柳穿鱼中神经酰胺类成分的结构鉴定
作者：华会明 程卯生 李铣
单位：华会明(沈阳药科大学中药系，沈阳 110015)；程卯生：沈阳药科大学合成二室，沈阳 110015；李铣(沈阳药科大学中药系，沈阳 110015)
关键词：柳穿鱼;神经酰胺；植物鞘氨醇
摘 要摘 要：从柳穿鱼全草中分离到一神经酰胺成分，通过化学方法和1H-NMR，13C-NMR，1H-1H COSY，HMQC，HMBC及MS波谱分析，确定其结构为(2S，3S，4R，8E)-8，9-二脱氢植物鞘氨醇(2′R)-2′-羟基脂肪酰胺，其中脂肪酸链主要由二十二，二十三，二十四和二十五烷酸组成.
Studies on the Ceramides of Linaria vulgaris Mill.
, 百拇医药
Hua Huiming Cheng Maosheng Li Xian
(Department of Traditional Chinese Medicines,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015)
Abstract：A ceramide mixture was isolated from Linaria vulgaris Mill.and identified as (2S，3S，4R，8E)-8，9-didehydro-phytosphingosine(2′R)-2′-hydroxy fatty amides.The fatty acid residues were composed of docosanoic,tricosanoic,tetracosanoic and pentacosanoic acids with a 2-hydroxy group.
, 百拇医药
Key words：Linaria vulgaris Mill;ceramide;phytosphingosine▲
神经酰胺(ceramide)具有调节细胞生长、变异，引起细胞凋亡，调节蛋白质分泌，参与免疫过程等功能〔1〕.神经酰胺与糖结合形成的神经鞘苷(cerabroside)广泛分布于动植物体内，特别是中枢神经系统、肝、脾和血细胞中，它组成动、植物组织的细胞膜.作为膜抗原和病毒、细菌及其毒素的受体，它们在细胞识别、细胞粘合，调节细胞免疫，决定血型等方面起非常重要的作用〔2,3〕.近来，对神经酰胺和神经鞘苷的研究，引起人们广泛的重视.各国学者不断从海洋生物中分离得到该类化合物，并合成了大量的类似物，发现其具有抗肿瘤、抗病毒、抗肝毒、免疫促进等作用〔4～7〕.但有关从植物中分离这类化合物的报道很少.在对柳穿鱼Linaria vulgaris Mill.化学成分的系统研究过程中〔8〕，分离得到一神经酰胺成分(Ⅰ)，通过化学方法和1H-NMR，13C-NMR，1H-1H COSY，HMQC，HMBC及MS波谱分析，确定其结构为(2S,3S,4R,8E)-8，9-二脱氢植物鞘氨醇(2′R)-2′-羟基脂肪酰胺，其中脂肪酸链长分别为二十二，二十三，二十四和二十五碳.
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1 提取与分离
柳穿鱼干燥全草(10 kg)粉碎后，用95%的乙醇回流提取3次，浓缩后，加水调至醇浓度为70%，沉降叶绿素，滤除沉淀，回收溶剂得乙醇提取物.将总提取物加适量水，依次用石油醚、CHCl3，EtOAc和n-BuOH萃取.石油醚萃取物(67 g)进行硅胶柱色谱分离，以石油醚-丙酮不同比例的混合溶剂洗脱，(7∶3)洗脱部分的311～320份合并，进行二次硅胶柱色谱，CHCl3-Me2CO(7：3)洗脱得白色粉末(Ⅰ)72 mg.
