多药耐药逆转剂增加去甲柔红霉素对正常造血干细胞的毒性
作者：陈智超 游泳 竹下明裕 邹萍 刘仲萍 高阪勉 大西一功 宋善俊 大野三
单位：陈智超(430022 武汉，同济医科大学血液病研究所)；游泳(430022 武汉，同济医科大学血液病研究所)；邹萍(430022 武汉，同济医科大学血液病研究所)；刘仲萍(430022 武汉，同济医科大学血液病研究所)；高阪勉(430022 武汉，同济医科大学血液病研究所)；宋善俊(430022 武汉，同济医科大学血液病研究所)；竹下明裕(日本滨松医科大学第三内科)；大西一功(日本滨松医科大学第三内科)；大野三(日本滨松医科大学第三内科)
关键词：多药耐药逆转剂；去甲柔红霉素；粒细胞-巨噬细胞集落形成单位
临床内科杂志000110 大野
三
, 百拇医药 摘 要：目的：探讨多药耐药逆转剂是否增加化疗药物对正常造血干细胞的毒性。方法：采用甲基纤维素半固体培养方法,培养正常人粒细胞-巨噬细胞克隆形成单位(CFU-GM)。测定去甲柔红霉素对CFU-GM的抑制率。将多药耐药逆转剂MS-209及去甲柔红霉素与骨髓细胞共同短期作用后,了解去甲柔红霉素对CFU-GM抑制率的变化。结果：去甲柔红霉素对CFU-GM的平均抑制率为29.6%,在MS-209作用下,其抑制率增加为43.4%,有显著性差异(P<0.05)。结论：多药耐药逆转剂MS-209增加了化疗药物对造血干细胞的毒性。提示该类药物在临床应用中可能对造血系统具有一定副作用。
分类号：R730.53 文献标识码：A
文章编号：1001-9057(2000)01-0027-02
Multidrug resistance modifier MS-209 increase the cytotoxicity of idarubicin to normal hemapoietic precursor cells
, http://www.100md.com
CHEN Zhichao,YOU Yong,Tekeshita Akihiro,et al.
(Institute of Hematology,Union Hospital,Tongji Medical University,Wuhan,430022，China)
Abstract：Objective：To explore the effect of multidrug resistance(MDR)modifier on the cytotoxicity of idarubicin to normal hematoietic precursor cells.Methods：Detecting the inhibiting rate of granulocyto-macrophage colony-forming unit(CFU-GM)by idarubicin with and without new MDR modifier MS-209.Results：The average inhibiting rate of idarubicin to CFU-GM was 29.6%,and received to 43.4% when co-incubated with MS-209.Conclusion：New MDR modifier MS-209 increased the cytotoxicity of chemotherapy drug idarubicin to normal hemapoietic precursor cells.when such new MDR modifiers were used to reversing the MDR of tumor cells with chemotherapy drugs,the side effects to normal cells might be given more attention.
, http://www.100md.com
Key words：MDR；modifier；Idarubicin；CFU-GM
与普通用于肿瘤细胞多药耐药(MDR)逆转的药物不同,新型多药耐药逆转剂的主要药理作用即是拮抗肿瘤细胞膜上的P-糖蛋白(P-gp)。既往研究证实,造血干细胞上亦有P-gp的表达,而且我们曾采用流式细胞技术研究发现,MDR逆转剂可以干扰正常骨髓CD34阳性细胞对化学染料罗丹明(Rhodamin 123)的排出,导致其在细胞内的过量潴留[1]。但是这种作用是否直接能够导致化疗药物对造血干细胞的损害尚不明了。本研究即是要探讨新型MDR逆转剂MS-209是否增加去甲柔红霉素对造血干细胞的毒性作用。
对象与方法
一、研究对象:健康志愿献髓员6例,年龄27岁～38岁,男性5例,女性1例。髂前上棘抽取骨髓2～3 ml,肝素抗凝。
, 百拇医药 二、细胞分离:用PBS将骨髓稀释2～3倍,置于Ficoll-Hypaque分离液上(密度1.077 g/ml,Pharmacia,Uppsala,Sweden),1500 r/min,离心后取出单个核细胞层(MNC),在37℃下溶血10 min(溶血液:0.826% NH4CL,0.1% KHCO3,0.0037% EDTA-Na2,pH 7.3),用含2% FCS(Gibco BRL,Grand Island,NY)的PBS洗涤2遍后,悬浮于含20% FCS的IMDM(Sigma)培养液中用于细胞培养。
