入单独或不同组合的细胞因子，培养10～14 d，计集落数。
1.4 MTT法测定细胞增殖情况
取白血病患者骨髓，常规法分离白血病细胞，按5×108/L细胞浓度，以10%小牛血清，IMDM培养液进行培养。分别接种于24孔培养板(Costar)，加单因子或IL-6与不同因子组合，培养72 h，将各孔培养液打匀，分别加入96孔培养板，每孔200 μl，培养结束前4 h加入5 g/L的MTT，20 μl/孔，用MTT法〔5〕测定细胞增殖情况，测OD570值，与对照组相比，OD值升高>10%为促增殖作用，OD值降低>10%为抑制作用，OD值变化在±10%为无作用。将与IL-6共同培养72 h后的细胞进行常规瑞氏染色和免疫分型(间接免疫荧光法)，做过氧化物酶、氯醋酸AS-D萘酚脂酶、脂酶双染，观察细胞形态、细胞表面抗原表达的变化及细胞化学染色阳性程度的变化。
, 百拇医药
1.5 统计学处理
采用配对计量资料t检验。
2 结果
2.1 IL-6对急性白血病细胞体外增殖的影响
表1结果表明，IL-6在体外对大部分白血病细胞的增殖无明显作用，对其中1例的原代细胞呈抑制作用(M2 1例)。
表1 IL-6对白血病细胞增殖的影响 OD570，
±s IL-6(μg/L)
例数
加因子组
, 百拇医药
对照组
10
16
0.352±0.0801)
0.348±0.090
50
12
0.338±0.1111)
0.328±0.105
1)与对照组比较P>0.052.2 IL-6对CFU-L集落形成的作用
加入IL-6(10 μg/L)组与对照组相比，集落数目及大小差异均无明显性，分别为23.241±21.362和24.694±21.908，但簇的数目增多。有3例AML细胞对IL-6呈抑制增殖反应，其中1例与用MTT法检测结果一致，余2例MTT法示无明显作用。
, 百拇医药
2.3 IL-6对白血病细胞的诱导分化作用
IL-6可使2例病人的CD11b细胞明显增多，其它表型及细胞形态、细胞化学染色培养前后无明显变化，提示IL-6无诱导分化作用，但有3例可使细胞核变小，染色质变粗，胞浆内出现颗粒，有向成熟分化的趋势。
2.4 IL-6与其它细胞因子联合应用对原代白血病细胞体外增殖的影响
表2结果显示，IL-6可增加IL-3对白血病细胞的促增殖作用，与GM-CSF合用比单用后者差异无明显性，而与G-CSF联合应用则常对白血病细胞的体外生长有抑制作用。
表2 单独或联合使用细胞因子对白血病细胞增殖的影响±s 细胞因子
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OD570
细胞因子
OD570
IL-6
0.405±0.061
IL-6+
GM-CSF
0.431±0.052
G-CSF
0.429±0.061
IL-3
0.439±0.027
, 百拇医药
IL-6+
G-CSF
0.390±0.0701)
IL-6+
IL-3
0.472±0.033
GM-CSF
0.462±0.068
空白对照
0.431±0.056
1)与对照组比0.01
3 讨论
IL-6是一个多功能因子，可抑制人、鼠多种急性髓系白血病(AML)细胞系的体外生长，诱导其分化，但部分AML细胞(尤其是原代AML细胞)对IL-6呈增殖反应。本研究观察了IL-6单独或与其它细胞因子联合使用对急性白血病细胞的生长、增殖及分化的体外调节作用，发现IL-6单独使用对大部分原代白血病细胞的作用极微弱。本文观察的18例病例中，IL-6对5例原代白血病细胞有抑制生长作用。IL-6对原代白血病细胞的作用与白血病亚型、临床表现、体征等无明显关系。经IL-6作用3 d后的白血病细胞瑞氏染色示细胞核变小，胞浆内出现颗粒，有向成熟细胞分化的趋势，但表面抗原仅CD11b增高较明显，其它如CD13、CD33、CD15、CD14均无明显变化，与Takanashi等〔6〕的报告结果基本一致，提示IL-6对原代白血病细胞无诱导分化作用。国外文献中关于IL-6对原代白血病细胞的作用报道不一：促进增殖、抑制增殖或无明显作用。造成上述结果差异的因素可能是：①与AML细胞表面IL-6的受体(IL-6R)表达有关，文献报道AML细胞均表达IL-6R mRNA，而ALL仅一半病人的细胞检测到较低的IL-6R表达〔7〕。最近资料表明，细胞表面只有IL-6R α链与β链同时表达，且二者有合适的比例时，才对一定浓度的IL-6刺激产生明显的生物学效应〔8〕。②培养体系中血清成分和细胞因子的浓度：有人认为IL-6可能为造血调节因子网络的一部分，可调节IL-1、TNF-α的表达，后者直接或间接地影响白血病细胞的增殖〔9，10〕。