2 鉴定与结果
成分(Ⅰ)为白色无定形粉末.IR谱显示有酰胺(1621，1544 cm-1)，羟基(3335 cm-1)及长链脂肪烷基(722 cm-1)吸收峰.1H-NMR和13C-NMR数据经HMQC和HMBC谱分析进行归属，结果见表1.δ 1.25～1.30强的质子信号及δ 0.83(t，J=6.9 Hz,6H)推测有两个脂肪烷基链；信号δ 8.59(d,J=9.0 Hz，1H,NH)和δ 175.27(CONH)，δ 5.12(m,1H)和δ 53.00(CH—NH)及连氧碳信号δ 62.04，76.86，72，93，72.50显示有酰胺键和多羟基存在，以上数据表明该成分为神经酰胺类化合物〔9〕.
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Tab.1 NMR data of constituent (Ⅰ)
No.
δH(J,Hz)
δC
1H-1H-COSY
HMBC
No.
δH(J,Hz)
δC
1H-1H-COSY
, 百拇医药
HMBC
1
4.52，dd(10.8,4.5)
62.04
H-2
C-2,C-3
17
22.98
4.42，dd(10.8,4.8)
18
0.85,t(6.9)
14.32
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2
5.13,m
53.00
H2-1,H-3，NH
C-1,C-1′,C-3
1′
175.27
3
4.35,m
76.86
H-2，H-4
C-1,C-2,C-4,C-5
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2′
4.63，dd(7.5,3.6)
72.50
H-3′
C-1′，C-3′，C-4′
4
4.28,m
72.93
H-3,H-5,3′
2.22，2.00,m
35.75
H-2′，H-4′
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5
1.96,m
33.86
4′
1.76,m
25.86
H-3′
7
2.20，2.05，m
33.02
(CH2)n
1.25～1.29
, 百拇医药
29～33
8
5.46,dd(15.3,5.7)
130.73
CH3
0.85,t(6.9)
14.32
9
5.54,dd(15.3,5.5)
130.85
NH
8.59，d(9.0)
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H-2
C-1′
10
2.05,m
33.34
在HMQC谱中，碳信号δ 72.50(C-2′)与质子信号δ 4.63(dd,J=7.5,3.6 Hz)相关，后者在HMBC谱中与碳信号δ 175.27，35.74，25.86有远程相关，表明酰基部分为α-OH脂肪酰链.该成分经甲醇水解所得的羟基脂肪酸甲酯经GC-MS分析，主要由4个羟基脂肪酸甲酯同系物组成,脂肪酸链长为22，23，24，25个碳原子，其比例为(3.6∶2.5∶6.7∶1).混合物的旋光度为〔α〕18D-4.0°，确定2′位为R构型〔10〕.1H-1H COSY和HMBC(见表1)显示碱基链部分为1，3，4-三羟基鞘氨醇.甲醇解所得碱基链，经乙酰化后得四乙酰化物，其质谱给出分子量为483，表明碱基链长为18碳，即为脱氢植物鞘氨醇，其〔α〕18D为+19.1°.结合该成分的1，2，3，4位质子的化学位移与合成的(2S，3S，4R)神经酰胺一致〔9〕，确定鞘氨醇部分的绝对构型为(2S，3S，4R).
, 百拇医药
长链碱基部分双键的位置和构型按下列方法确定〔11〕.长链碱的四乙酰化物的二甲基二硫化物(DMDS)的衍生物的质谱给出m/z 187 碎片峰，表明双键位于C-8，C-9位.已知长链烷烃上双键的构型可以根据双键邻位碳的化学位移来判断,即邻位CH2碳信号δ为27时，双键为Z型；δ为32时，双键为E型.此外，还可根据双键氢的偶合常数和峰形来判断.质子信号(J=10 Hz)为类三重峰的，双键为Z型；质子信号(J=15 Hz)为多重峰，双键为E型.成分(Ⅰ)的HMBC谱中，双键质子信号δ 5.46(dd,15.3，5.7 Hz),δ 5.54(dd,15.3，5.5 Hz)与碳信号δ 33.02，33.34有远程相关，所以双键为E型.故成分(Ⅰ)为(2S,3S,4R,8E)-8，9-二脱氢植物鞘氨醇(2′R)-2′-羟基脂肪酰胺，其中脂肪酸主要由二十二，二十三，二十四和二十五烷酸组成.