三、粒-巨噬细胞集落(CFU-GM)培养:将细胞调制成1×106/ml,在MS-209(由东京大学医学科学研究所鹤尾隆教授惠赠,使用浓度为10 μm)存在以及非存在下,与去甲柔红霉素(Pharmacia产品,终浓度为0.007 mg/L)在室温下孵育2小时。用含2% FCS的IMDM培养液洗涤2遍,重新悬浮含有20%FCS的IMDM培养液中。以5×104/ml细胞浓度置入甲基纤维素半固体培养基体系(Methcult 4533,Stem Cell Company,Canada)。体系内含0.9%的甲基纤维素(Sigma),50 ng/ml重组人干细胞生长因子,10 ng/ml重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子,10 ng/ml重组人白细胞介素-3。充分震荡混匀后置入96孔培养板,37℃,5%CO2,孵育7天,在倒置显微镜下进行克隆鉴定及计数,每组计数3孔,取其平均值。去甲柔红霉素对GM-CFU的抑制率按下列公式计算:
, 百拇医药
结 果
MS-209单独作用时CFU-GM生长数为(80.6±19.1)%,与对照组(PBS)(88.9±18.5)%相比,无显著性差异(P>0.05)。去甲柔红霉素对CFU-GM的平均抑制率为(29.6±12.3)%,与MS-209共同作用后,其抑制率增加为(43.4±9.5)%,经统计学处理，具有显著性差异(P<0.05)。
讨 论
MDR现象是恶性肿瘤化疗中尚待解决的问题。肿瘤细胞一旦获得MDR,即对多种作用机制不同的抗癌药物同时产生耐药性从而导致治疗的失败。肿瘤细胞MDR的产生与其细胞上多药耐药蛋白(P-gp)的表达有关。P-gp能不断地将进入癌细胞内的抗癌药物泵出细胞外,使细胞内抗癌药物浓度降低而影响对细胞的杀伤[2]。1981年Tsuruo等发现异博定具有逆转肿瘤细胞MDR的作用[3],以后发现许多钙拮抗剂及环胞菌素亦具有类似作用,上述药物作为MDR逆转剂应用于临床时,其原来的药理作用成为其副作用。故近年来,主要药理作用为阻断细胞膜P-gp功能的MDR逆转剂正在被开发。MS-209为新发现的奎宁类化合物(化学结构式见文献[1]),体外试验显示其具有较强的MDR逆转作用,目前在日本及欧洲等地进行临床试验[4]。但是,P-gp本身是一种具有多种生理功能的糖蛋白,并不仅仅存在于肿瘤细胞,而是广泛地存在于肝、肾等正常脏器组织细胞[5]。我们最近报道,造血干细胞膜上也有P-gp的表达,而MS-209可以阻断P-gp的功能导致造血干细胞对化学染料Rhodamin 123的过量摄取。因此,MDR逆转剂在逆转肿瘤细胞MDR的同时,可能亦会干扰正常造血干细胞上P-gp的功能,导致化疗药物对造血干细胞毒性的增加。
, http://www.100md.com
我们采用具有代表性的蒽环类抗肿瘤药物去甲柔红霉素与具有较强P-gp拮抗作用的MS-209来研究其对正常造血干细胞的协同作用。结果证实,MS-209与造血细胞短期作用后,增加了去甲柔红霉素对CFU-GM的抑制率。其机理可能是MS-209阻滞了造血干细胞膜上P-gp的泵出功能,增加了细胞内去甲柔红霉素的浓度,从而抑制了CFU-GM的生长。这种作用将导致MS-209在临床应用中对造血细胞的损害,应引起临床医生的注意。这种作用是否具有广泛性尚待继续研究,但本结果提示,新型多药耐药逆转剂的研制与应用应充分考虑到对正常造血细胞的影响,才能最大限度地发挥其逆转肿瘤细胞多药耐药的作用。
作者单位：大野三(日本滨松医科大学第三内科)
参考文献：
[1] 陈智超,竹下明裕,邹萍,等.造血干细胞多药耐药P-糖蛋白的表达及多药耐药逆转剂对其功能的影响.临床血液学杂志,1999,12(5)∶197-199.
, 百拇医药
[2] Tsuruo,T.Mechanisms of multidrug resistance and implications for therapy.Jpn J Cancer Res,1988,79(3)∶285-296.
[3] Tsuruo T,lida H,Tsukagoshi S,et al.Overcoming of vincristine resistance in P388 leukemia in vivo and vitro through enhanced cytotoxicity of vincristine and vinblastine by verapamil.Cancer Res,1981,41(5)∶1967-1972.
[4] 冢本文英,芝英一.多剂耐性克服剂MS-209の效果.医学のあもみ,1998，184(5)∶305-307.
[5] Thiebaut F,Tsuruo T,Hamada H,et al.Cellular localization of the multidrug-resistance gene product P-glycoprotein in normal human tissues.Proc Natl Acad Sci USA,1987,84(21)∶7735-7738.