③不同类型白血病细胞自身的特性，如细胞对IL-6的敏感性等。此外，IL-6作用的双向性等可能也是引起实验结果不同的因素。本试验观察到的另一结果是IL-6与rhG-CSF联合应用对原代白血病细胞体外增殖有抑制效应。这一结果与Koistinen〔7〕的报道相似。最近Koistinen〔7〕发现，IL-6和G-CSF联合应用时，可保存IL-6对白血病细胞的抑制作用，而对单独使用IL-6无明显作用或呈促增殖作用的原代细胞，则可转化为抑制作用或促增殖作用不同程度的减弱。本研究发现IL-6与GM-CSF联合应用时，与单用GM-CSF相比，差异无明显性；与IL-3联合使用则可加强后者促白血病细胞增殖的作用。当IL-6与G-CSF联合使用时，所得到的结果与Koistinen〔7〕的类似，IL-6单独使用呈抑制作用或无明显作用者，抑制作用得到加强，而原来呈促增殖作用的则作用不同程度的减弱。由此提示，IL-6与G-CSF联合用于化疗或放疗后的骨髓抑制，可能比使用本文中其它因子组合更安全。IL-6与G-CSF联合可使抑制AML细胞的作用增殖的机制尚未明确。有学者认为，G-CSF受体和IL-6受体结构极相似，AML细胞G-CSF和IL-6在信号蛋白水平有共同作用之处，也可能是使其它细胞因子的受体表达改变，从而使细胞对其它细胞因子的反应性改变。或假设AML细胞中IL-6和G-CSF信号传导存在着强烈的调节作用，使一些其它的信号传导通道“关闭”〔7〕。
, 百拇医药
总之，在白血病治疗过程中使用集落刺激因子(GFs)的趋势有所增加。IL-6可增加机体的免疫功能，促进正常骨髓造血，还可能有抑制白血病原始细胞生长的作用，IL-6单独作用于小鼠白血病模型中能抑制白血病的发展〔8〕，用于晚期肿瘤病人可使血小板升高〔9〕，与其它GFs协同作用时，使照射后动物外周血白细胞和血小板的恢复比使用单因子时效果好。因此，更深入地研究IL-6在白血病细胞中的调节作用对白血病的发生和防治都有重要意义。■
参考文献：
[1]Kishimoto T.The biology of interleukin-6,Blood,1989,74：1～10
[2]雷秀玲，楚延，章崇杰.白细胞介素6抗肿瘤作用及影响IL-6生物治疗药物的研究进展.医学综述.1998，1：23～25
, http://www.100md.com [3]姜道滋，张茂宏.白细胞介素6与急性髓系白血病相互关系的研究.国外医学输血与血液学分册，1996，19：11～13
[4]张之南.血液病诊断及疗效标准.北京：科学出版社，1998.171～184
[5]Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival：application to proliferation and cytotoxicity assays,J Immuno Methods,1983,65：55～63
[6]Takanashi M,Mitoji T,Masuda M,et al.The effects of leukemia inhibitory factor and interleukin 6 on the growth of acute myeloid leukemia cells,Leuk Res,1993,17：217～222
, 百拇医药
[7]Koistinen P,Sailyet M,Poroman N,et al.Complex effects of interleukin 6 on clonogenic blast cell growth in acute myeloblastic leukemia,Acta Haematol,1997,98：14～21
[8]Lotem J,Sachs L.Selective regulation by hydrocortisone of induction of in vivo differentiation of myeloid leukemic cells with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,interleukin 6 and nterleukin 1α.Lenkemia,1992,6：426～431
[9]邱丽玲，孙连生.白细胞介素6促血小板生成的实验及临床研究进展.实验血液学杂志，1996，4：236～241
收稿 1999-03-16, 百拇医药
单位：
胡波(北京军区总医院血液科(北京，100700))；杨科(北京军区总医院血液科(北京，100700))；孔祥英 (重庆第三军医大学西南医院儿科)；王鑫(北京军区总医院血液科(北京，100700))；巩伟丽(北京军区总医院血液科(北京，100700))