成分(Ⅰ)：
:3335,2918，2849，1621，1544，1468，1068，1023，722. 1H-NMR和13C-NMR(Py-d5)见表1.
, 百拇医药
2.1 (Ⅰ)的甲醇解
样品20 mg,加0.9 mol/L盐酸(在82% 甲醇中)1.5 mL，回流反应11 h，反应液用石油醚萃取，石油醚层经硅胶柱纯化〔石油醚-乙酸乙酯(9∶1)洗脱〕，得类白色固体，〔α〕18D-4.0°，(c=0.009，氯仿).GC-MS给出四个主峰(峰面积比为3.6∶2.5∶6.7∶1)，经检索为α-羟基的二十二，二十三，二十四，二十五烷酸甲酯.
2.2 碱链的乙酰化
甲醇解所得甲醇层，回收溶剂至干，经干燥后，加吡啶1 mL，醋酐1.5 mL，于70℃反应1.5 h.反应后，加蒸馏水，用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层经硅胶柱色谱分离〔石油醚-乙酸乙酯(7∶3)洗脱〕纯化得白色粉末性结晶，〔α〕18D+19.1°(c=0.0069，氯仿).EIMS m/z：483(M+).
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2.3 碱链的四乙酰化物的二甲基二硫化物(DMDS)的衍生化
样品溶于二硫化碳(0.5 mL)中，加DMDS 0.5 mL，碘2 mg,置于封管内，65℃反应40 h，加入5%硫代硫酸钠终止反应,加入石油醚，石油醚溶液的EI-MS给出碎片峰m/z:187(C11H23S).■
参考文献：
[1] Hannum YA.The sphingomylin cycle and the second messenger function of ceramide.J Bio Chem,1994,269(5):3125～3128
[2] Bruzik KS,Nyholm P-G.NMR study of the conformation of galactocerebroside in bilayers and solution:Galactose reorientation during the metastable-stable gel transition.Biochemistry,1997,36(3):566～575
, 百拇医药
[3] Hakomori S,Igarashi Y.Functional role of glycosphingolipids in cell recognition and signaling.J Biochem,1995,118(6):1091～1103
[4] Natori T,Morita M,Akimoto K,et al.Agelasphins,novel antitumor and immunostimulatory cerebrosides from the marine sponge Agelas auritiannus.Tetrahedron,1994,50(9):2771～2784
[5] Motoki K,Morita M,Kobayashi E,et al.Immunostimulatory and antitumor activities of monoglycosylcerami-des having various sugar moieties.Biol Pharm Bull,1995,18(11):1487～1491
, 百拇医药
[6] Garg HS,Sharma M,Bhakuni DS,et al.An antiviral sphingosine derivative from the green alga Ulva fasciata.Tetra Lett,1992,33(12):1641～1644
[7] Kim SY,Choi Y-H，Hah H,et al.New antihepatotoxic cerebroside from Lycium chinense fruits.J Nat Prod,1997,60(3)：274～276
[8] 华会明，孙军，李铣.柳穿鱼黄酮成分的研究.中草药，1999，30(5)：332～334
[9] Sugiyama S,Honda M,Higuchi R,et al.Stereochemistry of the four diastereomers of ceramide and ceramide lactoside.Liebigs Ann Chem,1991,(4):349～356
, 百拇医药
[10] Shibuya H,Kawashima K,Sakagami M,et al.Sphingolipids and glycerolipids.I.Chemical structures and ionophoretic activities of Soya-cerebrosides Ⅰ and Ⅱfrom Soybean.Chem Pharm Bull,1990,38(1):2933～2938
[11] Higuchi R,Inagaki M,Togawa K,et al.Isolation and structure of cerebrosides from the sea cucumber Pentacta australis.Liebigs Ann Chem,1994,(7)：653～658
收稿日期：1999-07-22, http://www.100md.com
单位：华会明(沈阳药科大学中药系，沈阳 110015)；程卯生：沈阳药科大学合成二室，沈阳 110015；李铣(沈阳药科大学中药系，沈阳 110015)
关键词：柳穿鱼;神经酰胺；植物鞘氨醇
摘 要摘 要：从柳穿鱼全草中分离到一神经酰胺成分，通过化学方法和1H-NMR，13C-NMR，1H-1H COSY，HMQC，HMBC及MS波谱分析，确定其结构为(2S，3S，4R，8E)-8，9-二脱氢植物鞘氨醇(2′R)-2′-羟基脂肪酰胺，其中脂肪酸链主要由二十二，二十三，二十四和二十五烷酸组成.