收稿日期：1999-09-20, 百拇医药
单位：陈智超(430022 武汉，同济医科大学血液病研究所)；游泳(430022 武汉，同济医科大学血液病研究所)；邹萍(430022 武汉，同济医科大学血液病研究所)；刘仲萍(430022 武汉，同济医科大学血液病研究所)；高阪勉(430022 武汉，同济医科大学血液病研究所)；宋善俊(430022 武汉，同济医科大学血液病研究所)；竹下明裕(日本滨松医科大学第三内科)；大西一功(日本滨松医科大学第三内科)；大野三(日本滨松医科大学第三内科)
关键词：多药耐药逆转剂；去甲柔红霉素；粒细胞-巨噬细胞集落形成单位
临床内科杂志000110 大野
三, 百拇医药 摘 要：目的：探讨多药耐药逆转剂是否增加化疗药物对正常造血干细胞的毒性。方法：采用甲基纤维素半固体培养方法,培养正常人粒细胞-巨噬细胞克隆形成单位(CFU-GM)。测定去甲柔红霉素对CFU-GM的抑制率。将多药耐药逆转剂MS-209及去甲柔红霉素与骨髓细胞共同短期作用后,了解去甲柔红霉素对CFU-GM抑制率的变化。结果：去甲柔红霉素对CFU-GM的平均抑制率为29.6%,在MS-209作用下,其抑制率增加为43.4%,有显著性差异(P<0.05)。结论：多药耐药逆转剂MS-209增加了化疗药物对造血干细胞的毒性。提示该类药物在临床应用中可能对造血系统具有一定副作用。
分类号：R730.53 文献标识码：A
文章编号：1001-9057(2000)01-0027-02
Multidrug resistance modifier MS-209 increase the cytotoxicity of idarubicin to normal hemapoietic precursor cells
, http://www.100md.com
CHEN Zhichao,YOU Yong,Tekeshita Akihiro,et al.
(Institute of Hematology,Union Hospital,Tongji Medical University,Wuhan,430022，China)
Abstract：Objective：To explore the effect of multidrug resistance(MDR)modifier on the cytotoxicity of idarubicin to normal hematoietic precursor cells.Methods：Detecting the inhibiting rate of granulocyto-macrophage colony-forming unit(CFU-GM)by idarubicin with and without new MDR modifier MS-209.Results：The average inhibiting rate of idarubicin to CFU-GM was 29.6%,and received to 43.4% when co-incubated with MS-209.Conclusion：New MDR modifier MS-209 increased the cytotoxicity of chemotherapy drug idarubicin to normal hemapoietic precursor cells.when such new MDR modifiers were used to reversing the MDR of tumor cells with chemotherapy drugs,the side effects to normal cells might be given more attention.
, http://www.100md.com
Key words：MDR；modifier；Idarubicin；CFU-GM
与普通用于肿瘤细胞多药耐药(MDR)逆转的药物不同,新型多药耐药逆转剂的主要药理作用即是拮抗肿瘤细胞膜上的P-糖蛋白(P-gp)。既往研究证实,造血干细胞上亦有P-gp的表达,而且我们曾采用流式细胞技术研究发现,MDR逆转剂可以干扰正常骨髓CD34阳性细胞对化学染料罗丹明(Rhodamin 123)的排出,导致其在细胞内的过量潴留[1]。但是这种作用是否直接能够导致化疗药物对造血干细胞的损害尚不明了。本研究即是要探讨新型MDR逆转剂MS-209是否增加去甲柔红霉素对造血干细胞的毒性作用。
对象与方法
一、研究对象:健康志愿献髓员6例,年龄27岁～38岁,男性5例,女性1例。髂前上棘抽取骨髓2～3 ml,肝素抗凝。
, 百拇医药 二、细胞分离:用PBS将骨髓稀释2～3倍,置于Ficoll-Hypaque分离液上(密度1.077 g/ml,Pharmacia,Uppsala,Sweden),1500 r/min,离心后取出单个核细胞层(MNC),在37℃下溶血10 min(溶血液:0.826% NH4CL,0.1% KHCO3,0.0037% EDTA-Na2,pH 7.3),用含2% FCS(Gibco BRL,Grand Island,NY)的PBS洗涤2遍后,悬浮于含20% FCS的IMDM(Sigma)培养液中用于细胞培养。