关键词：白细胞介素-6；白血病细胞，急性
临床血液学杂志000112 摘要：目的：观察rhIL-6对急性白血病原代细胞体外生长的作用。方法：应用MTT、CFU-L及间接免疫荧光法对18例急性白血病进行观察。结果：IL-6体外单独应用对急性白血病原代细胞无明显促增殖及诱导分化作用，但与G-CSF联合则常可抑制原代白血病细胞增殖。结论：IL-6与G-CSF联合用于化疗、放疗后的骨髓抑制更安全。
, http://www.100md.com
The effects of interleukin-6 single or combined with other growth factors on blast cells in acute leukemias
HU Bo YANG Ke WANG Xin GONG Wei-li
(Hospital of Beijing Commend,Beijing,100700)
KONG Xiang-ying
(Xilan Hospital,The Third Military Medical University)
Abstract：Objective：To study the effects of recombinant interleukin-6 (rhIL-6) on blast cells proliferation.Method：18 patients with acute leukemias were studied by in vitro using MTT,CFU-L and indirect immune fluorescence.Result：Interleukin-6 had slight growth-proliferation effect on blast cells.IL-6 combined with G-CSF often inhibited blast cells growth of acute myeloblastic leukemias in vitro.Conclusion：IL-6 and G-CSF used for the restoration of Chemotherapy-induced bone marrow inhibition might be safer than that of combinations of IL-6 with other growth factors in the study.
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Key words：Interleukin-6 Leukemic blast cell,acute▲
白细胞介素-6(IL-6)是具有多种生物学活性的细胞因子，在肿瘤细胞形成或分化过程中起重要作用，可抑制人或小鼠髓系白血病细胞的增殖，并诱导其向巨噬细胞、粒细胞方向分化〔1，2〕，但亦有不同意见〔3〕。我们观察了IL-6对18例急性白血病患者原代细胞体外增殖活性、分化的影响。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
IL-6：活性1×109 U/g蛋白(军事医学科学院提供)，重组白细胞介素-3(IL-3)：50 mg/L(北京医科大学)，重组粒细胞集落刺激因子(G-CSF) 150 mg/g(日本麒麟公司)，重组粒-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF) 150 mg/g(军事医学科学院)。MTT和羊抗鼠IgG荧光抗体购自邦定公司，鼠抗人CD系列抗体购自中国医学科学院血液研究所。
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1.2 研究对象
18例急性白血病患者，均为初治或复发未缓解患者，其中急性淋巴细胞白血病(ALL)2例，急性髓系白血病(AML)13例，慢性粒细胞白血病急性变2例，骨髓增生异常综合征转为急性白血病1例。诊断按1986年全国白血病诊断分型标准〔4〕，FAB分型。
1.3 IL-6及其与其它细胞因子组合对白血病细胞集落形成的作用
将各例AML和ALL细胞分别于6孔培养板(Costar)中做琼脂半固体培养，加入单独或不同组合的细胞因子，培养10～14 d，计集落数。
1.4 MTT法测定细胞增殖情况