Studies on the Ceramides of Linaria vulgaris Mill.
, 百拇医药
Hua Huiming Cheng Maosheng Li Xian
(Department of Traditional Chinese Medicines,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015)
Abstract：A ceramide mixture was isolated from Linaria vulgaris Mill.and identified as (2S，3S，4R，8E)-8，9-didehydro-phytosphingosine(2′R)-2′-hydroxy fatty amides.The fatty acid residues were composed of docosanoic,tricosanoic,tetracosanoic and pentacosanoic acids with a 2-hydroxy group.
, 百拇医药
Key words：Linaria vulgaris Mill;ceramide;phytosphingosine▲
神经酰胺(ceramide)具有调节细胞生长、变异，引起细胞凋亡，调节蛋白质分泌，参与免疫过程等功能〔1〕.神经酰胺与糖结合形成的神经鞘苷(cerabroside)广泛分布于动植物体内，特别是中枢神经系统、肝、脾和血细胞中，它组成动、植物组织的细胞膜.作为膜抗原和病毒、细菌及其毒素的受体，它们在细胞识别、细胞粘合，调节细胞免疫，决定血型等方面起非常重要的作用〔2,3〕.近来，对神经酰胺和神经鞘苷的研究，引起人们广泛的重视.各国学者不断从海洋生物中分离得到该类化合物，并合成了大量的类似物，发现其具有抗肿瘤、抗病毒、抗肝毒、免疫促进等作用〔4～7〕.但有关从植物中分离这类化合物的报道很少.在对柳穿鱼Linaria vulgaris Mill.化学成分的系统研究过程中〔8〕，分离得到一神经酰胺成分(Ⅰ)，通过化学方法和1H-NMR，13C-NMR，1H-1H COSY，HMQC，HMBC及MS波谱分析，确定其结构为(2S,3S,4R,8E)-8，9-二脱氢植物鞘氨醇(2′R)-2′-羟基脂肪酰胺，其中脂肪酸链长分别为二十二，二十三，二十四和二十五碳.
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1 提取与分离
柳穿鱼干燥全草(10 kg)粉碎后，用95%的乙醇回流提取3次，浓缩后，加水调至醇浓度为70%，沉降叶绿素，滤除沉淀，回收溶剂得乙醇提取物.将总提取物加适量水，依次用石油醚、CHCl3，EtOAc和n-BuOH萃取.石油醚萃取物(67 g)进行硅胶柱色谱分离，以石油醚-丙酮不同比例的混合溶剂洗脱，(7∶3)洗脱部分的311～320份合并，进行二次硅胶柱色谱，CHCl3-Me2CO(7：3)洗脱得白色粉末(Ⅰ)72 mg.
2 鉴定与结果
成分(Ⅰ)为白色无定形粉末.IR谱显示有酰胺(1621，1544 cm-1)，羟基(3335 cm-1)及长链脂肪烷基(722 cm-1)吸收峰.1H-NMR和13C-NMR数据经HMQC和HMBC谱分析进行归属，结果见表1.δ 1.25～1.30强的质子信号及δ 0.83(t，J=6.9 Hz,6H)推测有两个脂肪烷基链；信号δ 8.59(d,J=9.0 Hz，1H,NH)和δ 175.27(CONH)，δ 5.12(m,1H)和δ 53.00(CH—NH)及连氧碳信号δ 62.04，76.86，72，93，72.50显示有酰胺键和多羟基存在，以上数据表明该成分为神经酰胺类化合物〔9〕.