三、粒-巨噬细胞集落(CFU-GM)培养:将细胞调制成1×106/ml,在MS-209(由东京大学医学科学研究所鹤尾隆教授惠赠,使用浓度为10 μm)存在以及非存在下,与去甲柔红霉素(Pharmacia产品,终浓度为0.007 mg/L)在室温下孵育2小时。用含2% FCS的IMDM培养液洗涤2遍,重新悬浮含有20%FCS的IMDM培养液中。以5×104/ml细胞浓度置入甲基纤维素半固体培养基体系(Methcult 4533,Stem Cell Company,Canada)。体系内含0.9%的甲基纤维素(Sigma),50 ng/ml重组人干细胞生长因子,10 ng/ml重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子,10 ng/ml重组人白细胞介素-3。充分震荡混匀后置入96孔培养板,37℃,5%CO2,孵育7天,在倒置显微镜下进行克隆鉴定及计数,每组计数3孔,取其平均值。去甲柔红霉素对GM-CFU的抑制率按下列公式计算:
, 百拇医药
结 果
MS-209单独作用时CFU-GM生长数为(80.6±19.1)%,与对照组(PBS)(88.9±18.5)%相比,无显著性差异(P>0.05)。去甲柔红霉素对CFU-GM的平均抑制率为(29.6±12.3)%,与MS-209共同作用后,其抑制率增加为(43.4±9.5)%,经统计学处理，具有显著性差异(P<0.05)。
讨 论
MDR现象是恶性肿瘤化疗中尚待解决的问题。肿瘤细胞一旦获得MDR,即对多种作用机制不同的抗癌药物同时产生耐药性从而导致治疗的失败。肿瘤细胞MDR的产生与其细胞上多药耐药蛋白(P-gp)的表达有关。P-gp能不断地将进入癌细胞内的抗癌药物泵出细胞外,使细胞内抗癌药物浓度降低而影响对细胞的杀伤[2]。1981年Tsuruo等发现异博定具有逆转肿瘤细胞MDR的作用[3],以后发现许多钙拮抗剂及环胞菌素亦具有类似作用,上述药物作为MDR逆转剂应用于临床时,其原来的药理作用成为其副作用。故近年来,主要药理作用为阻断细胞膜P-gp功能的MDR逆转剂正在被开发。MS-209为新发现的奎宁类化合物(化学结构式见文献[1]),体外试验显示其具有较强的MDR逆转作用,目前在日本及欧洲等地进行临床试验[4]。但是,P-gp本身是一种具有多种生理功能的糖蛋白,并不仅仅存在于肿瘤细胞,而是广泛地存在于肝、肾等正常脏器组织细胞[5]。我们最近报道,造血干细胞膜上也有P-gp的表达,而MS-209可以阻断P-gp的功能导致造血干细胞对化学染料Rhodamin 123的过量摄取。因此,MDR逆转剂在逆转肿瘤细胞MDR的同时,可能亦会干扰正常造血干细胞上P-gp的功能,导致化疗药物对造血干细胞毒性的增加。
, http://www.100md.com
我们采用具有代表性的蒽环类抗肿瘤药物去甲柔红霉素与具有较强P-gp拮抗作用的MS-209来研究其对正常造血干细胞的协同作用。结果证实,MS-209与造血细胞短期作用后,增加了去甲柔红霉素对CFU-GM的抑制率。其机理可能是MS-209阻滞了造血干细胞膜上P-gp的泵出功能,增加了细胞内去甲柔红霉素的浓度,从而抑制了CFU-GM的生长。这种作用将导致MS-209在临床应用中对造血细胞的损害,应引起临床医生的注意。这种作用是否具有广泛性尚待继续研究,但本结果提示,新型多药耐药逆转剂的研制与应用应充分考虑到对正常造血细胞的影响,才能最大限度地发挥其逆转肿瘤细胞多药耐药的作用。
作者单位：大野
三(日本滨松医科大学第三内科)参考文献：
[1] 陈智超,竹下明裕,邹萍,等.造血干细胞多药耐药P-糖蛋白的表达及多药耐药逆转剂对其功能的影响.临床血液学杂志,1999,12(5)∶197-199.
, 百拇医药
[2] Tsuruo,T.Mechanisms of multidrug resistance and implications for therapy.Jpn J Cancer Res,1988,79(3)∶285-296.
[3] Tsuruo T,lida H,Tsukagoshi S,et al.Overcoming of vincristine resistance in P388 leukemia in vivo and vitro through enhanced cytotoxicity of vincristine and vinblastine by verapamil.Cancer Res,1981,41(5)∶1967-1972.
[4] 冢本文英,芝英一.多剂耐性克服剂MS-209の效果.医学のあもみ,1998，184(5)∶305-307.
[5] Thiebaut F,Tsuruo T,Hamada H,et al.Cellular localization of the multidrug-resistance gene product P-glycoprotein in normal human tissues.Proc Natl Acad Sci USA,1987,84(21)∶7735-7738.
收稿日期：1999-09-20, 百拇医药