取白血病患者骨髓，常规法分离白血病细胞，按5×108/L细胞浓度，以10%小牛血清，IMDM培养液进行培养。分别接种于24孔培养板(Costar)，加单因子或IL-6与不同因子组合，培养72 h，将各孔培养液打匀，分别加入96孔培养板，每孔200 μl，培养结束前4 h加入5 g/L的MTT，20 μl/孔，用MTT法〔5〕测定细胞增殖情况，测OD570值，与对照组相比，OD值升高>10%为促增殖作用，OD值降低>10%为抑制作用，OD值变化在±10%为无作用。将与IL-6共同培养72 h后的细胞进行常规瑞氏染色和免疫分型(间接免疫荧光法)，做过氧化物酶、氯醋酸AS-D萘酚脂酶、脂酶双染，观察细胞形态、细胞表面抗原表达的变化及细胞化学染色阳性程度的变化。
, 百拇医药
1.5 统计学处理
采用配对计量资料t检验。
2 结果
2.1 IL-6对急性白血病细胞体外增殖的影响
表1结果表明，IL-6在体外对大部分白血病细胞的增殖无明显作用，对其中1例的原代细胞呈抑制作用(M2 1例)。
表1 IL-6对白血病细胞增殖的影响 OD570，
±s IL-6(μg/L)例数
加因子组
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对照组
10
16
0.352±0.0801)
0.348±0.090
50
12
0.338±0.1111)
0.328±0.105
1)与对照组比较P>0.052.2 IL-6对CFU-L集落形成的作用
加入IL-6(10 μg/L)组与对照组相比，集落数目及大小差异均无明显性，分别为23.241±21.362和24.694±21.908，但簇的数目增多。有3例AML细胞对IL-6呈抑制增殖反应，其中1例与用MTT法检测结果一致，余2例MTT法示无明显作用。
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2.3 IL-6对白血病细胞的诱导分化作用
IL-6可使2例病人的CD11b细胞明显增多，其它表型及细胞形态、细胞化学染色培养前后无明显变化，提示IL-6无诱导分化作用，但有3例可使细胞核变小，染色质变粗，胞浆内出现颗粒，有向成熟分化的趋势。
2.4 IL-6与其它细胞因子联合应用对原代白血病细胞体外增殖的影响
表2结果显示，IL-6可增加IL-3对白血病细胞的促增殖作用，与GM-CSF合用比单用后者差异无明显性，而与G-CSF联合应用则常对白血病细胞的体外生长有抑制作用。
表2 单独或联合使用细胞因子对白血病细胞增殖的影响
±s 细胞因子, http://www.100md.com
OD570
细胞因子
OD570
IL-6
0.405±0.061
IL-6+
GM-CSF
0.431±0.052
G-CSF
0.429±0.061
IL-3
0.439±0.027
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IL-6+
G-CSF
0.390±0.0701)
IL-6+
IL-3
0.472±0.033
GM-CSF
0.462±0.068
空白对照
0.431±0.056
1)与对照组比0.01
3 讨论
IL-6是一个多功能因子，可抑制人、鼠多种急性髓系白血病(AML)细胞系的体外生长，诱导其分化，但部分AML细胞(尤其是原代AML细胞)对IL-6呈增殖反应。本研究观察了IL-6单独或与其它细胞因子联合使用对急性白血病细胞的生长、增殖及分化的体外调节作用，发现IL-6单独使用对大部分原代白血病细胞的作用极微弱。本文观察的18例病例中，IL-6对5例原代白血病细胞有抑制生长作用。IL-6对原代白血病细胞的作用与白血病亚型、临床表现、体征等无明显关系。经IL-6作用3 d后的白血病细胞瑞氏染色示细胞核变小，胞浆内出现颗粒，有向成熟细胞分化的趋势，但表面抗原仅CD11b增高较明显，其它如CD13、CD33、CD15、CD14均无明显变化，与Takanashi等〔6〕的报告结果基本一致，提示IL-6对原代白血病细胞无诱导分化作用。国外文献中关于IL-6对原代白血病细胞的作用报道不一：促进增殖、抑制增殖或无明显作用。造成上述结果差异的因素可能是：①与AML细胞表面IL-6的受体(IL-6R)表达有关，文献报道AML细胞均表达IL-6R mRNA，而ALL仅一半病人的细胞检测到较低的IL-6R表达〔7〕。最近资料表明，细胞表面只有IL-6R α链与β链同时表达，且二者有合适的比例时，才对一定浓度的IL-6刺激产生明显的生物学效应〔8〕。②培养体系中血清成分和细胞因子的浓度：有人认为IL-6可能为造血调节因子网络的一部分，可调节IL-1、TNF-α的表达，后者直接或间接地影响白血病细胞的增殖〔9，10〕。