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Tab.1 NMR data of constituent (Ⅰ)
No.
δH(J,Hz)
δC
1H-1H-COSY
HMBC
No.
δH(J,Hz)
δC
1H-1H-COSY
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HMBC
1
4.52，dd(10.8,4.5)
62.04
H-2
C-2,C-3
17
22.98
4.42，dd(10.8,4.8)
18
0.85,t(6.9)
14.32
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2
5.13,m
53.00
H2-1,H-3，NH
C-1,C-1′,C-3
1′
175.27
3
4.35,m
76.86
H-2，H-4
C-1,C-2,C-4,C-5
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2′
4.63，dd(7.5,3.6)
72.50
H-3′
C-1′，C-3′，C-4′
4
4.28,m
72.93
H-3,H-5,3′
2.22，2.00,m
35.75
H-2′，H-4′
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5
1.96,m
33.86
4′
1.76,m
25.86
H-3′
7
2.20，2.05，m
33.02
(CH2)n
1.25～1.29
, 百拇医药
29～33
8
5.46,dd(15.3,5.7)
130.73
CH3
0.85,t(6.9)
14.32
9
5.54,dd(15.3,5.5)
130.85
NH
8.59，d(9.0)
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H-2
C-1′
10
2.05,m
33.34
在HMQC谱中，碳信号δ 72.50(C-2′)与质子信号δ 4.63(dd,J=7.5,3.6 Hz)相关，后者在HMBC谱中与碳信号δ 175.27，35.74，25.86有远程相关，表明酰基部分为α-OH脂肪酰链.该成分经甲醇水解所得的羟基脂肪酸甲酯经GC-MS分析，主要由4个羟基脂肪酸甲酯同系物组成,脂肪酸链长为22，23，24，25个碳原子，其比例为(3.6∶2.5∶6.7∶1).混合物的旋光度为〔α〕18D-4.0°，确定2′位为R构型〔10〕.1H-1H COSY和HMBC(见表1)显示碱基链部分为1，3，4-三羟基鞘氨醇.甲醇解所得碱基链，经乙酰化后得四乙酰化物，其质谱给出分子量为483，表明碱基链长为18碳，即为脱氢植物鞘氨醇，其〔α〕18D为+19.1°.结合该成分的1，2，3，4位质子的化学位移与合成的(2S，3S，4R)神经酰胺一致〔9〕，确定鞘氨醇部分的绝对构型为(2S，3S，4R).
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长链碱基部分双键的位置和构型按下列方法确定〔11〕.长链碱的四乙酰化物的二甲基二硫化物(DMDS)的衍生物的质谱给出m/z 187 碎片峰，表明双键位于C-8，C-9位.已知长链烷烃上双键的构型可以根据双键邻位碳的化学位移来判断,即邻位CH2碳信号δ为27时，双键为Z型；δ为32时，双键为E型.此外，还可根据双键氢的偶合常数和峰形来判断.质子信号(J=10 Hz)为类三重峰的，双键为Z型；质子信号(J=15 Hz)为多重峰，双键为E型.成分(Ⅰ)的HMBC谱中，双键质子信号δ 5.46(dd,15.3，5.7 Hz),δ 5.54(dd,15.3，5.5 Hz)与碳信号δ 33.02，33.34有远程相关，所以双键为E型.故成分(Ⅰ)为(2S,3S,4R,8E)-8，9-二脱氢植物鞘氨醇(2′R)-2′-羟基脂肪酰胺，其中脂肪酸主要由二十二，二十三，二十四和二十五烷酸组成.
成分(Ⅰ)：
:3335,2918，2849，1621，1544，1468，1068，1023，722. 1H-NMR和13C-NMR(Py-d5)见表1., 百拇医药
2.1 (Ⅰ)的甲醇解
样品20 mg,加0.9 mol/L盐酸(在82% 甲醇中)1.5 mL，回流反应11 h，反应液用石油醚萃取，石油醚层经硅胶柱纯化〔石油醚-乙酸乙酯(9∶1)洗脱〕，得类白色固体，〔α〕18D-4.0°，(c=0.009，氯仿).GC-MS给出四个主峰(峰面积比为3.6∶2.5∶6.7∶1)，经检索为α-羟基的二十二，二十三，二十四，二十五烷酸甲酯.
2.2 碱链的乙酰化
甲醇解所得甲醇层，回收溶剂至干，经干燥后，加吡啶1 mL，醋酐1.5 mL，于70℃反应1.5 h.反应后，加蒸馏水，用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层经硅胶柱色谱分离〔石油醚-乙酸乙酯(7∶3)洗脱〕纯化得白色粉末性结晶，〔α〕18D+19.1°(c=0.0069，氯仿).EIMS m/z：483(M+).
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2.3 碱链的四乙酰化物的二甲基二硫化物(DMDS)的衍生化
样品溶于二硫化碳(0.5 mL)中，加DMDS 0.5 mL，碘2 mg,置于封管内，65℃反应40 h，加入5%硫代硫酸钠终止反应,加入石油醚，石油醚溶液的EI-MS给出碎片峰m/z:187(C11H23S).■
参考文献：
[1] Hannum YA.The sphingomylin cycle and the second messenger function of ceramide.J Bio Chem,1994,269(5):3125～3128
[2] Bruzik KS,Nyholm P-G.NMR study of the conformation of galactocerebroside in bilayers and solution:Galactose reorientation during the metastable-stable gel transition.Biochemistry,1997,36(3):566～575
, 百拇医药
[3] Hakomori S,Igarashi Y.Functional role of glycosphingolipids in cell recognition and signaling.J Biochem,1995,118(6):1091～1103
[4] Natori T,Morita M,Akimoto K,et al.Agelasphins,novel antitumor and immunostimulatory cerebrosides from the marine sponge Agelas auritiannus.Tetrahedron,1994,50(9):2771～2784
[5] Motoki K,Morita M,Kobayashi E,et al.Immunostimulatory and antitumor activities of monoglycosylcerami-des having various sugar moieties.Biol Pharm Bull,1995,18(11):1487～1491
, 百拇医药
[6] Garg HS,Sharma M,Bhakuni DS,et al.An antiviral sphingosine derivative from the green alga Ulva fasciata.Tetra Lett,1992,33(12):1641～1644
[7] Kim SY,Choi Y-H，Hah H,et al.New antihepatotoxic cerebroside from Lycium chinense fruits.J Nat Prod,1997,60(3)：274～276
[8] 华会明，孙军，李铣.柳穿鱼黄酮成分的研究.中草药，1999，30(5)：332～334
[9] Sugiyama S,Honda M,Higuchi R,et al.Stereochemistry of the four diastereomers of ceramide and ceramide lactoside.Liebigs Ann Chem,1991,(4):349～356
, 百拇医药
[10] Shibuya H,Kawashima K,Sakagami M,et al.Sphingolipids and glycerolipids.I.Chemical structures and ionophoretic activities of Soya-cerebrosides Ⅰ and Ⅱfrom Soybean.Chem Pharm Bull,1990,38(1):2933～2938
[11] Higuchi R,Inagaki M,Togawa K,et al.Isolation and structure of cerebrosides from the sea cucumber Pentacta australis.Liebigs Ann Chem,1994,(7)：653～658
收稿日期：1999-07-22, http://www.100md.com