③不同类型白血病细胞自身的特性，如细胞对IL-6的敏感性等。此外，IL-6作用的双向性等可能也是引起实验结果不同的因素。本试验观察到的另一结果是IL-6与rhG-CSF联合应用对原代白血病细胞体外增殖有抑制效应。这一结果与Koistinen〔7〕的报道相似。最近Koistinen〔7〕发现，IL-6和G-CSF联合应用时，可保存IL-6对白血病细胞的抑制作用，而对单独使用IL-6无明显作用或呈促增殖作用的原代细胞，则可转化为抑制作用或促增殖作用不同程度的减弱。本研究发现IL-6与GM-CSF联合应用时，与单用GM-CSF相比，差异无明显性；与IL-3联合使用则可加强后者促白血病细胞增殖的作用。当IL-6与G-CSF联合使用时，所得到的结果与Koistinen〔7〕的类似，IL-6单独使用呈抑制作用或无明显作用者，抑制作用得到加强，而原来呈促增殖作用的则作用不同程度的减弱。由此提示，IL-6与G-CSF联合用于化疗或放疗后的骨髓抑制，可能比使用本文中其它因子组合更安全。IL-6与G-CSF联合可使抑制AML细胞的作用增殖的机制尚未明确。有学者认为，G-CSF受体和IL-6受体结构极相似，AML细胞G-CSF和IL-6在信号蛋白水平有共同作用之处，也可能是使其它细胞因子的受体表达改变，从而使细胞对其它细胞因子的反应性改变。或假设AML细胞中IL-6和G-CSF信号传导存在着强烈的调节作用，使一些其它的信号传导通道“关闭”〔7〕。
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总之，在白血病治疗过程中使用集落刺激因子(GFs)的趋势有所增加。IL-6可增加机体的免疫功能，促进正常骨髓造血，还可能有抑制白血病原始细胞生长的作用，IL-6单独作用于小鼠白血病模型中能抑制白血病的发展〔8〕，用于晚期肿瘤病人可使血小板升高〔9〕，与其它GFs协同作用时，使照射后动物外周血白细胞和血小板的恢复比使用单因子时效果好。因此，更深入地研究IL-6在白血病细胞中的调节作用对白血病的发生和防治都有重要意义。■
参考文献：
[1]Kishimoto T.The biology of interleukin-6,Blood,1989,74：1～10
[2]雷秀玲，楚延，章崇杰.白细胞介素6抗肿瘤作用及影响IL-6生物治疗药物的研究进展.医学综述.1998，1：23～25
, http://www.100md.com [3]姜道滋，张茂宏.白细胞介素6与急性髓系白血病相互关系的研究.国外医学输血与血液学分册，1996，19：11～13
[4]张之南.血液病诊断及疗效标准.北京：科学出版社，1998.171～184
[5]Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival：application to proliferation and cytotoxicity assays,J Immuno Methods,1983,65：55～63
[6]Takanashi M,Mitoji T,Masuda M,et al.The effects of leukemia inhibitory factor and interleukin 6 on the growth of acute myeloid leukemia cells,Leuk Res,1993,17：217～222
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[7]Koistinen P,Sailyet M,Poroman N,et al.Complex effects of interleukin 6 on clonogenic blast cell growth in acute myeloblastic leukemia,Acta Haematol,1997,98：14～21
[8]Lotem J,Sachs L.Selective regulation by hydrocortisone of induction of in vivo differentiation of myeloid leukemic cells with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,interleukin 6 and nterleukin 1α.Lenkemia,1992,6：426～431
[9]邱丽玲，孙连生.白细胞介素6促血小板生成的实验及临床研究进展.实验血液学杂志，1996，4：236～241
收稿 1999-03-16, 百拇医药